Протокол инсультной единицы мыши со стандартизированной неврологической оценкой для трансляционных исследований инсульта у мышей

В этой статье представлен протокол для реализации высокотрансляционной и независимо доказанной концепции Stroke Unit (mSU) мыши с большим ходом. Он также предоставляет стандартизированный протокол для выполнения фокальной экспериментальной шкалы инсульта у мышей, которая оценивает дефицит фокального инсульта, обнаруженный даже в долгосрочной перспективе.

Филаментная модель окклюзии средней артерии (fMCAo) является, пожалуй, наиболее трансляционной моделью инсульта мыши, позволяющей проводить контролируемую ишемию с внутрисосудистой реперфузией/реканализацией. Тем не менее, он не согласуется с текущими клиническими достижениями в области лечения инсульта (например, инсультными отделениями), обычно использует субъективную или расплывчатую неврологическую оценку в лабораториях и демонстрирует высокую смертность в острой фазе. В этой статье мы устраняем эти ограничения с помощью проверенных протоколов с видеогидом. Мы представляем протокол Mouse Stroke Unit (mSU) с обучающими видеороликами и алгоритмом принятия решений (Risk Stratification Score), преодолевая разрыв между клиническим моделированием и моделированием инсульта у мыши. Для повышения точности и чувствительности нейрологической шкалы инсульта мы впервые представляем видеостандартизированный формат фокальной экспериментальной шкалы инсульта (fESS) и доказываем ее значение до 6 месяцев после инсульта. Кроме того, представлены протоколы теста Ladder-rung у мышей, а также известного теста Cylinder для объективной, количественной оценки двигательной функции конечностей. Результаты подчеркивают трансляционную эффективность mSU. Фокальная ЭСС (fESS) превосходит другие известные шкалы в выявлении дефицита фокального инсульта, восстановлении и поддержании чувствительности в течение 6 месяцев после инсульта. Тесты с лестницей и цилиндрами объективно количественно оценивают и контролируют двигательные дефициты передних и задних конечностей в долгосрочной перспективе. Таким образом, интеграция mSU, fESS и тестов моторных функций обеспечивает надежную основу для клинически значимых исследований инсульта. Наши протоколы повышают трансляционную ценность в исследованиях инсульта мыши.

Обширный ишемический инсульт является одной из основных причин заболеваемости и инвалидности во всем мире¹. Тем не менее, исследования инсульта у мышей сталкиваются с трансляционной блокировкой почти во всех доклинически протестированных методах лечения до сих пор². Многочисленные причины этой проблемы и усилия по ее преодолению были подробно рассмотрены в предыдущей публикации². Эти проблемы возникают из-за ограниченной интеграции клинических достижений в соответствующие модели на животных² и слабости поведенческих и неврологических систем оценки в точном и чувствительном выявлении постинсультного дефицита².

Недавние открытия³ подтверждают, что филаментная модель окклюзии средней артерии (fMCAo) у мышей имеет значительные трансляционные преимущества по сравнению с другими моделями с открытым повреждением черепа и травмой ^2,4. Кроме того, это единственный документ, который моделирует реперфузию и механическую тромбэктомию в условиях клинического инсульта ^5,6,7. Тем не менее, модель сталкивается с высокой подострой смертностью между 3-7 днями после инсульта, что не позволяет проводить долгосрочные исследования больших инсультов и до недавнего времени считалось неотъемлемым и непреодолимым артефактом модели. Кроме того, выявление постинсультного неврологического дефицита у мышей относительно затруднительно и необъективно из-за их небольшого размера, особенно среди неклиницистов или неопытных исследователей ^8,9. Чтобы решить эту проблему, разные группы разработали различные шкалы для выявления дефицита. Наиболее часто используемые и известные шкалы включают 3-балльную шкалу Бедерсона (BS)¹⁰, 5-балльную модифицированную шкалу Бедерсона (mBS)¹¹, 5-балльную шкалу Лонга (LS) (аналогичную mBS)⁶, модифицированную шкалу неврологического инсульта (mNSS)^12,13, 18-балльную шкалу Гарсии (GS)⁹ и более детальную шкалу ДеСимони¹⁴ или иначе известную как «Нейрооценка» (NS)^{9. Масштаб 15}. К сожалению, некоторые из этих шкал либо слишком грубы и ограничены лишь несколькими днями острой фазы после инсульта (BS, mBS и LS)^8,9, либо их интерпретация размыта общими дефицитами (NS).

Исходя из этого, мы ранее разработали и проверили протокол поддержки Stroke Unit (mSU) у мышей, а также экспериментальную шкалу инсульта (ESS) для мышей¹³. Обоснование mSU заключалось в том, чтобы адаптировать знания из клинической рутины (т.е. инсультных отделений человека) в доклинические исследования инсульта, в то время как ESS критически консолидировала ранее существовавшие, но «нечувствительные» или избыточные шкалы инсульта в практическую, уточненную, чувствительную и экономящую время. mSU состоит из частого и адаптированного мониторинга основных клинических параметров мышей с адаптированным применением поддержки животных для повышения выживаемости¹³.

Действительно, данные нашей лаборатории и других лабораторий подтверждают ценность обоих методов. mSU транслирует клинические базовые поддерживающие меры и продвигает^{7 от человека} к мышам, значительно снижает смертность fMCAo у мышей с 60-70% до 10-15%¹³, что позволяет проводить исследования более крупных инсультов, и с тех пор может эффективно применяться в независимых лабораториях 16,17,18,19. Кроме того, ESS может различать очаговые (фокальный компонент ESS, fESS) и общие (общий компонент ESS, gESS) постинсультные дефициты и симптомы, моделирует клиническую оценку человека (дифференциация между фокальными и общими признаками и симптомами у людей), линейно связан с размером инсультного поражения и в долгосрочной перспективе чувствителен к дефицитам^13,20. Тем не менее, несмотря на доказанную ценность и эффективность как mSU, так и ESS, отсутствие четких, визуализированных, стандартизированных инструкций даже для неопытных исследователей оставляет несколько открытых вопросов о применении mSU и значительную субъективность в оценке дефицита фокуса на fESS.

Таким образом, наша настоящая статья направлена на предоставление четких инструкций по протоколам mSU и fESS с помощью видео. Мы твердо верим, что это поможет исследователям инсульта повысить трансляционную эффективность их исследований инсульта, значительно сократить потери животных в течение первых 3-10 дней после инсульта, снизить затраты на эксперименты и, в конечном итоге, воспроизвести оценку неврологических дефицитов в течение нескольких месяцев после инсульта^. Кроме того, дополнительная комбинация теста Лестницы и Цилиндрического теста может легко количественно оценить парез фокальных конечностей (передних и задних конечностей) из-за fMCAo.

