El protocolo de la Unidad de Accidente Cerebrovascular del Ratón con puntuación neurológica estandarizada para estudios traslacionales de accidente cerebrovascular del ratón

Este artículo presenta un protocolo para ejecutar el concepto de unidad de accidente cerebrovascular (mSU) altamente traslacional y probado de forma independiente en ratones de gran carrera. También proporciona un protocolo estandarizado para la ejecución de la escala focal experimental de ictus en ratones, que evalúa los déficits focales de ictus detectados incluso a largo plazo.

El modelo de filamento de oclusión de la arteria media (fMCAo) es quizás el modelo de accidente cerebrovascular de ratón más traslacional, ya que permite una isquemia controlada con reperfusión/recanalización intravascular. Sin embargo, no está alineado con los avances clínicos actuales para la atención del ictus (p. ej., las unidades de ictus), suele emplear puntuaciones neurológicas subjetivas o vagas entre los laboratorios y presenta una alta mortalidad en la fase aguda. Aquí, abordamos estas limitaciones con protocolos guiados por video validados. Presentamos el protocolo de la Unidad de Accidente Cerebrovascular del ratón (mSU) con videos instructivos y un algoritmo de decisión (Puntuación de estratificación del riesgo), cerrando la brecha entre el modelado clínico y el modelado del accidente cerebrovascular del ratón. Para aumentar la precisión y la sensibilidad de la puntuación neurológica del ictus, presentamos por primera vez un formato estandarizado en vídeo de la Escala Experimental del Ictus focal (fESS) y demostramos su valor hasta 6 meses después del ictus. Además, se presentan los protocolos para la prueba de peldaños de escalera en ratones, así como la conocida prueba de cilindro, para una evaluación cuantitativa e imparcial de la función motora de las extremidades. Los resultados ponen de manifiesto la eficacia traslacional de la mSU. La ESS focal (fESS) sobresale sobre otras escalas conocidas en la detección de déficits focales de accidente cerebrovascular, la captura de la recuperación y el mantenimiento de la sensibilidad hasta 6 meses después del accidente cerebrovascular. Las pruebas de peldaños y cilindros cuantifican y controlan objetivamente los déficits motores de las extremidades delanteras y traseras a largo plazo. En resumen, la integración de mSU, fESS y pruebas de función motora proporciona un marco sólido para las investigaciones de accidentes cerebrovasculares clínicamente relevantes. Nuestros protocolos mejoran el valor traslacional en la investigación de golpes de ratón.

El accidente cerebrovascular isquémico grande es una de las principales causas de morbilidad y discapacidad en todo el mundo¹. Aun así, la investigación sobre el ictus de ratón se enfrenta a un bloqueo traslacional en casi todos los tratamientos probados preclínicamente hasta el momento². Las múltiples razones de este problema y los esfuerzos para superarlo han sido revisados en detalle en publicaciones anteriores². Estos desafíos surgen de la limitada integración de los avances clínicos en modelos animales relevantes² y de las debilidades de los sistemas de puntuación conductual y neurológica para detectar déficits posteriores al accidente cerebrovascular de manera precisa y sensible².

Descubrimientos recientes³ apoyan que el modelo de filamento de oclusión de la arteria media (fMCAo) en ratones tiene ventajas traslacionales significativas sobre otros modelos con lesión abierta de cráneo y trauma ^2,4. Además, es el único que modela la reperfusión y la trombectomía mecánica de los cuadros clínicos de ictus ^5,6,7. Sin embargo, el modelo se enfrenta a una alta mortalidad subaguda entre 3 y 7 días después del accidente cerebrovascular, lo que prohíbe los estudios a largo plazo de accidentes cerebrovasculares grandes y se consideraba hasta hace poco el artefacto inherente e insuperable del modelo. Además, la detección de déficits neurológicos post-accidente cerebrovascular es relativamente difícil y sesgada en ratones debido a su pequeño tamaño, especialmente entre los no clínicos o investigadores inexpertos ^8,9. Para hacer frente a esto, diferentes grupos han desarrollado diversas escalas para detectar déficits. Las escalas más utilizadas y conocidas son la escala de Bederson de 3 puntos (BS)¹⁰, la escala de Bederson modificada de 5 puntos (mBS)¹¹, la puntuación de Longa de 5 puntos (LS) (que es similar a la mBS)⁶, la Escala Neurológica de Accidentes Cerebrovasculares modificada (mNSS)^12,13, la escala de García de 18 puntos (GS)⁹ y la más detallada DeSimoni¹⁴ o conocida de forma diferente como "Neuroscore" (NS)^{9, Escala 15}. Desafortunadamente, algunas de estas escalas son demasiado rudimentarias y se restringen solo a los pocos días de fase aguda después del accidente cerebrovascular (BS, mBS y LS)^8,9 o su interpretación es borrosa por los déficits generales (NS).

Con estos antecedentes, previamente desarrollamos y validamos el protocolo de soporte de la Unidad de Accidente Cerebrovascular del ratón (mSU), junto con la escala experimental de accidente cerebrovascular (ESS) para ratones¹³. La razón de ser de la mSU fue adaptar el conocimiento de la rutina clínica (es decir, las unidades de ictus humano) a la investigación preclínica del ictus, mientras que la ESS consolidó críticamente las escalas de ictus previamente existentes pero "insensibles" o redundantes en una práctica, refinada, sensible y eficiente en el tiempo. La mSU consiste en la monitorización frecuente y adaptada de los parámetros clínicos básicos del ratón con la aplicación adaptada de soporte animal para mejorar la supervivencia¹³.

De hecho, los datos de nuestro laboratorio y otros confirman el valor de ambos métodos. La mSU traduce las medidas clínicas básicas de soporte y avanza⁷ de humanos a ratones, reduce significativamente la mortalidad de la fMCAo en ratones del 60-70% al 10-15%¹³, lo que permite estudios de accidentes cerebrovasculares más grandes, y puede aplicarse eficazmente en laboratorios independientes desde entonces 16,17,18,19. Además, el ESS puede distinguir entre déficits y síntomas focales (componente focal del ESS, fESS) y generales (componente general del ESS, gESS) post-ictus, modela la puntuación clínica humana (diferenciación entre signos y síntomas focales y generales en humanos), se relaciona linealmente con el tamaño de la lesión del ictus y es sensible a largo plazo a los déficits^13,20. Sin embargo, a pesar del valor y la eficacia comprobados tanto de mSU como de ESS, la falta de instrucciones claras, visualizadas y estandarizadas, incluso para investigadores inexpertos, deja varias preguntas abiertas sobre la aplicación de mSU y una subjetividad significativa en la puntuación de los déficits focales en fESS.

Como tal, nuestro presente artículo tiene como objetivo proporcionar instrucciones claras y asistidas por video para los protocolos mSU y fESS. Creemos firmemente que ayudará a los investigadores del ictus a aumentar la eficiencia traslacional de sus estudios sobre el ictus, reducir significativamente la pérdida de animales durante los primeros 3-10 días después del ictus, reducir los costes de experimentación y, finalmente, evaluar de forma reproducible los déficits neurológicos durante meses después^{del ictus}. Además, la combinación adicional de la prueba de peldaño de escalera y la prueba de cilindro puede cuantificar fácilmente la paresia focal de las extremidades (extremidades anteriores y traseras) debido a fMCAo.

