SARS-CoV-2 Tespiti için Yüksek Performanslı Grafen Modifiye Algılama Çipi

Mevcut protokol, viral proteinleri (Fg seviyesinde) doğru bir şekilde tespit etmek için yararlı nanosistemlere dayalı düşük maliyetli biyo-algılama prototiplerinin üretimini açıklamaktadır. Bu kadar küçük bir sensör platformu, teletıp hedeflerini karşılamak için Tıbbi Nesnelerin İnterneti (IoMT) ile entegre edilebilen bakım noktası uygulamalarına olanak tanır.

Bu algılama prototip modeli, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 virüsünü (SARS-CoV-2) spesifik ve hızlı bir şekilde tespit etmek için yeniden kullanılabilir, iki katlı grafen oksit (GrO) sırlı çift sayısallaştırılmış kapasitif (DIDC) tespit çipinin geliştirilmesini içerir. Fabrikasyon DIDC, virüsün spike (S1) proteinine dayalı olarak SARS-CoV-2'ye düşman antikorları (Abs) hareketsiz hale getirmek için EDC-NHS ile kimyasal olarak daha da modifiye edilen grafen oksit (GrO) ile sırlanmış Ti/Pt içeren bir cam substrat içerir. Kapsamlı araştırmaların sonuçları, GrO'nun Ab immobilizasyonu için ideal bir mühendislik yüzeyi sağladığını ve daha yüksek hassasiyet ve düşük algılama limitlerine izin vermek için kapasitansı geliştirdiğini gösterdi. Bu ayarlanabilir elemanlar, geniş bir algılama aralığı (1,0 mg/mL ila 1,0 fg/mL), minimum 1 fg/mL algılama sınırı, yüksek yanıt verme ve 18,56 nF/g'lik iyi doğrusallık ve 3 s'lik hızlı tepki süresi elde edilmesine yardımcı oldu. Ayrıca, finansal olarak uygulanabilir bakım noktası (POC) test çerçevelerinin geliştirilmesi açısından, bu çalışmada GrO-DIDC biyoçipinin yeniden kullanılabilirliği iyidir. Önemli bir şekilde, biyoçip kan yoluyla bulaşan antijenlere karşı spesifiktir ve 5 ° C'de 10 güne kadar stabildir. Kompaktlığı nedeniyle, bu küçültülmüş biyosensör, COVID-19 enfeksiyonunun POC teşhisi potansiyeline sahiptir. Bu sistem aynı zamanda diğer ciddi viral hastalıkları da tespit edebilir, ancak diğer virüs örneklerini kullanan bir onay adımı geliştirilme aşamasındadır.

Yeni bir beta koronavirüs^1'in (yani 2019-nCoV) neden olduğu ve daha sonra şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)² (bundan sonra ağırlıklı olarak virüs olarak anılacaktır) olarak adlandırılan, pnömonik bir küme ve şiddetli akut solunum sıkıntısı içeren viral bir pandemi, 2019'un sonunda Çin'in Wuhan şehrinde ortaya çıktı³. Dünya çapında insandan insana hızlı bulaşması, yüksek enfeksiyon oranı, yüksek ölüm oranı ve yaşamı tehdit eden ciddi yan etkileri⁴ nedeniyle, pandemi sırasında viroloji araştırmaları⁵ virüsün genomik organizasyonunu ve yapısını tanımlamak için hızla gelişti ^5,6. COVID-19 ^7,8'in semptomları arasında yüksek ateş, kuru öksürük ve yaygın ağrı^{bulunur 9}. Daha da önemlisi, virüsün farklı serotipleri farklı hastalık şiddetlerine yol açar¹⁰. Ayrıca, asemptomatik taşıyıcılar virüsü potansiyel olarak yayabilir. Genellikle, mikroskop altında, COVID-19 virüs parçacıkları, spike proteinleri¹¹ tarafından oluşturulan kulüp benzeri projeksiyonlar gösterir. Bu nedenle, bu yeni patojenin yayılmasını kontrol etmek için vakaların tespiti zamanında ve verimli olmalıdır. Bu nedenle, viral enfeksiyonun erken aşamalarında virüsün ultra hassas, hızlı ve seçici tespiti çok önemli hale gelmiştir ^2,11. Virüsün¹² bulaşmasını önlemek için sosyal/fiziksel mesafeye ihtiyaç vardır. Sağlık kurumları, akıllı teşhis araçlarının ve nano sistemlerin geliştirilmesine vurgu yapıyor¹³. Gerçekten de, sağlık kurumlarının önerdiği gibi, hedefli ve toplu test^14,15 gereklidir ve hala talep edilmektedir.