Чтобы продемонстрировать эффективность mSU и fESS, мы предоставляем среднесрочные (14 дней) и долгосрочные (6 месяцев) данные о мышах после fMCAo. Двенадцатинедельных самцов мышей C57Bl/6J (n= 31) использовали и содержали при контролируемой температуре (22 ± 2 °C) с 12-часовым периодом цикла «свет-темнота» и доступом к гранулированной пище и воде в неограниченном количестве. Мыши были разделены на две когорты, за которыми наблюдали в течение 14 дней (n=10, когорта 1) и 6 месяцев (n=15, когорта 2) соответственно. Эти мыши были подвергнуты 60-минутной ишемии головного мозга с использованием хорошо описанной модели fMCAo 13,20,21 под анестезией изофлурана. В качестве контроля применялись фиктивно оперированные животные (n=6, оперировались как две вышеуказанные когорты, но ишемия не индуцировалась), за которыми наблюдали в течение 6 месяцев. Бупренорфин применяли в качестве пред- и 3-дневного послеоперационного анальгетика. Тесты с лестницей и цилиндрами также проводились для 6-месячной когорты в рамках неврологической шкалы.

В течение первых 14 дней после отравления все животные ежедневно проверялись на гуманные конечные точки, определяемые как: 1) тяжелая гипотермия (<33 °C) и/или неподвижность (например, 4 балла по тесту 6 fESS или тест на «спонтанную активность» gESS), которые не были улучшены при лечении «мышиной инсультной единицей» (т.е. пассивное нагревание и активное кормление, см. 1.4). 1.6, 1.8) в течение одного часа, 2) признаки болевого или тревожного поведения (например, оценка >2 балла в тесте gESS «тревожность/автоматическое поведение»), даже после послеоперационной анальгезии в соответствии с протоколом.

В этом протоколе постинсультное сопровождение мышей в виде mSU начинается сразу после восстановления мышей после операции fMCAo. Она состоит из 3 фаз: фаза А (0-48 ч после реперфузии), фаза В (>48 ч и до «окончания необходимой активной поддержки», обычно на 10-14 день, в зависимости от фазы В у конкретного животного) и фаза С (14 день и далее). Она включает пять значимых вмешательств (посещения/оценка стратификации риска, кормление, жидкостное питание, температура и местная дезинфекция; см. 1.1 - 1.8. ниже), адаптированных к каждому животному, в соответствии с каждой фазой (А, В или С) и его ежедневным фактическим клиническим состоянием, оцениваемым по шкале стратификации риска (RSS), см. дополнительный рисунок 1 и таблицу 1 с тремя типичными примерами. Необходимые материалы и инструменты для mSU показаны на рисунке 1a и описаны в таблице материалов. Мы также предоставляем шаблон для мониторинга животных во время mSU (см. Дополнительный файл 1).

Эксперименты, описанные в этой статье, были проведены в соответствии с национальными и европейскими рекомендациями по использованию экспериментальных животных и были одобрены греческими правительственными комитетами (Афины, лицензия No "843895_06-09-2022").

1. «Блок хода мыши» (mSU)