Para mostrar la eficiencia de mSU y fESS, proporcionamos datos a mediano (14 días) y largo plazo (6 meses) en ratones después de fMCAo. Se utilizaron ratones machos C57Bl/6J de doce semanas de edad (n= 31) y se alojaron a temperatura controlada (22 ± 2 °C), con un período de ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso a alimento y agua peletizados ad libitum. Los ratones se dividieron en dos cohortes seguidas durante 14 días (n = 10, cohorte 1) y 6 meses (n = 15, cohorte 2) respectivamente. Estos ratones fueron sometidos a una isquemia cerebral de 60 min utilizando el modelo bien descrito de fMCAo 13,20,21 bajo anestesia con isoflurano. Los animales operados simuladamente (n = 6, operados como las dos cohortes anteriores, pero no se indujo isquemia) seguidos durante 6 meses sirvieron como controles. Se utilizó buprenorfina como analgésico preoperatorio y postoperatorio a los 3 días. También se realizaron las pruebas de peldaños y cilindros de escalera para la cohorte de 6 meses como parte de la puntuación neurológica.

Todos los animales fueron examinados diariamente para determinar los criterios de valoración humanitarios durante los primeros 14 días después del parto, definidos como: 1) hipotermia grave (<33 °C) y/o inmovilidad (p. ej., puntuación 4 en la prueba 6 de fESS o prueba de "actividad espontánea" de gESS) que no mejoró con el tratamiento con "unidad de accidente cerebrovascular de ratón" (es decir, calentamiento pasivo y alimentación activa, ver 1.4, 1.6, 1.8) en el plazo de una hora, 2) signos de dolor o comportamiento de ansiedad (p. ej., puntuación >2 en la prueba de "ansiedad/comportamiento automático" de gESS), incluso después de la analgesia postoperatoria según el protocolo.

En este protocolo, el soporte posterior al accidente cerebrovascular de los ratones en forma de mSU comienza inmediatamente después de la recuperación del ratón de la operación fMCAo. Esto tiene 3 fases: fase A (0-48 h después de la reperfusión), fase B (>48 h y hasta el "final del soporte activo necesario", generalmente en el día 10-14, dependiendo de la fase B de cada animal) y fase C (día 14 en adelante). Cuenta con cinco intervenciones significativas (visitas/Risk Stratification Score, alimentación, líquidos, temperatura y desinfecciones locales; ver 1.1. a 1.8. a continuación) adaptadas a cada animal, de acuerdo con cada fase (A, B o C) y su estado clínico real diario evaluado por la Risk Stratification Score (RSS), ver Figura complementaria 1 y Tabla 1 con tres ejemplos típicos. Los materiales y herramientas necesarios para mSU se muestran en la Figura 1a y se describen en la Tabla de Materiales. También proporcionamos una plantilla para el seguimiento de animales durante la mSU (ver Archivo Complementario 1).

Los experimentos reportados en este artículo se llevaron a cabo siguiendo las directrices nacionales y europeas para el uso de animales de experimentación y fueron aprobados por los comités gubernamentales griegos (Atenas, Licencia No "843895_06-09-2022").