Prensip olarak, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gibi devam eden biyolojik tanı yöntemleri, Orta Doğu solunum sendromu ile ilişkili koronavirüs (MERS-CoV)¹⁶ ve SARS-CoV-1^17'de olduğu gibi SARS-CoV-2'nin toplu olarak tanımlanması için en iyi araçtır. Bu bağlamda, SARS-CoV-2 kontaminasyonunun mevcut standart tanımlaması, enfeksiyona özgü özelliklerin^{geliştirilmesine bağlıdır 18,19}. Ek olarak, SARS-CoV-2 enfeksiyonundaki bölgeye, yaşa, ırka ve cinsiyete göre varyasyon dikkate alınmalıdır. Hayat kurtarma nihai hedefiyle, bakım noktası (POC)^20,21 kullanımı için hızlı tanı araçları oluşturmak çok önemlidir.

Bu bağlamda, floresan in situ hibridizasyon (FISH), protein immünosorbent incelemesi (ELISA), mikroküre tabanlı yöntemler, elektrokimyasal testler ve MRI, PET ve NIRFOI²² gibi düzenli stratejilerin düşük virüs seviyelerine duyarlılığı, düşük seçiciliği ve düşük yeniden kullanım kapasitesi vardır; Ek olarak, bu tür prosedürlerin maliyetli biyo-algılama teşhis sistemleri, yeniden kullanılamayan reaktifler ve yüksek vasıflı bir işgücü gereksinimi dahil olmak üzere dezavantajları vardır²³. Bu nedenle, bu anlayışlı teknikler hızlı, makul, istisnai olarak spesifik veya hassas POC yöntemleri olarak görülemez ^24,25. Dikkat çekici bir şekilde, bileşik, kapasitif ve elektrik tekniklerini kullanan farklı türde DNA ve bağışıklayıcı tabanlı biyosensörler vardır 18,26,27,28. Örnek olarak, Ebola³¹, Zika, MERS-CoV ve SARS-CoV^32,33,34'ün tespiti için yüksek duyarlılığa sahip, basit bir şekilde küçültülebilen ve ayarlanabilir^29,30 olan elektriksel DNA biyosensörleri üretilmiştir. Benzer şekilde, grafen sırlı cihazlar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş belirli antikorları (monoklonal) kullanarak virüsün spike proteinini tespit etmek için bir alan etkili yarı iletken (FET) biyosensörü etkili bir şekilde oluşturulmuştur^35,36. Bununla birlikte, bu yeni strateji RT-PCR'den daha az hassastır. Ayrıca, daha yakın zamanlarda, virüs için düşük bir tanımlama sınırına (2,8 ^{× 10-15} M) sahip olan, aerosol jet nanopartikül ile azaltılmış grafen oksit (GrO) kaplı bir 3D terminal tabanlı algılama çerçevesi geliştirilmiştir; her durumda, önerilen karmaşık biyosensör yapısı³⁵, POC kullanımı açısından test edilmiş ve virüsün 35,37,38 tespiti için kullanılan diğer mevcut biyosensör stratejileriyle karşılaştırılmıştır.

Bu çalışmada, diğer biyosensörler için yukarıda belirtilen sınırlamalar olmaksızın virüs spike proteinini tanımlamak için küçültülmüş ve yeniden kullanılabilir bir GrO tabanlı DIDC biyosensörü tasarladık ve ürettik. Bu biyosensör, yanıt süresinin 3 s ^18,27'si içinde femtogram (fg) seviyesinde algılamaya izin verir. Bu araştırmayı gerçekleştirmek için, daha iyi yanıt verme ve seçicilik için GrO nanopulları seçildi, bu da orofaringeal veya nazofaringeal sürüntülerden virüs antijen proteininin düşük konsantrasyonlarının tespit edilebileceği anlamına geliyor. GrO, biyoalgılama uygulamaları için faydalı bir şekilde kullanılabilecek^uygun, sentetik olarak güvenilir, tutarlı ve iletken bir malzemedir 2,39,40,41. Ek olarak, virüs spike S1 proteinine odaklanan bir monoklonal IgG antikoru etiketsiz hibridizasyon yaklaşımı kullanıldı. Fabrikasyon SARS-CoV-2-GrO-DIDC biyosensörü, piranha çözeltisi ile ileri tedavi ve temizlikten sonra tekrar kullanılabilir. Bu ultra hızlı, hassas, seçici, etiketsiz ve yeniden kullanılabilir biyosensör, klinik numune biyoalgılama ve kişiselleştirilmiş sağlık hizmetleri uygulamaları için kullanılabilir 26,42,43,44.