1. Ежедневно оценивать клиническое состояние животного («посещения») и рассчитывать его показатель RSS
   1. Распечатайте дополнительный файл 1, желательно перед операцией на животном, для записи данных и мониторинга.
   2. Клинически оценивайте каждое животное в стандартные временные точки (посещения): рано утром (около 08:00), в полдень (с 14:00 до 16:00) и поздно ночью (около 22:00 - 23:00).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптируйте эти стандартные посещения в соответствии с фазой последующего наблюдения за животным: проверяйте состояние животного 2 раза в день (утро-ночь) для фазы А, 3 раза в день для фазы В и один раз в день для фазы С. Дополнительно адаптируйте частоту посещений в соответствии с оценкой RSS (см. 1.1.6). Для снижения нагрузки желательно работать в команде от >2 человек. Утренние и ночные визиты имеют решающее значение для успешной поддержки, мониторинга и снижения смертности, потому что ночная (активная) фаза мышей увеличивает метаболические и энергетические потребности 13,22,23 и связана с увеличением ночной постинсультной смертности.
   3. Взвесьте мышь с помощью чувствительных стандартных весов во время утреннего визита.
   4. Измерьте температуру с помощью бесконтактного термометра, помещенного над его брюшным центром тела во время утреннего визита. Удерживайте и обездвиживайте мышь тыльной стороной. Снимите показания в течение первых нескольких секунд после иммобилизации (см. рисунок 1f).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте ректальный термометр из-за возможного разрыва кишечника после повторных измерений с сопутствующим перитонитом.
   5. Оценивайте и записывайте общее клиническое состояние мыши (подвижность, раны, шапочка мочеиспускательного канала, реактивность, шерсть, состояние гидратации и т. д.) во время утреннего визита для всех фаз, ежедневно до 14-го дня.
   6. Рассчитайте балл RSS во время утреннего визита, суммировав баллы в соответствии с весом, температурой и баллом fESS животного, как описано на дополнительном рисунке 1. Для автоматического вычисления RSS в таблице электронной таблицы используйте и адаптируйте формулу, приведенную в таблице 1. Усыпьте животное методом, одобренным учреждением, если присутствуют гуманные конечные точки (см. выше).
   7. Регулируйте как частоту посещений, так и интенсивность поддержки, ежедневно в соответствии с оценкой RSS и фазой животного после инсульта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза В является наиболее критичной для смертности. Увеличьте частоту посещений и интенсивность поддержки RSS ≥3 (определение и инструкции см. в таблице 1). Если животное продолжает проявлять RSS >3 в фазе С, посетите его и поддержите его так же, как и в фазе В. Используйте RSS и общие описания (например, выздоравливающий, стабильный, больной низким/средним уровнем и критически больной), чтобы описать его клиническое состояние среди группы поддержки. После 14-го дня сократите количество посещений животных до тех случаев, когда это требуется в соответствии с протоколом эксперимента (например, для поведенческой/неврологической оценки).
2. Приготовление гелевого корма для нутритивной поддержки
   1. Измельчите обычные пищевые гранулы с помощью блендера (рис. 1a).
   2. Добавляйте коммерческий сахар в количестве 5-10% для повышения калорийности пищи.
   3. Добавьте воду, чтобы создать гелеобразную жидкую текстуру (Рисунок 1b).
   4. Используйте этот гелевый корм как для пассивной, так и для активной питательной поддержки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию используйте готовый к использованию коммерческий гелевый корм. Готовая пища может пролежать в холодильнике 2-3 дня.
3. Пассивная нутритивная поддержка мышей
   1. Наполните чашку Петри гелевым кормом и поставьте ее на пол клетки (пассивная питательная поддержка путем предоставления гелевого корма для легкого доступа мыши). Оставьте 2-3 гранулы еды рядом с чашкой Петри.
   2. Ежедневно освежайте чашку Петри гелевым кормом. В течение первых нескольких дней мыши могут заполнять или накрывать чашку Петри клеточной подстилкой. Некоторые начнут есть из него (Рисунок 1в).
4. Активная нутритивная поддержка (активное кормление)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Активное кормление происходит во время фазы В. Стандартная частота кормления составляет 3 раза в день и адаптируется к большему количеству раз в соответствии с оценкой RSS (например, даже 4-5 раз в день). Иногда для мышей, которые постоянно имеют показатель RSS 0-1 (т.е. небольшой инсульт) и активно едят самостоятельно, снижают частоту до 1-2 в день.
   1. Предварительно наполните шприцы объемом 1 мл гелем для еды.
   2. Держите мышь мягко, но крепко от шерсти на шее, как показано на рисунке 1d (красный стрелка).
   3. Стабилизируйте щеку мыши средним пальцем, как показано красными стрелками на рисунке 1d: крепко удерживая мышь, проведите пальцем в сторону к носу мыши к ее щеке. Удерживайте позицию.
   4. Поместите кончик шприца в рот мыши между зубами и направьте кончик к внутренней стороне щеки (красная стрелка, рисунок 1e).
   5. Давайте примерно 40-50 μL гелевой пищи каждый раз (полный рот).
   6. Аккуратно верните мышь на решетку клетки. Дайте время на жевание.
   7. Повторите кормление через 1-2 минуты, пока каждая мышь не съест 1-1,5 мл гелевого корма.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кормить 5-10 мышей за один выгон (1-2 клетки); Другие едят и глотают гелевую пищу, пока каждая мышь получает полный рот. Этот процесс не вызывает стресса у мышей. Также было замечено, что некоторые животные в конечном итоге принимают положение для хватания и кормления.
5. Добавки с обычным солевым раствором
   1. Взвесьте мышь во время утреннего визита (см. 1.1.2 и 1.1.3).
   2. Рассчитайте его потерю/прибавку в весе по сравнению с предыдущим измерением, вычитая значения.
   3. Дополните его дефицит веса (в граммах) мл нормального физиологического раствора (подкожно).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перегрузки жидкостью и отеков любой ценой. Не превышайте 1-2 мл на дозу и 3-4 мл жидкости в день. Начинают через 36 ч после fMCAo.
6. Добавки глюкозы
   1. Проверьте рассчитанную оценку RSS мыши и ее общее движение.
   2. Введите 0,5 - 1 мл 5% глюкозы подкожно, если RSS >3 и у мыши наблюдаются сопутствующие признаки гипотермии (<34°C) или иммобилизации/брадикинезии. Колоть желательно только во время ночного визита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте гипергликемии после инсульта любой ценой. Постинсультная гипергликемия токсична⁷. Таким образом, добавляйте глюкозу только после активного кормления и в случаях тяжелого клинического состояния или для предотвращения гипогликемии во время ночной активности. Активное кормление (см. 1.4) должно быть основным показателем поддержки, так как оно обеспечивает более плавную и длительную энергетическую поддержку и соответствует клиническим ^{рекомендациям}. Не принимайте добавки глюкозы до 3-го дня.
7. Управление температурой (пассивное)
   1. Измеряйте температуру поверхности тела животного до операции на исходном уровне и после операции при каждом посещении (Рисунок 1a). Измерьте так, как показано на рисунке 1f и описано в разделе 1.1.4. Запишите значения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гипотермия у мышей определяется как температура тела <35 °C ^24,25. Предыдущие данные¹³ указывают на то, что любая температура ниже 34 °C является предупреждающим знаком для поддержки после инсульта (см. ниже).
   2. При гипотермии от 33 до 34 °C пассивно согрейте мышь в клетке на нагревательной пластине (или любом другом пассивном согревающем устройстве) до тех пор, пока она не достигнет температуры тела >34 °C. Активно кормите мышь, чтобы обеспечить ее энергией для активного производства тепла животным (более длительный запас энергии).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите животное на пассивном обогреве от 1 до нескольких часов. Избегайте пассивной гипертермии любой ценой.
   3. При гипотермии при температуре <33 °C увеличьте поддержку с помощью дополнительного подкожного введения глюкозы (быстрое, но кратковременное поступление энергии; см. 1.6 выше).
8. Чистка гениталий и/или раны на шее (местная «дезинфекция»)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда может наблюдаться расхождение раны или пробка уретры. Расхождение раны встречается редко. Пробка из уретры представляет собой твердую пробку на кончике гениталий мыши (Рисунок 1g) и наблюдается более часто, особенно у животных с более высокой тяжестью инсульта. Когда пробка блокирует мочеиспускательный канал, может возникнуть обструктивный синдром мочевыводящих путей, который может привести к заболеваемости и смерти²⁶. Поэтому его следует хорошо очистить.
   1. Пропитайте уретральную пробку, если таковая имеется, обычным физиологическим раствором, чтобы облегчить ее удаление.
   2. Аккуратно удаляйте уретральную пробку с помощью небольшого тампона или простого пинцета при каждом осмотре/посещении животного. Продезинфицируйте мочеиспускательный канал с помощью манометра или тампона, смоченного антисептическим раствором.
   3. Если присутствует расхождение раны, продезинфицируйте его локально любым распространенным хирургическим антисептическим раствором (например, Октанисептом) и регулярно зашивайте рану, используя предпочтительно шелковый шов 5/0.

2. Фокусный компонент экспериментальной шкалы инсульта (fESS)