1. La "unidad de trazo del ratón" (mSU)

1. Evaluar diariamente el estado clínico del animal ("visitas") y calcular su puntuación RSS
   1. Imprimir el Archivo Suplementario 1, preferiblemente antes de la cirugía del animal, para el registro de datos y el seguimiento.
   2. Evalúe clínicamente a cada animal en puntos horarios estándar (visitas): temprano en la mañana (alrededor de las 08:00), al mediodía (entre las 14:00 y las 16:00) y tarde en la noche (alrededor de las 22:00 - 23:00).
      NOTA: Adapte estas visitas estándar de acuerdo con la fase de seguimiento del animal: verifique el estado del animal 2 veces al día (mañana-noche) para la Fase A, 3 veces al día para la Fase B y una vez al día para la Fase C. Adapte aún más la frecuencia de las visitas de acuerdo con la puntuación RSS (ver 1.1.6). Trabajar preferiblemente en un equipo de >2 personas para la reducción de la carga de trabajo. Las visitas matutinas y nocturnas son cruciales para el éxito del apoyo, el seguimiento y la reducción de la mortalidad, ya que la fase nocturna (activa) de los ratones aumenta las demandas metabólicas y energéticas 13,22,23 y está relacionada con un aumento de la mortalidad nocturna después del accidente cerebrovascular.
   3. Pese el ratón con una báscula estándar sensible durante la visita de la mañana.
   4. Mida la temperatura con un termómetro sin contacto colocado sobre el centro ventral de su cuerpo durante la visita matutina. Sujete e inmovilice el ratón con la espalda. Tome la lectura dentro de los primeros segundos después de la inmovilización (ver Figura 1f).
      NOTA: No utilice un termómetro rectal debido a una posible ruptura intestinal después de mediciones repetidas con peritonitis concomitante.
   5. Evaluar y registrar el estado clínico general del ratón (movilidad, heridas, capuchón uretral, reactividad, pelaje, estado de hidratación, etc.) en la visita matinal para todas las fases, diariamente hasta el día 14.
   6. Calcule la puntuación RSS en la visita de la mañana sumando los puntos de acuerdo con el peso, la temperatura y la puntuación fESS del animal, como se describe en la Figura complementaria 1. Para el cálculo automatizado del RSS en una tabla de hoja de cálculo, utilice y adapte la fórmula que se encuentra en la Tabla 1. Sacrificar al animal con un método aprobado por la institución, si se presentan criterios de valoración humanitarios (ver arriba).
   7. Adaptar tanto la frecuencia de las visitas como la intensidad del apoyo, diariamente según la puntuación RSS y la fase post-ictus del animal.
      NOTA: La fase B es la más crítica para la mortalidad. Aumentar la frecuencia de las visitas y la intensidad del soporte para RSS ≥3 (para la definición y las instrucciones, consulte la Tabla 1). Si el animal continúa mostrando un RSS >3 en la Fase C, visítalo y apóyalo como en la Fase B. Utilice el RSS y los descriptivos generales (como recuperándose, estable, enfermo bajo/medio y enfermo crítico) para describir su condición clínica entre el equipo de apoyo. Después del día 14, reduzca las visitas de los animales a solo las requeridas por el protocolo experimental (por ejemplo, para evaluaciones conductuales/neurológicas).
2. Preparación del alimento en gel para el apoyo nutricional
   1. Pulverize los gránulos de alimentos comunes con una licuadora (Figura 1a).
   2. Agregue azúcar comercial al 5-10% para aumentar el contenido calórico de los alimentos.
   3. Agregue agua para crear una textura líquida similar a un gel (Figura 1b).
   4. Utilice este alimento en gel para el apoyo nutricional tanto pasivo como activo.
      NOTA: Opcionalmente, use alimentos comerciales en gel listos para usar. Los alimentos preparados pueden permanecer en la nevera durante 2-3 días.
3. Apoyo nutricional pasivo de los ratones
   1. Llene una placa de Petri con comida en gel y colóquela en el suelo de la jaula (apoyo nutricional pasivo mediante la provisión de comida en gel para facilitar el acceso al ratón). Deje 2-3 gránulos de comida junto a la placa de Petri.
   2. Refresque la placa de Petri con alimento en gel todos los días. Durante los primeros días, los ratones pueden llenar o cubrir la placa de Petri con ropa de cama de jaula. Algunos comenzarán a comer de él (Figura 1c).
4. Apoyo nutricional activo (alimentación activa)
   NOTA: La alimentación activa ocurre durante la Fase B. La frecuencia de alimentación estándar es de 3 veces al día y se adapta a más veces según la puntuación RSS (por ejemplo, incluso 4-5 veces al día). De vez en cuando, para los ratones que constantemente tienen una puntuación RSS de 0-1 (es decir, un pequeño derrame cerebral) y comen activamente por sí mismos, bajen la frecuencia a 1-2 al día.
   1. Rellene previamente las jeringas de 1 ml con gel alimenticio.
   2. Agarre y sostenga al ratón suave pero firmemente desde el pelaje de su cuello, como se muestra en la Figura 1d (punta de flecha roja).
   3. Estabilice la mejilla del ratón con el dedo medio, como se muestra con las flechas rojas en la Figura 1d: mientras sostiene el ratón con firmeza, deslice el dedo hacia los lados hacia la nariz del ratón contra su mejilla. Mantener la posición.
   4. Coloque la punta de la jeringa en la boca del ratón entre sus dientes y dirija la punta hacia el lado interior de su mejilla (flecha roja, Figura 1e).
   5. Dé aproximadamente 40-50 μL de alimento en gel cada vez (un bocado).
   6. Regrese suavemente el ratón a la rejilla de la jaula. Deje tiempo para masticar.
   7. Repita la alimentación después de 1-2 minutos, hasta que cada ratón haya comido 1-1,5 ml del alimento en gel.
      NOTA: Alimente de 5 a 10 ratones por carrera (1 a 2 jaulas); Los demás comen y tragan la comida en gel a medida que cada ratón recibe un bocado. El proceso no confiere estrés a los ratones. También se ha observado que algunos animales eventualmente se posicionan para agarrar y alimentarse.
5. Suplementación con solución salina normal
   1. Pesar el ratón durante la visita matutina (ver 1.1.2 y 1.1.3).
   2. Calcule su pérdida/ganancia de peso en comparación con la medición anterior restando los valores.
   3. Complementar su déficit de peso (en gramos) con mL de suero fisiológico normal (por vía subcutánea).
      NOTA: Evite a toda costa la sobrecarga de líquidos y el edema. No exceda 1-2 mL por dosis y 3-4 mL de líquidos por día. Comience después de 36 h después de la fMCAo.
6. Suplementación con glucosa
   1. Compruebe la puntuación RSS calculada del ratón y su movimiento general.
   2. Inyectar 0,5 - 1 mL de glucosa al 5% por vía subcutánea si RSS >3 y el ratón muestra signos concomitantes de hipotermia (<34 °C) o inmovilización/bradicinesia. Inyectar preferiblemente solo durante la visita nocturna.
      NOTA: Evite la hiperglucemia después de un accidente cerebrovascular a toda costa. La hiperglucemia post-ictus es tóxica⁷. Como tal, suplementar la glucosa solo después de la alimentación activa y en casos de condición clínica grave o para prevenir la hipoglucemia durante la actividad nocturna. La alimentación activa (ver 1.4) debe ser la principal medida de soporte, ya que proporciona un soporte energético más suave y duradero y traduce las guías clínicas ⁷. No suplementar con glucosa antes del día 3.
7. Gestión de la temperatura (pasiva)
   1. Mida la temperatura corporal superficial del animal antes de la operación al inicio y después de la operación en cada visita (Figura 1a). Mida como se muestra en la Figura 1f y se describe en 1.1.4. Anote los valores.
      NOTA: La hipotermia en ratones se define como la temperatura corporal <35 °C ^24,25. Los datos anteriores¹³ indican que cualquier temperatura por debajo de 34 °C es una señal de advertencia de apoyo después de un accidente cerebrovascular (ver más abajo).
   2. Cuando se observe hipotermia entre 33 y 34 °C, caliente al ratón de forma pasiva en una jaula sobre una placa calefactora (o cualquier otro dispositivo de calentamiento pasivo) hasta que alcance una temperatura corporal >34 °C. Alimente activamente al ratón para proporcionar energía para la producción activa de calor por parte del animal (suministro de energía más duradero).
      NOTA: Mantenga al animal en calefacción pasiva durante 1 a unas pocas horas. Evite la hipertermia pasiva a toda costa.
   3. Cuando se observa hipotermia, <33 °C, aumentar el apoyo con la administración adicional de glucosa por vía subcutánea (suministro de energía rápido pero de corta duración; ver 1.6 arriba).
8. Limpieza de genitales y/o herida en el cuello ("desinfecciones" locales)
   NOTA: Ocasionalmente, se puede observar una dehiscencia de la herida o un tapón uretral. La dehiscencia de la herida es poco frecuente. El tapón uretral es un tapón duro en la punta de los genitales del ratón (Figura 1g) y se observa más común, especialmente en animales con mayor gravedad del ictus. Cuando el tapón bloquea la uretra, puede ocurrir un síndrome obstructivo urinario que puede llevar a la morbilidad y la muerte²⁶. Por lo tanto, debe limpiarse bien.
   1. Remoje el tapón uretral, si está presente, con solución salina normal para facilitar su extracción.
   2. Retire el tapón uretral suavemente con un hisopo pequeño o una pinza simple en cada revisión/visita del animal. Desinfecte la uretra con un manómetro o hisopo, empapado con una solución antiséptica.
   3. Si hay una dehiscencia de la herida, desinfectarla localmente con cualquier solución antiséptica quirúrgica común (p. ej., Octanisept) y suturar la herida de forma rutinaria utilizando preferiblemente una sutura de seda 5/0.

2. El componente focal de la Escala Experimental de Accidentes Cerebrovasculares (fESS)

1. Preparar el campo de prueba
   1. Limpie un banco con alcohol al 70% para eliminar estímulos externos (ópticos u olores) y prepare los materiales de prueba, como se muestra en la Figura 2a.
   2. Imprima la hoja de puntuación de ESS proporcionada como archivo complementario 2 y siga las pruebas una por una.
2. Paresia de las extremidades anteriores (Prueba 1)
   1. Levante y sostenga el ratón suavemente desde la base de su cola.
   2. Verifique y evalúe visualmente la extensión simétrica hacia adelante y la movilidad simétrica de las extremidades anteriores a medida que el ratón se mueve (Figura 2c).
   3. La puntuación depende de los hallazgos visuales de la siguiente manera: 0 para la extensión y el movimiento normales y simétricos de las extremidades anteriores; 1 por "asimetría leve", definida como flexión leve y/o reducción del movimiento de la extremidad contralesional o rigidez de la extremidad; 2 por "flexión marcada" de la extremidad contralesional; 3 para la adherencia de la extremidad contralesional al tronco; Puntuación 4 por no mover el cuerpo o las extremidades.
      NOTA: La prueba detecta paresia de la extremidad anterior contralesional. También forma parte de las escalas BS, LS, mNSS y NS. La puntuación 1 puede ser difícil de definir debido a las maniobras de escape del animal.
3. Paresia de las extremidades posteriores (Prueba 2)
   1. Continúe sosteniendo el mouse por la base de la cola, como se describe en la Prueba 1.
   2. Verifique visualmente la extensión y el movimiento simétricos de las extremidades posteriores y los dedos de los pies (Figura 2c).
   3. La puntuación en función de los resultados es la siguiente: 0 para la posición/extensión y el movimiento normales y simétricos de las extremidades posteriores y los dedos de los pies; 1 para una clara asimetría, cuando el movimiento disminuye significativamente y la posición/extensión asimétrica de la extremidad posterior contralateral (derecha) (Figura 2d).
      NOTA: La prueba detecta paresia de la extremidad posterior contralesional. También forma parte de la escala mNSS. Esta prueba puede ser difícil de calificar con precisión.
4. Simetría del tronco (Prueba 3)
   1. Continúe sosteniendo el ratón por la base de la cola (siguiendo el punto 2.3.) y evalúe los movimientos de su tronco.
   2. La puntuación en función de los resultados es la siguiente: 0 para normal, sin flexión del tronco o flexión/movimiento simétrico leve del tronco hacia ambos lados (como maniobra de "escape"); 1 para una marcada (>30°) flexión de la cabeza/tronco predominantemente contralesional (hacia la derecha), dentro de los primeros 10 segundos desde la sujeción.
      NOTA: La prueba detecta asimetría por lesiones motoras unilaterales. También forma parte de la puntuación mNSS.
5. Comportamiento circular (Prueba 4)
   1. Coloque el ratón suavemente sobre una superficie plana y deje que se mueva libremente durante al menos 1 minuto. Observa su patrón de movimiento.
   2. La puntuación depende de los hallazgos de la siguiente manera: 0 para el movimiento exploratorio, vívido y lineal sin comportamiento circular; 1 por la tendencia a girar hacia un lado, pero no en círculos cerrados; 2 para el movimiento inconstante en círculos cerrados hacia un lado; 3 para el movimiento constante en círculos cerrados hacia un lado; 4 para pivotar, balancearse o no moverse en absoluto.
      NOTA: La prueba detecta déficits sensoriomotores y de navegación espacial. También forma parte de NS.
6. Simetría corporal (Prueba 5)
   1. Continúe desde la prueba 4 y deje que el mouse se mueva libremente sobre la superficie plana. Observa su eje de la nariz a la cola.
   2. La puntuación depende de los hallazgos de la siguiente manera: 0 para la postura normal con el tronco elevado desde el banco y la cola recta; 1 para "ligera asimetría" si el cuerpo se dobla ligeramente hacia un lado y la cola se dobla distalmente; 2 por "asimetría moderada" si la flexión o inclinación evidente del cuerpo hacia el lado contralesional con la cola y/o las extremidades proximales dobladas se estiran fuera del cuerpo; 3 para la "asimetría prominente" si se dobla el cuerpo marcadamente, un lado se apoya inconstantemente en el banco y la cola está claramente doblada proximalmente (más de 2); 4 Para "asimetría extrema" si el cuerpo está doblado, un lado está constantemente en el banco y la cola está muy doblada.
      NOTA: Detecta déficits sensoriomotores, unilaterales, troncales y de cola. También forma parte de la escala NS.
7. Evaluación de la marcha (Prueba 6)
   1. Continúe desde la prueba 5 y deje que el mouse se mueva libremente sobre la superficie plana. Observe ahora su marcha y compruebe si hay déficits motores de la marcha, como paresia, rigidez de las extremidades, marcha espástica, desramamiento.
   2. La puntuación en función de los hallazgos es la siguiente: 0 para la marcha normal si es exploratoria, simétrica y rápida con extremidades flexibles que se mueven "ocultas" bajo el cuerpo; 1 para la marcha rígida, inflexible y lenta de un ratón que se mueve libremente sin cojear; 2 para una cojera clara con movimientos asimétricos (izquierda-derecha); 3 para temblar, derivar o caer después de un empuje suave; 4 para no caminar espontáneamente (no camina más de 3 pasos cuando se estimula con un empuje suave).
      NOTA: Detecta déficits combinados de la marcha. También forma parte de NS.
8. Circulación obligatoria (Prueba 7)
   1. Sostén al ratón por la base de su cola para elevarlo de la superficie y déjalo caminar solo sobre sus extremidades delanteras. Observa su movimiento.
   2. La puntuación en función de los resultados es la siguiente: 0 para el movimiento lineal normal; 1 para la tendencia a girar hacia un lado; 2 para girar hacia un lado en círculos cerrados; 3 si gira hacia un lado con movimientos torpes o con lentitud no logra completar un círculo; 4 si no hay avance y la parte delantera del tronco descansa sobre el banco.
      NOTA: La prueba complementa la prueba de comportamiento circular (prueba 4, ver 2.5). Probablemente detecta déficits sensoriomotores y espaciales. También forma parte del sistema de puntuación NS.
9. Postura frente a fuerzas laterales (Prueba 8)
   1. Coloque el ratón en la palma de la mano, con el eje de la nariz de la cola (longitudinal) paralelo al eje de la palma sagital.
   2. Gire el ratón de adelante hacia atrás a una velocidad constante para inducir fuerzas perpendiculares a su eje longitudinal.
      NOTA: Esto obliga al ratón a mantener su posición vertical y a mantener el equilibrio contra las fuerzas laterales durante el balanceo. Su cuerpo normalmente no entra en contacto con la palma de la mano o los dedos.
   3. Observe visualmente y sienta cualquier contacto con la palma de la mano de los lados izquierdo y derecho del mouse mientras se equilibra contra el columpio. Compruebe si hay alguna caída asimétrica, toque en la palma de la mano o indicio de debilidad lateral.
   4. La puntuación depende de los resultados de la siguiente manera: 0 si el ratón se encuentra en una posición vertical normal con la espalda paralela a la palma y puede mantener el equilibrio contra el balanceo sin tocar fuertemente la palma; 1 si el ratón aplana su cuerpo durante el columpio para ganar estabilidad; 2 si una parte del ratón se encuentra o toca brevemente la palma de la mano durante el balanceo; 3 si el ratón se tumba de lado, apenas capaz de recuperar la posición vertical; 4 Si el ratón se encuentra en posición prona, no podrá recuperar la posición vertical.
      NOTA: El test detecta déficits posturales frente a la aceleración lateral, pero su puntuación puede ser subjetiva. También forma parte de mNSS, NS.
10. Colocación selectiva de las extremidades anteriores (Prueba 9)
    1. Sostenga el mouse desde su espalda o desde la base de su cola. Dirígelo perpendicular hacia el haz, que funciona como un "objetivo a alcanzar". Observe si hay simetría y "extracción" y agarre.
    2. Una vez que agarre la viga con firmeza, aléjela suavemente y observe si hay una "liberación" simétrica de las extremidades delanteras.
    3. La puntuación en función de los resultados es la siguiente: 0 para "alcance", agarre y "liberación" simétricos; 1 para cualquier asimetría en la "extracción" y/o "liberación", indicativa de debilidad contralesional de la extremidad anterior.
11. Déficit sensoriomotor de las extremidades anteriores (Test 10)
    1. Sostenga el mouse firmemente por la espalda y mire hacia él ventralmente (vea el video o la Figura 1e).
    2. Estimule las patas delanteras sucesivamente con una punta fina (por ejemplo, un palillo de madera) desde un ángulo ciego. Observa la reacción de la pata delantera.
    3. La puntuación depende de los resultados de la siguiente manera: 0 para el movimiento de agarre normal y rápido en ambos lados; 1 por la ausencia o el retraso evidente del agarre de forma contralesional.
       NOTA: Tanto el 2.10 como el 2.11 evalúan los déficits sensoriomotores finos de las extremidades anteriores. También forman parte de mNSS.
12. Caminar por la viga (Prueba 11)
    1. Coloque una viga de madera de 1 m de longitud (Tabla de materiales) para conectar dos superficies elevadas (por ejemplo, bancos, mesas) a una altura de 1-1,5 m sobre el suelo. Estabilice los bordes de la viga para evitar vibraciones o inestabilidad.
    2. Coloque el ratón en el centro de la viga con su eje nariz-cola paralelo a la viga (Figura 2e). Permita mantener el equilibrio o caminar libremente sobre la viga. Observe su equilibrio o paresia y caída de las extremidades.
       NOTA: El ratón debe ganar equilibrio en la viga antes de puntuarla. Sostenga un guante grueso debajo del animal (a una distancia aproximada de 15-20 cm) para protegerlo si se cae.
    3. La puntuación depende de los resultados de la siguiente manera: 0 si el ratón se equilibra y camina con una postura firme hacia un lado de la viga; 1 si se agarra al costado de la viga y no camina sobre ella; 2 si una extremidad se cae de la viga; 3 si dos miembros se caen de la viga; 4 si el ratón intenta mantener el equilibrio en la viga pero se cae (después de los 40 s); 5 si se cae entre los 20 y los 40 años; Puntúa 6 si cae sin intentar mantener el equilibrio o colgarse de la viga (<20s).
       NOTA: La prueba detecta déficits motores combinados de las extremidades anteriores, las extremidades posteriores y el tronco. También forma parte de la escala mNSS.
13. Sensación de bigote (Prueba 12)
    1. Coloque el ratón sobre una mesa abierta (como en las pruebas 4 y 5). Deje algo de tiempo para el alojamiento.
    2. Estimule sus bigotes izquierdo y derecho sucesivamente, con un hisopo de algodón delgado y de punta larga, desde un "ángulo ciego". Observe una respuesta rápida de giro de la cabeza hacia la estimulación.
    3. La puntuación depende de los hallazgos de la siguiente manera: 0 para el giro normal y rápido de la cabeza tras la estimulación, bilateralmente; 1 para una respuesta contralesional más lenta tras la estimulación; 2 por ausencia de respuesta contralesional (sin giro); 3 para la ausencia de respuesta contralesional y la respuesta ipsilesional más lenta; 4 para la ausencia de respuesta bilateral.
       NOTA: Evite la detección visual del algodón porque esto causaría falsamente un giro de cabeza ipsilateral. La prueba es técnicamente correcta solo cuando el ratón está "sorprendido" por la estimulación de los bigotes. La prueba también forma parte del SN y detecta déficits sensoriomotores de los bigotes (corteza de barril).
14. Escalada (Prueba 13)
    1. Utilice una superficie inclinada recubierta de goma, con un ángulo de 45° (Figura 2a) y coloque el ratón en su centro. Observa el esfuerzo del ratón por trepar.
    2. Puntuación en función de los resultados de la siguiente manera: 0 (normal) si el ratón sube rápidamente y sin esfuerzo a la parte superior de la superficie; 1 si trepa con esfuerzo, con debilidad en las extremidades; 2 si se agarra a la pendiente sin resbalar ni trepar; 3 si se desliza por la pendiente a pesar de los esfuerzos para evitar la caída; 4 si se desliza sin esfuerzo para evitar la caída.
       NOTA: La prueba también forma parte del NS y detecta la fuerza motora general.
15. Calcule la puntuación de fESS sumando todas las puntuaciones de las pruebas 1 a 13
    NOTA: la puntuación fESS de 0 indica un ratón normal, la puntuación máxima es 42. Los infartos grandes con lesiones estriadas y corticales suelen inducir puntuaciones >7-9. Examine y califique varios ratones normales antes de comenzar a evaluar los que han sido golpeados, para adaptarse a las variaciones del comportamiento normal y reducir la puntuación de fESS falsos positivos. Utilice el protocolo de vídeo proporcionado constantemente para la estandarización de la puntuación a lo largo de todo el experimento.