1. Подготовка тестового поля
   1. Очистите стенд 70% спиртом, чтобы удалить внешние раздражители (оптические или запахи) и подготовьте материалы для тестирования, как показано на рисунке 2а.
   2. Распечатайте оценочный лист ESS, предоставленный в качестве дополнительного файла 2 , и выполняйте тесты один за другим.
2. Парез передних конечностей (Тест 1)
   1. Поднимите и осторожно держите мышь у основания хвоста.
   2. Проверьте и оцените визуально симметричное разгибание вперед и симметричную подвижность передних конечностей при движении мыши (рис. 2c).
   3. Оценка в зависимости от визуальных данных следующая: 0 за нормальное, симметричное разгибание и движение передних конечностей; 1 для «легкой асимметрии», определяемой как легкое сгибание и/или уменьшение подвижности контрапораженной конечности или ригидность конечности; 2 для «выраженного сгибания» контрацепционной конечности; 3 для прилегания контралучной конечности к туловищу; 4 балла за отсутствие движений тела или конечностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест выявляет парез контралезионной передней конечности. Он также входит в состав шкал BS, LS, mNSS и NS. Оценку 1 может быть сложно определить из-за маневров убегания животного.
3. Парез задних конечностей (Тест 2)
   1. Продолжайте удерживать мышь за основание хвоста, как описано в Тесте 1.
   2. Проверьте визуально симметричное разгибание и движение задних конечностей и пальцев ног (рис. 2в).
   3. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 за нормальное, симметричное положение/разгибание и движение задних конечностей и пальцев ног; 1 для явной асимметрии, когда значительно уменьшается подвижность и ассиметричное положение/разгибание контралатеральной (правой) задней конечности (рис. 2d).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест выявляет парез контралезионной задней конечности. Он также является частью шкалы mNSS. В этом тесте может быть сложно точно набрать баллы.
4. Симметрия ствола (Тест 3)
   1. Продолжайте удерживать мышь за основание хвоста (далее 2.3.) и оцените движения ее туловища.
   2. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 для нормального, без сгибания туловища или симметричного мягкого сгибания/движения туловища в обе стороны (в качестве маневра «побега»); 1 для выраженного (>30°) сгибания головы/туловища преимущественно контралезионного (вправо), в течение первых 10 секунд от удержания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест выявляет асимметрию при односторонних двигательных поражениях. Он также является частью скоринга mNSS.
5. Круговое поведение (Тест 4)
   1. Аккуратно положите мышь на ровную поверхность и дайте ей свободно двигаться не менее чем на 1 минуту. Наблюдайте за его манерой движения.
   2. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 за исследовательское, яркое, линейное движение без кругового поведения; 1 за тенденцию поворачиваться в одну сторону, но не по замкнутым кругам; 2 за непостоянное движение по замкнутым кругам в одну сторону; 3 для постоянного движения по замкнутым кругам в одну сторону; 4 для поворота, раскачивания или полного отсутствия движения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест выявляет нарушения сенсомоторной и пространственной навигации. Он также является частью NS.
6. Симметрия тела (Тест 5)
   1. Продолжите тест 4 и позвольте мыши свободно перемещаться по плоской поверхности. Наблюдайте за его осью «нос к хвосту».
   2. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 за нормальную осанку с поднятым туловищем от скамьи и прямым хвостом; 1 для «небольшой асимметрии» при незначительном изгибе тела в одну сторону и дистально изогнутом хвосте; 2 для «умеренной асимметрии», если очевидно изгиб тела или наклон в контралезионную сторону с проксимально согнутым хвостом и/или конечностями, вытянутыми из тела; 3 за «заметную асимметрию» при выраженном изгибе тела, одна сторона непостоянно лежит на скамейке и хвост явно проксимально изогнут (более 2 баллов); 4 для "крайней асимметрии" если тело согнуто, один бок постоянно лежит на скамейке и хвост сильно согнут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Он обнаруживает сенсомоторные односторонние дефициты ствола и хвоста. Он также является частью шкалы NS.
7. Оценка походки (Тест 6)
   1. Продолжайте с теста 5 и позвольте мыши свободно перемещаться по плоской поверхности. Понаблюдайте теперь за его походкой и проверьте наличие двигательных нарушений ходьбы, таких как парез, ригидность конечностей, спастическая походка, конечности.
   2. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 баллов за нормальную походку, если исследовательская, симметричная и быстрая с гибкими конечностями, которые двигаются «скрытыми» под телом; 1 для жесткой, негибкой и более медленной походки свободно движущейся мыши без хромоты; 2 для четкого хромоты с ассиметричными (влево-вправо) движениями; 3 за дрожь, дрейф или падение после легкого толчка; 4 для самостоятельной ходьбы (ходьба не длиннее 3 шагов при стимуляции легким толчком).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Он обнаруживает комбинированный дефицит походки. Он также является частью NS.
8. Обязательное кружение (Тест 7)
   1. Держите мышь за основание хвоста, чтобы поднять ее над поверхностью, и пусть она ходит только на передних конечностях. Наблюдайте за его движением.
   2. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 для нормального линейного движения; 1 за склонность к повороту в одну сторону; 2 для поворота в одну сторону по замкнутым кругам; 3 если при повороте в одну сторону неуклюжими движениями или вяло не удается завершить круг; 4 если нет продвижения и передняя часть ствола лежит на скамейке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест дополняет тест на поведение кругов (тест 4, см. 2.5). Вероятно, он обнаруживает сенсомоторный и пространственный дефицит. Он также является частью скоринговой системы NS.
9. Положение против боковых сил (Тест 8)
   1. Поместите мышь на ладонь так, чтобы ось хвостового носа (продольная) была параллельна сагиттальной оси ладони.
   2. Поворачивайте мышь вперед и назад с постоянной скоростью, чтобы вызвать силы, перпендикулярные ее продольной оси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это заставляет мышь сохранять вертикальное положение и балансировать против боковых сил во время замаха. Его тело в норме не соприкасается с ладонью или пальцами.
   3. Наблюдайте за визуальным изображением и чувствуйте любые контактные прикосновения ладонями левой и правой сторон мыши, когда она балансирует против качания. Проверьте наличие асимметричного падения, прикосновения к ладони или признаков боковой слабости.
   4. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0, если мышь стоит в нормальном вертикальном положении спиной параллельно ладони и может балансировать против раскачивания, не касаясь сильно ладони; 1 если мышь расплющивает свое тело во время качания для обретения устойчивости; 2 если часть мыши лежит или кратковременно касается ладони во время замаха; 3 если мышка лежит на одном боку, едва способная восстановить вертикальное положение; 4 Если мышь лежит в лежачем положении, не удается вернуться в вертикальное положение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест выявляет постуральный дефицит на фоне бокового ускорения, но его оценка может быть субъективной. Он также является частью mNSS, NS.
10. Целевое размещение передних конечностей (Тест 9)
    1. Держите мышь сзади или у основания хвоста. Направьте его перпендикулярно лучу, который функционирует как «мишень для достижения». Обратите внимание на симметричное «протягивание» и хватание.
    2. Как только он устойчиво возьмется за пучок, осторожно оттяните его в сторону и наблюдайте за симметричным «отпусканием» передних конечностей.
    3. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 за симметричное «дотягивание», хватание и «отпускание»; 1 за любую асимметрию в «дотянуться» и/или «отпустить», указывающую на контралезионную слабость передних конечностей.
11. Сенсомоторный дефицит передних конечностей (Тест 10)
    1. Крепко держите мышь за спину и поверните ее вентрально (см. видео или рисунок 1e).
    2. Последовательно стимулируйте передние лапы тонким кончиком (например, деревянной зубочисткой) под слепым углом. Понаблюдайте за реакцией передней лапы.
    3. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 за нормальное, быстрое хватательное движение с обеих сторон; 1 за отсутствующее или явно запоздалое захват контралесионно.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Оба теста 2.10 и 2.11 проверяют мелкий сенсомоторный дефицит передних конечностей. Они также являются частью mNSS.
12. Ходьба по лучу (Тест 11)
    1. Разместите деревянную балку длиной 1 м (Таблица материалов) для соединения двух возвышенных поверхностей (например, скамеек, столов) на высоте 1-1,5 м над землей. Стабилизируйте края балки, чтобы избежать вибраций или неустойчивости.
    2. Поместите мышь в середину луча так, чтобы ось носа-хвоста была параллельна лучу (рис. 2e). Обеспечьте равновесие или свободную ходьбу на бревне. Наблюдайте за его равновесием или парезом и отпадением конечностей.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна восстановить равновесие на луче, прежде чем забивать его. Держите толстую перчатку ниже животного (на расстоянии примерно 15-20 см), чтобы защитить его в случае падения.
    3. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0, если мышь балансирует и ходит с устойчивым положением к одной стороне луча; 1 если он ухватится за сторону балки и не ходит по ней; 2, если одна конечность отваливается от балки; 3, если с балки отваливаются две конечности; 4 если мышь пытается балансировать на луче, но падает (после 40 секунд); 5, если он падает между 20-40 секундами; 6 баллов, если он упадет без попытки балансировать или повиснет на бревне (<20 с).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Тест выявляет комбинированный двигательный дефицит передних, задних конечностей и туловища. Он также является частью шкалы mNSS.
13. Ощущение уса (Тест 12)
    1. Поместите мышь на открытую столешницу (как в тестах 4 и 5). Выделите некоторое время для размещения.
    2. Стимулируйте его левый и правый усы последовательно тонким ватным тампоном с длинным кончиком «слепого угла». Наблюдайте за быстрым поворотом головы в сторону стимуляции.
    3. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 для нормального, быстрого поворота головы при стимуляции, двусторонняя; 1 для более медленного контралезионного ответа при стимуляции; 2 при отсутствии контрацепионного ответа (без поворота); 3 - при отсутствии контралепии и более медленном ипсилезионном ответе; 4 для двустороннего отсутствующего ответа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте визуального обнаружения хлопка, потому что это может вызвать ложный ипсилатеральный поворот головы. Технически тест верен только тогда, когда мышь «удивлена» стимуляцией усов. Тест также является частью НС и выявляет сенсомоторный дефицит усов (бочкообразной коры).
14. Скалолазание (Тест 13)
    1. Используйте поверхность с резиновым покрытием под углом 45° (рис. 2a) и поместите мышь в ее центр. Понаблюдайте за усилиями мыши, чтобы взобраться вверх.
    2. Оценка в зависимости от полученных результатов следующая: 0 (нормальный), если мышь быстро и без усилий поднимается на вершину поверхности; 1 если лезет при напряжении, при слабости конечностей; 2 если он держится на склоне, не скользя и не поднимаясь; 3 если он сползает вниз по склону, несмотря на усилия предотвратить падение; 4 если он скользит без усилий для предотвращения падения.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Тест также является частью NS и определяет общую моторную силу.
15. Рассчитайте балл fESS, суммировав все баллы из тестов с 1 по 13
    ПРИМЕЧАНИЕ: оценка fESS 0 указывает на нормальную мышь, максимальная оценка равна 42. Большие инфаркты с поражениями стриарного и коркового тела обычно вызывают баллы >7-9. Обследуйте и оцените несколько нормальных мышей, прежде чем приступать к оценке мышей с инсультом, чтобы приспособиться к вариациям нормального поведения и уменьшить количество ложноположительных результатов fESS. Постоянно используйте предоставленный видеопротокол для стандартизации подсчета баллов на протяжении всего эксперимента.

3. Общая составляющая ЭСС (gESS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените gESS для выявления признаков «общего заболевания мышей», например, воспаления или инфекции, обычно присутствующих в течение первых 1-2 недель после fMCAo. Используйте лист оценок в Дополнительном файле 2. Оценивать gESS желательно после завершения fESS.

1. Поместите мышь на ровную поверхность (скамейку) и оставьте ее свободно двигаться, как в пункте 2.5. Оцените последовательно следующие баллы.
2. Понаблюдайте за его шерстью. Оценка в соответствии с оценочным листом gESS (баллы 0-2, см. Дополнительный файл 2).
3. Проверьте реакцию мыши на испуг: удивите мышь внезапным хлопком в ладоши под слепым углом, когда она расслаблена. Проверьте и оцените реакцию ушей мыши в соответствии с оценочным листом gESS (баллы 0-2, см. Дополнительный файл 2).
4. Оцените визуально глаза расслабленной мыши: проверьте наличие открытых/закрытых глаз или слизи. Оценка в соответствии с оценочным листом gESS (баллы 0-4, см. Дополнительный файл 2).
5. Наблюдайте за общей спонтанной активностью и бдительностью мыши. Оценка в соответствии с оценочным листом gESS (баллы 0-4, см. Дополнительный файл 2).
6. Наблюдайте за общим спонтанным поведением мыши на предмет наличия беспокойства, гипервозбудимости, агрессии или вращения вокруг своей оси во время любого обращения. Оценка в соответствии с оценочным листом gESS (баллы 0-4, см. Дополнительный файл 2).
7. Рассчитайте балл gESS, сложив баллы всех вышеуказанных этапов (наблюдательный скоринг, шаги с 3.2. по 3.6).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка gESS не обнаруживает очаговый дефицит, вызванный инсультными поражениями, и не подвержен влиянию mSU, как было показано ранее ¹³. Все тесты адаптированы по шкале NS ^9,15.

4. Количественная оценка дефицита передних конечностей с помощью теста Cylinder Test

ПРИМЕЧАНИЕ: Испытание баллона ранее подробно описано в^{пунктах 9,15,27} и не будет подробно описано здесь. Цилиндрический тест является независимым поведенческим тестом, который несмещенно количественно оценивает дефицит передних конечностей (см. 4.2).

1. Запустите тест, следуя инструкциям, приведенным здесь¹⁵. Захватывайте видео и анализируйте их как в ¹⁵. Измерьте правый и левый первые конечности-контакты со стенами. На рисунках 3a, b показаны изображения установки.
2. Рассчитайте латерализацию использования конечностей из-за контралезионного (правого) пареза в процентах. Используйте формулу: % предпочтения для левых шагов = [(влево - вправо) первые контакты / (вправо + влево) контакты] x 100.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите тест базового цилиндра для каждой мыши, прежде чем вызывать инсульт. Проводите тесты во временных точках в соответствии с каждым экспериментальным планом.