3. Componente general del ESS (gESS)

NOTA: Evalúe el gESS para detectar signos de "enfermedad general del ratón", por ejemplo, inflamación o infección, generalmente presentes durante las primeras 1-2 semanas después de la fMCAo. Utilice la hoja de anotación en el archivo complementario 2. Evalúe el gESS preferiblemente después de completar el fESS.

1. Coloque el ratón sobre una superficie plana (banco) y deje que se mueva libremente como en 2.5. Evalúe secuencialmente las siguientes puntuaciones.
2. Observa su pelaje. Puntuación según la hoja de puntuación gESS (puntuaciones 0-2, ver Ficha complementaria 2).
3. Compruebe la respuesta de sobresalto del ratón: sorprenda al ratón con un aplauso repentino desde un ángulo ciego, cuando está relajado. Verifique y puntúe la reacción de las orejas del ratón de acuerdo con la hoja de puntuación gESS (puntuaciones 0-2, ver Archivo complementario 2).
4. Evalúe visualmente los ojos del ratón relajado: compruebe si hay ojos abiertos/cerrados o presencia de moco. Puntuación según la hoja de puntuación gESS (puntuaciones 0-4, ver Ficha complementaria 2).
5. Observe la actividad espontánea general y el estado de alerta del ratón. Puntuación según la hoja de puntuación gESS (puntuaciones 0-4, ver Ficha complementaria 2).
6. Observe el comportamiento espontáneo general del ratón para detectar cualquier presencia de ansiedad, hiperexcitabilidad, agresión o girar a lo largo de su eje durante cualquier manipulación. Puntuación según la hoja de puntuación gESS (puntuaciones 0-4, ver Ficha complementaria 2).
7. Calcule la puntuación de gESS sumando las puntuaciones de todos los pasos anteriores (puntuación observacional, pasos 3.2. a 3.6).
   NOTA: La puntuación gESS no detecta los déficits focales inducidos por las lesiones de ictus ni se ve afectada por la mSU, como se ha mostrado anteriormente ¹³. Todas las pruebas están adaptadas de la escala NS ^9,15.

4. Cuantificación de los déficits de las extremidades anteriores con el Test del Cilindro

NOTA: La prueba del cilindro se describe anteriormente en detalle ^9,15,27 y no se describirá en detalle aquí. La prueba del cilindro es una prueba conductual independiente que cuantifica de forma imparcial los déficits de las extremidades anteriores (véase 4.2).

1. Ejecute la prueba siguiendo las instrucciones proporcionadas aquí¹⁵. Captura videos y analízalos como en ¹⁵. Mida el contacto de las primeras extremidades derecha e izquierda con las paredes. La figura 3a,b muestra imágenes de la configuración.
2. Calcule la lateralización del uso de la extremidad debido a la paresia contralesional (derecha) como porcentaje porcentual. Utilice la fórmula: % de preferencia por los pasos de la izquierda = [(izquierda - derecha) primeros contactos / (derecha + izquierda) contactos] x 100.
   NOTA: Ejecute una prueba de cilindro de referencia para cada mouse antes de inducir un derrame cerebral. Ejecute pruebas en puntos de tiempo de acuerdo con cada plan experimental.