5. Количественная оценка дефицита передних и задних конечностей с помощью теста Ladder-rung Test

ПРИМЕЧАНИЕ: Соорудите аппарат для мышей из плексигласа (показано на рисунке 3c): коридор длиной 1 м со стенками высотой 20 см, пластиковыми перекладинами (диаметром 3 мм), расположенными через равные промежутки 15 мм (рисунок 3c1), и ящиком для убежища на дистальном конце. Положите подстилку для животных в убежищный ящик для знакомства и немного гранул еды или арахисовое масло в качестве награды. Ширина коридора должна составлять 10 см и должна быть приподнята примерно на 30 см от земли.

1. Тренируйте мышей на аппарате за 1-3 дня до базового уровня эксперимента. Проведите обучение, как показано в шагах с 5.1.1 по 5.1.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дрессировка необходима для того, чтобы приспособить животных к равномерной, нормальной ходьбе по коридору ступеней, без остановок, поворотов или исследовательского поведения. Проводите тренировку в течение 2 дней подряд (2 занятия). Каждая тренировка состоит из 3 пробежек (пробежка = одна прогулка по всему коридору к приюту). Сбор исходных данных необходим для последующего наблюдения.
   1. Очищайте перекладины и стены перед каждой пробежкой 70% спиртом, чтобы избежать запахов и «исследовательских» отвлекающих факторов/остановок мыши.
   2. Расположите мышь в начале коридора с лестницей-ступенями, лицом к сейфу, чтобы начать пробежку. Пусть мышь свободно идет к боксу-убежище в конце коридора. Не заставляйте животное ходить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробежки во время тренировки обычно сильно варьируются с точки зрения продолжительности и характера ходьбы. Целью тренировки является стабильная ходьба к приюту, обычно в течение <10 с, без остановок/поворотов, что обычно достигается к концу второго тренировочного дня. Обращайтесь с животным всегда осторожно, чтобы избежать индукции стресса, которая будет отвлекать от надлежащей дрессировки. Уберите животных из коридора и повторите прогон, если они остаются в коридоре и исследуют местность в течение >1 минуты, чтобы избежать привыкания.
   3. Выполните^1-й тренировочный забег. Дайте животному отдохнуть в боксе в течение 5 минут после^1-го спуска.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это длительное время отдыха позволяет мыши ознакомиться с убежищем и воспринимать его как «отдыхающую/вознаграждающую» цель, которую нужно достичь. Достижение «полезного восприятия» убежища имеет решающее значение для успешных пробежек.
   4. Извлеките мышь из убежища и выполните второй и третий тренировочные заезды, как показано в пункте 5.1.2. В конце этих пробежек предоставьте более короткое время отдыха в боксе для убежища (30-60 с), чтобы избежать привыкания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обучение завершается на 2-й день. Ко второму дню почти все животные учатся ходить по коридору в стабильном темпе. Подумайте об исключении животных из дальнейших экспериментов, если они не учатся.
2. Проведите эксперимент на обученных мышах. Тестируйте мышей в течение 2 прогонов каждый раз во все временные точки эксперимента и исходного уровня.
   1. Выполните прогоны, как описано в шагах 5.1.1 и 5.1.2. Дайте не более 5 минут отдыха между 2 пробежками в боксе для убежища.
   2. Используйте смартфон (или аналогичную камеру) и «селфи-палку» для съемки видео (данных) животных под небольшим вентральным и «слепым» углом с некоторого расстояния (как показано на рисунке 3c2). Убедитесь, что вы захватываете конечности, когда животное идет по коридору. Не отвлекайте мышь визуально во время бега и следите за ее конечностями во время бега (рис. 3c2).
   3. Запишите оба прогона, но используйте и проанализируйте данные второго прогона.
   4. Измерьте количество шагов (падений) между ступенями для каждой конечности (левой/правой, передней/задней конечности) (рис. 3c3), просмотрев видео с помощью любого программного обеспечения медиаплеера с опциями замедленной съемки. Рассчитайте абсолютную или % разницу между ступенями дефекта правой и левой конечности, отдельно для передних и задних конечностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Второй прогон дает более надежные результаты. Здоровая мышь обычно имеет 0-1 произвольных шагов неисправности на каждую конечность (правую или левую) во время второго запуска, что обычно дает диапазон разницы 0 ±1. Поглаженная мышь будет делать неправильные шаги своей правой (контралесионной) паретической конечностью (передней или задней), что приводит к положительной латерализации «вправо». Животное с тяжелым инсультом может быть медленнее или не завершать пробежку в течение первых 7-10 дней после инсульта, однако впоследствии оно будет выполнять правильные пробежки и демонстрировать серьезные дефициты.

mSU, как описано выше, начинается после операции fMCAo. Наши репрезентативные результаты в двух независимых когортах мышей с инсультом и симуляцией fMCAo (рис. 4a) подтверждают ранее доказанную ценность mSU, особенно в критический период между 3 и 10 днями^. В наших когортах смертность произошла у 3/15 животных когорты 1 (инсульт, наблюдение через 6 месяцев), у 2/10 животных из когорты 2 (инсульт, наблюдение через 14 дней) и у 0/6 животных, прооперированных симуляцией (рисунок 4a) в рамках патофизиологии инсульта (все они были найдены мертвыми во время утренних визитов) и была включена в оценку. Ни одно животное не было усыплено в соответствии с заранее определенными гуманными конечными точками. Эта острая смертность (10-15%) в фазе А (первоначальные 24-48 ч после fMCAo) (рис. 4a) была связана с отеком полушарий и грыжей, возникшими в результате больших территориальных инсультов¹³, и ожидалась как часть трансляционного моделирования инсульта. Отсроченная смертность во время фазы B (1/15 для когорты 1, 1/10 для когорты 2) составила максимум 5-10% в соответствии с протоколом mSU (рис. 4a) и обычно имеет место для животных с очень большими инсультами, которые не могут быть спасены, несмотря на поддержку mSU. Это также напрямую влияет на смертность людей после инсульта, связанную с тяжестью инсульта²⁹. Отсутствие применения mSU или низкая приверженность его принципам приводит к увеличению смертности от фазы В, которая может достигать даже 60-90%¹³. Фаза С обычно лишена дальнейшей смертности.

При применении mSU мыши с большими инсультами выживают после критической фазы B и демонстрируют значительный неврологический дефицит. Наши данные показывают, что стандартизированное использование fESS обнаруживает и количественно оценивает как fMCAo-индуцированный дефицит, так и спонтанное улучшение у мышей (рисунок 4b), а также превосходит или соответствует предыдущим шкалам, таким как фокальная нейрооценка (NS), mNSS и шкалы Бедерсона (BE) 9,10,12,14. Несмотря на то, что fESS не является напрямую статистически сопоставимым, он демонстрирует аналогичную или более высокую чувствительность в острой фазе, фиксирует спонтанное неврологическое улучшение после fMCAo и остается чувствительным к дефициту до 6 месяцев после инсульта по сравнению с другими шкалами. Это позволяет использовать его для трансляционной и чувствительной оценки после нажатия мыши, а существующий видео-протокол обеспечивает повышенную объективность оценки.

В дополнение к fESS, тесты Ladder-rung и Cylinder могут дополнять долгосрочную неврологическую оценку и мониторинг путем количественной оценки парезов передних и задних конечностей. Каждый тест требует примерно 5-7 минут на получение видео на животное и 5-15 минут на ручной анализ видео. Репрезентативными результатами являются увеличенные падения конечностей между ступенями при ходьбе мыши в тесте Лестницы (что приводит к % латерализации правой руки при левом инсульте) и «предпочтительное» касание стены здоровой левой передней конечностью при тесте Цилиндра (что приводит к левому % латерализации при левом инсульте). Наши репрезентативные данные для 6-месячной когорты показывают, что тест Ladder-rung может выявлять парез передних конечностей в острой/подострой фазах, но теряет свою чувствительность из-за спонтанного улучшения после этого (рис. 4c, p<0,05 для времени и p<0,01 для групповой разницы, модель смешанных эффектов), однако остается более надежным в выявлении и количественной оценке парезов задних конечностей в течение периода до 6 месяцев (Рисунок 4d)., p<0.05 для групповых различий, модель смешанных эффектов). В то же время, цилиндрический тест сохраняет отличную чувствительность при выявлении парезов передних конечностей в течение 6 месяцев после fMCAo (рис. 4e, p<0,001 для групповой разницы, модель со смешанными эффектами). В сочетании оба теста эффективно выявляют, количественно оценивают и контролируют долгосрочные парезы передних и задних конечностей.

Рисунок 1. Протокол поддержки mSU после fMCAo. (А) Инструменты и материалы, используемые для mSU. (Б) измельчение нормальной пищи (с помощью блендера или другого устройства) и изготовление гелевой пищи для активной (с помощью шприца) и пассивной (чашка Петри) поддержки кормления. (C) гелевый корм и твердые гранулы должны быть помещены (и заменены свежими ежедневно) в клетку с животными за несколько дней до (для размещения) и после fMCAo; Предполагается, что животные будут прятать гелевый корм под подстилкой. (Г) активный хватание для подачи шприца (красные стрелки указывают на стабилизацию левой щеки пальцами, стрелка указывает на захват меха). (Д) введение шприца в рот, направленный на правую щеку (стрелка). (F) Витрина для измерения температуры поверхности тела (красная область и стрелка в центре брюшного тела для измерения температуры). (G) пробка из уретры (стрелка). (H) Предлагаемый график проведения экспериментов по хроническому инсульту при поддержке mSU (bsl: исходный уровень, h: часы, d: дни и m: месяцы в качестве временных точек оценки) с предлагаемой оценкой с использованием ESS, Ladder-rung и Cylinder тестов. Эта временная шкала была использована здесь для когорт 1 (6-минутное наблюдение) и 2 (14-секундное наблюдение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2. Экспериментальная шкала хода. (A) Инструменты для тестирования ESS, (B) репрезентативные срезы мозга с мазком (левая половина, пятно по Нисслю) и их соответствующим перекрытием соответствующей карты мозга Аллена при брегме +1,0 и -0,3 мм в переднезаднем направлении (Этот рисунок был изменен из Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org и atlas.brain-map.org)³⁰. (C) Подвешивание животного за основание хвоста для тестов на симметрию передних, задних конечностей и туловища fESS, серые пунктирные круги показывают нормальную симметрию передних и задних конечностей. (D) Явная асимметрия паретической правой задней конечности (асимметричное положение/разгибание). (E) нормальное положение животного на балке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3. Постановка тестов лестницы и цилиндра. (А) установка теста Цилиндра, мышь находится в цилиндре, в то время как вертикальные зеркала обеспечивают обзор ее передних конечностей на 360°. (В) близко рассмотреть животное при контакте левой передней конечности (использование) со стенкой цилиндра. (C) вид и детали конструкции испытания на лестничной ступеньке для мышей (см. также текст для размеров и инструкций по конструкции); (C1) показывает нормальную мышь в коридоре лестничной лестницы сверху, (C2) показывает нормальную мышь с правильным наступлением на ступеньки (без падений), (C3) показывает падение передних конечностей между ступеньками (изображения взяты из видео). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4. Долгосрочная выживаемость и неврологический дефицит после fMCAo. (A) Воспроизведение эффективности mSU в двух независимых группах животных: в первой за мышами наблюдали в течение 6 месяцев, а во второй за животными наблюдали в течение 14 дней после инсульта. (B) Баллы различных, хорошо зарекомендовавших себя, неврологических шкал для обеих когорт. (C) Двигательный дефицит передних конечностей и (D) задних конечностей правой стороны (= правые - левые ложные шаги, для передних и задних конечностей соответственно), обнаруженный с помощью теста Ladder-rung в нашей 6-месячной когорте животных, по сравнению с животными, прооперированными через имитацию. (E) Результаты асимметрии передних конечностей (в процентах предпочтения использования здоровой левой передней конечности), обнаруженные с помощью цилиндрического теста у нашей 6-месячной когорты животных, по сравнению с животными, прооперированными искусственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1. Интерфейс программного обеспечения: Пример 3 животных с их ежедневным подсчетом баллов по RSS. Действия и RSS относятся к Фазам B и C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок S1. Определение ежедневной шкалы стратификации риска (RSS) и результирующих действий поддержки для каждого животного. Животные с оценкой 0-1 имеют минимальный риск смертности, а с 5-6 – максимальный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1. Предложенный шаблон для мониторинга и документирования животных во время операции fMCAo и последующего наблюдения за mSU. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное дело 2. Предлагаемый оценочный лист для фокусной и общей ЭСС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Настоящий протокол представляет собой всеобъемлющее руководство по протоколу поддержки mSU, разработанному для снижения искусственной смертности между 3-10 днями у мышей, подвергшихся большим территориальным ударам по модели fMCAo¹³. Кроме того, настоящий протокол включает в себя стандартизированное видеоруководство по фокальному компоненту шкалы ESS (fESS) для снижения расширенной субъективности и смещения оценки неврологического очага у мышей после инсульта. Кроме того, мы вводим тест Ladder-rung для количественной оценки долгосрочных (до 6 месяцев) двигательных дефицитов передних и задних конечностей.