5. Cuantificación de los déficits de las extremidades anteriores y traseras con la prueba de los peldaños de la escalera

NOTA: Construya el aparato para ratones de plexiglás (mostrado en la Figura 3c): un corredor de 1 m de largo con paredes de 20 cm de altura, peldaños de plástico (3 mm de diámetro) colocados a intervalos regulares de 15 mm (Figura 3c1) y una caja de "refugio" en el extremo distal. Coloque la ropa de cama de los animales en la caja del refugio para familiarizarse y algunas bolitas de comida o mantequilla de maní como recompensa. El ancho del pasillo debe ser de 10 cm y debe elevarse aproximadamente 30 cm del suelo.

1. Entrene a los ratones en el aparato 1-3 días antes de la línea de base del experimento. Ejecute el entrenamiento como se indica en los pasos 5.1.1 a 5.1.4.
   NOTA: El entrenamiento es necesario para acomodar a los animales a una velocidad constante y normal al caminar por el corredor de peldaños, sin paradas, giros o comportamiento exploratorio. Realizar el entrenamiento durante 2 días consecutivos (2 sesiones). Cada sesión de entrenamiento consta de 3 carreras (carrera = una sola caminata por todo el pasillo hacia el box del refugio). La recopilación de datos de referencia es necesaria para el seguimiento.
   1. Limpie los peldaños y las paredes antes de cada carrera con alcohol al 70%, para evitar olores y distracciones/paradas "exploratorias" del ratón.
   2. Coloque el ratón al principio del pasillo de peldaños de la escalera, frente a la caja de refugio, para iniciar una carrera. Deja que el ratón camine libremente hacia la caja de refugio al final del pasillo. No obligue al animal a caminar.
      NOTA: Las carreras durante el entrenamiento suelen ser muy variables en cuanto a duración y patrón de marcha. El objetivo del entrenamiento es una caminata estable hacia el cajón de refugio, generalmente dentro de los <10 segundos, sin paradas/giros, lo que se logra generalmente al final del segundo día de entrenamiento. Manipule al animal siempre con cuidado para evitar la inducción de estrés que distraerá el entrenamiento adecuado. Retire a los animales del corredor y vuelva a hacer la carrera si permanecen en el corredor y explore localmente durante >1 min, para evitar la habituación.
   3. Realiza la^1ª carrera de entrenamiento. Deje que el animal descanse en la caja de refugio durante 5 minutos después de la^1ª carrera.
      NOTA: Este tiempo de descanso prolongado permite que el ratón se familiarice con la caja de refugio y la perciba como un objetivo "de descanso/gratificante" a alcanzar. Lograr una "percepción gratificante" de la caja de refugio es crucial para el éxito de las carreras.
   4. Retire el ratón de la caja de refugio y realice la segunda y tercera carreras de entrenamiento como en 5.1.2. Permita un tiempo de descanso más corto en la caja de refugio al final de estas carreras (30-60 s), para evitar la habituación.
      NOTA: El entrenamiento se completa el día 2. Para el día 2, casi todos los animales aprenden a caminar por el corredor a un ritmo constante. Considere la posibilidad de excluir a los animales de la experimentación adicional si no están aprendiendo.
2. Ejecute el experimento en ratones entrenados. Pruebe ratones durante 2 carreras cada vez durante todos los puntos de tiempo del experimento y la línea de base.
   1. Realice las ejecuciones como se describe en los pasos 5.1.1 y 5.1.2. Permita un máximo de 5 minutos de tiempo de descanso entre las 2 carreras en el cajón de refugio.
   2. Use un teléfono inteligente (o una cámara equivalente) y un "palo selfie" para capturar videos (datos) de los animales en un ligero ángulo ventral y "ciego" desde cierta distancia (como se muestra en la Figura 3c2). Asegúrate de capturar las extremidades mientras el animal camina por el pasillo. No distraiga visualmente al ratón durante su carrera y siga sus extremidades durante su carrera (Figura 3c2).
   3. Registre ambas ejecuciones, pero utilice y analice los datos de la segunda ejecución.
   4. Mida el número de pasos de falla (caídas) entre los peldaños de cada extremidad (izquierda/derecha, extremidad delantera/posterior) (Figura 3c3), revisando el video utilizando cualquier software de reproducción multimedia con opciones de cámara lenta. Calcule la diferencia absoluta o porcentual entre los pasos de falla de las extremidades derecha e izquierda, por separado para las extremidades anteriores y traseras.
      NOTA: La segunda ejecución da resultados más fiables. Un ratón sano suele tener de 0 a 1 pasos de error arbitrarios por extremidad (derecha o izquierda) durante su segunda ejecución, lo que normalmente da un rango de diferencia de 0 ±1. Un ratón acariciado hará pasos de falla con su extremidad parética derecha (contralesional) (extremidad anterior o posterior), lo que resultará en una lateralización positiva "hacia la derecha". Un animal gravemente acariciado puede ser más lento o no completar la carrera durante los primeros 7-10 días después de un accidente cerebrovascular, sin embargo, logrará carreras adecuadas después y mostrará déficits severos.

La mSU, como se ha descrito anteriormente, comienza después de la operación fMCAo. Nuestros resultados representativos en las dos cohortes independientes de ratones con fMCAo accidente cerebrovascular y simulacro (Figura 4a) confirman el valor previamente demostrado de mSU, particularmente durante el período crítico entre los días 3 y 10¹³. En nuestras cohortes, la mortalidad se produjo en 3/15 animales de la cohorte 1 (ictus, 6 meses de seguimiento), 2/10 de la cohorte 2 (ictus, 14 días de seguimiento) y 0/6 de los animales operados simuladamente (Figura 4a) como parte de la fisiopatología del ictus (todos encontrados muertos durante las visitas matutinas), y se incluyeron en la puntuación. No se sacrificó a ningún animal según los criterios de valoración humanitarios predefinidos. Esta mortalidad aguda (10-15%) dentro de la fase A (inicial 24-48 h post-fMCAo) (Figura 4a) se atribuyó al edema hemisférico y a la hernia resultante de grandes accidentes cerebrovasculares^{territoriales 13}, y se esperaba como parte del modelado traslacional del ictus. La mortalidad tardía durante la fase B (1/15 para la cohorte 1, 1/10 para la cohorte 2) añadió un máximo del 5-10% según el protocolo mSU (Figura 4a) y suele ocurrir en animales con ictus muy grandes que no pueden ser rescatados a pesar del apoyo de la mSU. Esto también traduce directamente la gravedad de la mortalidad humana después de un accidente cerebrovascular²⁹. La ausencia de aplicación de mSU o la baja adherencia a sus principios resulta en un aumento de la mortalidad en fase B que puede alcanzar incluso el 60-90%¹³. La fase C normalmente está desprovista de mortalidad adicional.