mSU удобен в использовании и эффективен. Наш протокол видеопомощи делает mSU понятным для применения даже для неопытных исследователей. 3 фазы mSU (а именно фазы A, B и C, см. раздел 1 протокола выше и рисунок 1h) определены эмпирически для адаптации его оценки и поддерживающих мер. mSU ежедневно адаптирует свои вмешательства в соответствии с каждой фазой и в зависимости от шкалы стратификации риска (RSS) каждой мыши. Эта оценка отражает клиническую тяжесть, дает оценку фактического риска смертности и определяет индивидуальную поддержку для каждой мыши. В дополнение к этому, простое клиническое наблюдение за животным всегда должно добавлять информацию для индивидуальной поддержки mSU. В конечном счете, mSU трансляционно реализует ключевые компоненты поддержки инсультного отделения человека (SU), включая контроль температуры, баланс жидкости, профилактику/лечение инфекций, нутритивную поддержку и нормогликемию ^1,2,7, во время критической фазы первых 3-10 дней после fMCAo у мышей¹³. Важно отметить, что эффективность mSU для снижения артефактной смертности с 60-90% до <15%^13,31 была успешно воспроизведена в независимых исследовательских группах 17,18,32,33.

Для успеха протокола mSU необходимо выполнить несколько критических шагов. Во-первых, в то время как mSU полагается на тщательное клиническое наблюдение и оптимальную поддержку животных, рекомендуется иметь команду как минимум из двух исследователей, работающих посменно, чтобы снизить рабочую нагрузку, хотя один исследователь также может справиться с этим в одиночку. Во-вторых, наиболее критическими временными точками для поддержки являются около 22:00 и 08:00, что соответствует началу и концу ночного повышения активности мышей, когда потребность в энергии выше 13,22,23. В-третьих, в соответствии с текущими^{клиническими} рекомендациями по лечению инсульта7, добавки глюкозы должны быть тщательно подобраны и сведены к минимуму, чтобы избежать нейротоксической гипергликемии после инсульта. В-четвертых, активное кормление должно проводиться блоками по 5-10 животных, вводя полные глотки по 40-60 мкл с каждым шагом, чтобы сбалансировать снижение рабочей нагрузки с эффективным кормлением. Наконец, интенсивность mSU должна быть адаптирована к потребностям каждой мыши и шкале RSS, основанной на тяжести инсульта. Это означает, что мышам с небольшими инсультами может потребоваться более короткая и менее интенсивная поддержка, в то время как мышам с более крупными инсультами может потребоваться поддержка даже после 14-го дня, чтобы снизить риск смерти.

Неврологические оценки у мышей всегда были очень субъективными и сложными из-за их небольшого размера и трудности с обнаружением дефицита. В связи с этим все предыдущие шкалы инсульта (BS, mBS, LS, mNSS, GS, NS, см. также введение) либо обнаруживают грубые признаки (например, 3-5-балльные шкалы BS, mBS и LS), смешивают очаговые с общими постинсультными симптомами (например, NS), не могут уловить тонкие дефициты за пределами острой фазы инсульта ^8,9 (например, 3-балльная шкала BS ¹⁰, 5-балльный mBS ¹¹ или 5-балльный LS⁶), или не могут количественно оценить долгосрочное спонтанное улучшение после инсульта. Чтобы улучшить все эти факторы, мы ранее¹³ разработали ESS (fESS/gESS) путем критического комбинирования или исключения компонентов из предыдущих шкал, создав инструмент, способный оценивать часто поражаемые области с помощью модели^{fMCAo 20} (рисунок 2b). Теперь мы также предоставляем первую видеостандартизацию fESS, чтобы предложить визуальное руководство и устранить давнее ограничение субъективности между лабораториями и исследователями. Наши данные подтверждают, что fESS превосходит mBS и mNSS по шкале или равен NS (рис. 4b) в выявлении очаговых, связанных с инсультом, дефицитов у мышей, а также фиксирует продолжающееся долгосрочное спонтанное восстановление после инсульта. Предоставленная видео-стандартизация в настоящее время служит надежным учебным инструментом для последовательной оценки постинсультного дефицита.

В дополнение к fESS мы рекомендуем использовать тест Лестничной ступени и ранее описанный Цилиндрический тест¹⁵ в качестве батареи тестов для количественной оценки парезов передних и задних конечностей или соответствующих улучшений в долгосрочной перспективе (до 6 месяцев). Для анализа конечностей внутри животного необходимы исходные оценки для обоих тестов. Тест Лестничной ступеньки, ранее использовавшийся на крысах ^34,35, был адаптирован и описан здесь для мышей. На практике испытание в решающей степени зависит от стабильной схемы движения по коридору ступеней, без поворотов и остановок. Для этого мы рекомендуем анализировать второй заход в каждой временной точке, так как он обычно дает наиболее стабильный ходячий паттен. Правильная тренировка без привыкания имеет решающее значение для получения надежных результатов, как указано в протоколе выше. Ограничением как лестничных, так и цилиндрических тестов является то, что мыши с большими ударами могут вообще не двигаться во время фазы А-В (дни 3 и 7 на рисунке 4c-e), что приводит к отсутствию данных и увеличению дисперсии; эти мыши часто демонстрируют максимальные шаги отказа во время фазы С. Чтобы преодолеть это ограничение и свести к минимуму стресс у животных, мы предлагаем тестировать мышей с конца фазы B (например, > 10-й день). Еще одним ограничением является тот факт, что тест с лестницей, по-видимому, теряет свою чувствительность к дефициту передних конечностей, но это компенсируется тестом Цилиндра. В конечном счете, эти тесты в сочетании могут объективно количественно оценить дефицит как передних, так и задних конечностей и их долгосрочное спонтанное улучшение.

В заключение мы рекомендуем mSU в качестве стандарта для моделирования трансляционных ходов мыши. В то же время мы рекомендуем прилагаемые испытания ESS (fESS/gESS), лестничные ступеньки и цилиндрические испытания в качестве простых, быстрых, экономичных, количественно чувствительных тестов для количественной оценки долгосрочного дефицита инсульта у мышей. В конечном счете, mSU может быть применен в будущем на любой другой мышиной модели, включающей тяжелые поражения головного мозга (например, черепно-мозговую травму, модели кровоизлияний в мозг и т. д.), где требуется интенсивная, клинически трансляционная мышиная поддержка.

Никаких разглашений, о которых можно было бы сообщить.

Мы хотели бы поблагодарить Николаоса Плакопитиса и Иоанниса Тацидиса за ценную хирургическую поддержку во время части исследования.