Tras la aplicación de la mSU, los ratones con grandes accidentes cerebrovasculares sobreviven más allá de la fase crítica B y muestran déficits neurológicos significativos. Nuestros datos muestran que el uso estandarizado de fESS detecta y cuantifica tanto los déficits inducidos por fMCAo como la mejora espontánea en ratones (Figura 4b), y supera o coincide con escalas anteriores como la focal Neuroscore (NS), la mNSS y la escala de Bederson (BE) 9,10,12,14. Si bien no es directamente comparable estadísticamente, la fESS muestra una sensibilidad similar o mayor en la fase aguda, captura la mejoría neurológica espontánea después de la fMCAo y permanece sensible al déficit hasta 6 meses después del accidente cerebrovascular, en comparación con las otras escalas. Esto apoya su uso para la puntuación traslacional y sensible después de un golpe de ratón y el protocolo de vídeo actual garantiza una mayor objetividad de la puntuación.

Además de la fESS, las pruebas de escalón y cilindro pueden complementar la puntuación y el seguimiento neurológico a largo plazo mediante la cuantificación de la paresia de las extremidades anteriores y posteriores. Cada prueba requiere aproximadamente 5-7 minutos por animal para la adquisición de video y 5-15 minutos para el análisis manual de video. Los resultados representativos son el aumento de las caídas de las extremidades entre los peldaños a medida que el ratón camina en la prueba de los peldaños de la escalera (lo que da lugar a un % de lateralización a la derecha para el trazo izquierdo), y un toque "preferido" de la pared con la extremidad delantera izquierda sana para la prueba del cilindro (lo que da como resultado un % de lateralización a la izquierda para el trazo izquierdo). Nuestros datos representativos para la cohorte de 6 meses muestran que la prueba de escalera-peldaño puede detectar la paresia de las extremidades anteriores en las fases aguda/subaguda, pero pierde su sensibilidad debido a la mejoría espontánea posterior (Figura 4c, p<0,05 para el tiempo y p<0,01 para la diferencia de grupo, modelo de efectos mixtos), sin embargo, sigue siendo más robusta en la detección y cuantificación de la paresia de las extremidades posteriores hasta 6 meses (Figura 4d, p<0.05 para diferencia de grupo, modelo de efectos mixtos). Paralelamente, la prueba de cilindros conserva una excelente sensibilidad en la detección de la paresia de las extremidades anteriores hasta 6 meses después de la fMCAo (Figura 4e, p<0,001 para diferencia de grupo, modelo de efectos mixtos). Combinadas, ambas pruebas detectan, cuantifican y controlan eficazmente la paresia de las extremidades anteriores y traseras a largo plazo.

Figura 1. Protocolo de soporte post-fMCAo mSU. (A) Herramientas y materiales utilizados para mSU. (B) pulverización de alimentos normales (con licuadora de alimentos u otro dispositivo) y fabricación de alimentos en gel para soporte de alimentación activo (con jeringa) y pasivo (placa de Petri). (C) el alimento en gel y los gránulos sólidos deben colocarse (y reemplazarse diariamente de forma fresca) en la jaula de los animales pocos días antes (para el alojamiento) y después de la fMCAo; Se espera que los animales escondan la comida en gel debajo de la ropa de cama. (D) agarre activo para la alimentación con jeringa (las flechas rojas apuntan a la estabilización de la mejilla izquierda con los dedos, la punta de flecha apunta al agarre del pelaje). (E) inserción de la jeringa en la boca, apuntando a la mejilla derecha (flecha). (F) Vitrina de la medición de la temperatura de la superficie corporal (área roja y punta de flecha en el centro del cuerpo ventral para la medición de la temperatura). (G) tapón de uretra (flecha). (H) Cronograma sugerido para los experimentos de accidente cerebrovascular crónico bajo el apoyo de mSU (bsl: línea de base, h: horas, d: días y m: meses como puntos de tiempo de evaluación), con puntuación sugerida utilizando pruebas ESS, de escalón y de cilindro. Esta línea de tiempo se ha utilizado aquí para las cohortes 1 (seguimiento de 6 meses) y 2 (seguimiento de 14 días). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. La escala experimental del ictus. (A) Herramientas para la realización de pruebas de ESS, (B) cortes representativos de cerebro con trazo (mitad izquierda, tinción de Nissl) y su correspondiente superposición del mapa de Allen Brain correspondiente, en bregma +1,0 y -0,3 mm anteroposterior (Esta cifra ha sido modificada a partir de Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org y atlas.brain-map.org)³⁰. (C) Suspensión del animal por la base de la cola para las pruebas de simetría de las extremidades anteriores, las extremidades posteriores y el tronco de fESS, los círculos punteados grises muestran la simetría normal de las extremidades anteriores y posteriores. (D) Clara asimetría de la extremidad posterior derecha parética (posición/extensión asimétrica). (E) posición normal de un animal en la viga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Configuración de pruebas de peldaños y cilindros. (A) configuración de la prueba de cilindro, un mouse está en el cilindro mientras que los espejos verticales facilitan la vista de 360 ° de sus extremidades delanteras. (B) vista cercana del animal con un contacto de la extremidad delantera izquierda (uso) con la pared del cilindro. (C) ver y diseñar detalles de la prueba de peldaños de escalera para ratones (consulte también el texto para conocer las dimensiones y las instrucciones de construcción); (C1) muestra un ratón normal en el pasillo de los peldaños de la escalera desde arriba, (C2) muestra un ratón normal con un paso correcto en los peldaños (sin caídas), (C3) muestra una caída de la extremidad anterior entre los escalones (las imágenes se capturan de vídeos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Supervivencia a largo plazo y déficits neurológicos después de fMCAo. (A) Replicación de la efectividad de mSU en dos cohortes de animales independientes: en la primera se observaron ratones durante 6 meses y en la segunda se observó a los animales durante 14 días después del accidente cerebrovascular. (B) Puntuaciones de diferentes escalas neurológicas bien establecidas para ambas cohortes. (C) Déficits motores de las extremidades anteriores y (D) posteriores del lado derecho (= pasos en falso derecho - izquierdo, para las extremidades anteriores y traseras respectivamente) detectados por la prueba de peldaños de escalera en nuestra cohorte de animales de 6 meses, frente a animales operados simuladamente. (E) Resultados de asimetría de las extremidades anteriores (como porcentaje de preferencia por el uso de la extremidad delantera izquierda sana) detectados por la prueba del cilindro en nuestra cohorte de animales de 6 meses, frente a animales operados simuladamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Interfaz de software: Ejemplo de 3 animales con su cálculo diario de puntuaciones RSS. Las acciones y RSS se aplican para las Fases B y C. Haga clic aquí para descargar esta Tabla.

Figura complementaria S1. Definición del Score de Estratificación de Riesgo (RSS) diario y las acciones de apoyo resultantes para cada animal. Los animales con puntuaciones de 0 a 1 tienen un riesgo de mortalidad mínimo, mientras que los de 5 a 6 tienen un riesgo de mortalidad máximo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 1. Plantilla propuesta para el seguimiento y la documentación de los animales durante la operación de fMCAo y el seguimiento de la mSU. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 2. Propuesta de hoja de puntuación para el SEE focal y general. Haga clic aquí para descargar este archivo.

El presente protocolo es una guía completa del protocolo de soporte de mSU, diseñado para reducir la mortalidad artefactual entre los días 3 y 10 en ratones sometidos a grandes accidentes cerebrovasculares territoriales mediante el modelo fMCAo¹³. Además, el presente protocolo incluye una guía de video estandarizada para el componente focal de la escala ESS (fESS) para reducir la subjetividad extendida y el sesgo de la puntuación focal neurológica en ratones después de un accidente cerebrovascular. Junto con esto, presentamos la prueba de peldaños para cuantificar los déficits motores contralesionales de las extremidades anteriores y posteriores a largo plazo (hasta 6 meses).

La mSU es fácil de usar y eficaz. Nuestro protocolo asistido por vídeo hace que mSU sea fácil de aplicar incluso para investigadores sin experiencia. Las 3 fases de la mSU (a saber, la fase A, B y C, véase la sección 1 del protocolo anterior y la figura 1h) se definen empíricamente para adaptar su evaluación y las medidas de apoyo. El mSU adapta sus intervenciones diariamente de acuerdo con cada fase y en función de la puntuación de la puntuación de estratificación de riesgo (RSS) de cada ratón. Esta puntuación refleja su gravedad clínica, proporciona una estimación de su riesgo real de mortalidad y guía su soporte personalizado por ratón. Complementariamente, la mera observación clínica del animal siempre debe añadir información para un apoyo personalizado de la mSU. Eventualmente, mSU implementa traslacionalmente componentes clave del apoyo de la Unidad de Accidente Cerebrovascular (SU) humana, incluido el control de la temperatura, el equilibrio de líquidos, la prevención/tratamiento de infecciones, el soporte nutricional y la normoglucemia ^1,2,7, durante la fase crítica de los primeros 3-10 días posteriores a la MCAo fMCAo en ratones¹³. Es importante destacar que la efectividad de la mSU para reducir la mortalidad artificial del 60-90% al <15%^13,31 se ha reproducido con éxito en grupos de investigación independientes 17,18,32,33.

Varios pasos críticos son esenciales para el éxito del protocolo mSU. En primer lugar, si bien la mSU se basa en una observación clínica cercana y un apoyo óptimo a los animales, es aconsejable contar con un equipo de al menos dos investigadores que trabajen por turnos para reducir la carga de trabajo, aunque un investigador también puede gestionarlo solo. En segundo lugar, los puntos horarios más críticos para el soporte son alrededor de las 22:00 y las 08:00, correspondientes al inicio y final del aumento nocturno de la actividad del ratón, cuando las demandas de energía son mayores 13,22,23. En tercer lugar, de acuerdo con las directrices clínicas actuales sobre el ictus⁷, la suplementación con glucosa debe adaptarse cuidadosamente y ser mínima para evitar la hiperglucemia neurotóxica posterior al ictus. En cuarto lugar, la alimentación activa debe llevarse a cabo en bloques de 5 a 10 animales administrando bocados de 40 a 60 μl en escalones, para equilibrar la reducción de la carga de trabajo con una alimentación eficaz. Por último, la intensidad de mSU debe adaptarse a las necesidades de cada ratón y a la puntuación RSS, en función de la gravedad del trazo. Esto significa que los ratones con accidentes cerebrovasculares pequeños pueden necesitar un apoyo más corto y menos intenso, mientras que aquellos con accidentes cerebrovasculares más grandes pueden necesitar apoyo incluso más allá del día 14 para mitigar el riesgo de muerte.

La puntuación neurológica en ratones siempre ha sido muy subjetiva y desafiante debido a su pequeño tamaño y dificultad para detectar déficits. Debido a esto, todas las escalas de accidente cerebrovascular anteriores (BS, mBS, LS, mNSS, GS, NS, ver también introducción) detectan signos crudos (p. ej., las escalas de 3 a 5 puntos de BS, mBS y LS), mezclan los síntomas focales con los síntomas generales posteriores al accidente cerebrovascular (p. ej., NS), no logran capturar déficits sutiles más allá de la fase aguda del accidente cerebrovascular ^8,9 (p. ej., el BS de 3 puntos ¹⁰, el mBS de 5 puntos ¹¹ o el^{LS 6} de 5 puntos), o no cuantifican la mejoría espontánea a largo plazo después de un accidente cerebrovascular. Para mejorar todo esto, previamente¹³ desarrollamos el ESS (fESS/gESS) combinando críticamente u omitiendo componentes de escalas anteriores, creando una herramienta capaz de evaluar las áreas comúnmente afectadas por el modelo fMCAo²⁰ (Figura 2b). Ahora, además, proporcionamos la primera estandarización de video de fESS para ofrecer orientación visual y resolver la limitación de larga data de la subjetividad en laboratorios e investigadores. Nuestros datos respaldan que el fESS supera a las escalas mBS y mNSS o es igual al NS (Figura 4b) en la detección de déficits focales relacionados con el accidente cerebrovascular en ratones, al tiempo que captura la recuperación espontánea a largo plazo posterior al accidente cerebrovascular. La estandarización de video proporcionada sirve ahora como una herramienta de entrenamiento confiable para la evaluación consistente de los déficits posteriores a un accidente cerebrovascular.

Como complemento a la fESS, recomendamos utilizar la prueba de escalera-peldaño y la prueba de cilindro¹⁵ descrita anteriormente como batería de pruebas para cuantificar la paresia de las extremidades anteriores y traseras o las mejoras correspondientes a largo plazo (hasta 6 meses). Para el análisis de extremidades intraanimales, son necesarias evaluaciones de referencia para ambas pruebas. La prueba de peldaño de escalera, utilizada anteriormente en ratas ^34,35, ha sido adaptada y descrita aquí para ratones. En la práctica, la prueba depende críticamente de un patrón de marcha estable en el corredor de peldaños, sin giros ni paradas. Para ello, recomendamos analizar la segunda ejecución en cada punto de tiempo, ya que suele producir el patrón de marcha más estable. El entrenamiento adecuado sin habituación es crucial para obtener resultados confiables, como se describe en el protocolo anterior. Una limitación de las pruebas de escalón y cilindro es que los ratones con grandes carreras pueden no moverse en absoluto durante la fase A-B (días 3 y 7 en la Figura 4c-e), por lo que no proporcionan datos y aumentan la varianza; estos ratones a menudo muestran pasos de falla máximos durante la fase C. Para superar esta limitación y minimizar el estrés de los animales, sugerimos probar ratones desde el final de la Fase B en adelante (por ejemplo, > día 10). Otra limitación es el hecho de que la prueba de peldaños de escalera parece perder su sensibilidad para los déficits de las extremidades anteriores, pero esto se compensa con la prueba del cilindro. Eventualmente, estas pruebas combinadas pueden cuantificar objetivamente los déficits de las extremidades anteriores y posteriores y su mejora espontánea a largo plazo.

En conclusión, recomendamos el mSU como estándar de atención para los modelos de trazo de ratón traslacional. Al mismo tiempo, recomendamos la prueba ESS (fESS/gESS), la prueba de peldaño de escalera y la prueba de cilindro como una batería de pruebas simple, eficiente en el tiempo, rentable y cuantitativamente sensible para cuantificar los déficits de carrera a largo plazo en ratones. Eventualmente, mSU podría aplicarse en el futuro en cualquier otro modelo de ratón que incorpore lesiones cerebrales graves (por ejemplo, lesión cerebral traumática, modelos de hemorragias cerebrales, etc.), donde se necesite un apoyo intensivo y clínicamente traslacional del ratón.

No hay divulgaciones que informar.

Nos gustaría agradecer a Nikolaos Plakopitis y Ioannis Tatsidis por su valioso apoyo quirúrgico durante partes del estudio.