1. DIDC algılama çipinin temizlenmesi

1. Deneyin başında, DIDC talaş yüzeyini²⁶ pirana çözeltisi (H₂SO₄: H₂O₂3: 1 oranında) ile temizleyin ve 15 dakika boyunca 80 ° C'de sıcak plakaya yerleştirin. Ardından, temizleme reaktiflerini tamamen çıkarmak için sensör yüzeyini bir pipet kullanarak damla damla damıtılmış su ile durulayın. Reaktifin tamamen çıkarılmasını sağlamak için, yüzeyi dört ila beş damla etil alkol ile durulayın.
   NOT: DIDC çipi, daha önce yayınlanmış bir raporun²⁶ ardından üretilmiştir.
2. Ardından, hidrofilik bir sensör yüzeyi elde etmek için reaktiflerin tamamen çıkarılması için sensör yüzeyini oda sıcaklığında kurutun. Bu çip, çip üzerindeki grafen oksit tabakasının daha fazla imalatı için kullanılabilir (adım 2).
3. Temiz sensör çipi elektrot pedlerini poliimid bantla kapatın.

2. DIDC algılama çipi üzerinde ince grafen oksit tabakasının imalatı

1. Çipi yatay konumda spin kaplama makinesinin ortasına yerleştirin ve çip yüzeyine 4 μL sulu bir ticari olarak temin edilebilen tek katmanlı grafen oksit (GO) çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Ardından, döndürme kaplama haznesini kapatın ve 1.300 rpm'de 2 dakika çalıştırın.
2. Fabrikasyon GO çipinin tavlanması için, çipi 80 °C'de 40 dakika boyunca sıcak plaka üzerinde yatay olarak tutun.

3. GO camlı DIDC algılama çipinin çapraz bağlanması ve işlevselleştirilmesi

1. N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC) ve NHydroxysuccinimid'in (NHS) ince film GO çipi ile çapraz bağlanmasını gerçekleştirin.
   1. Amin ve karboksilik grupların amid bağı oluşumu²⁶ yoluyla kovalent konjugasyonunu oluşturmak için ince film GO çipine 4 μL (sırasıyla 0,4 M ve 0,1 M) EDC-NHS (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.

4. Protein algılama için çip üzerinde antikor hazırlama ve immobilizasyon

1. İşlevselleştirilmiş GO-DIDC çipini antikorla bağlamak için, seyreltme tamponunu (% 0.1 BSA [sığır serum albümini] ve% 0.86 NaCl içeren 0.01 M PBS) kullanarak ticari olarak temin edilebilen anti-SARS-CoV-2 Abs'yi (tavşan mAb anti-S1 proteini tarafından çoğaltılır, Malzeme Tablosuna bakınız) çözün.
   1. 1 μg saflaştırılmış antikora 1 mL seyreltilmiş PBS ekleyin. Ardından, 4 μL antikor solüsyonunu çapraz bağlı aktive edilmiş GO-DIDC çipi üzerine bırakın. Abs'yi oda sıcaklığında işlevsel talaş yüzeyine bağlamak için çipi 2 saat kapalı haznede bırakın.
      NOT: Abs'nin Fab bölgesi, polar doğası nedeniyle genellikle bol miktarda reaktif amin ve karboksilik gruplardan oluşur²⁶; bu nedenle, müteakip spesifik immobilizasyon, sağlam kovalent "kuyrukta" Ab-spesifik oryantasyona yol açar.
2. Sensör yüzeyindeki antikor immobilizasyonu yapıldıktan sonra, immüno-kapasitif algılama çipinin spesifik olmayan bölgelerini bloke etmek için çipin üzerine 4 μL sığır serum albümini (BSA) damlatın. Çipi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kapalı hazneye yatay olarak yerleştirin.
3. İmmüno-kapasitif algılama çipini DI suyla yıkayın ve ardından oda sıcaklığında kurutmaya devam edin.
   NOT: Kuruduktan sonra, DIDC tabanlı kapasitif immünosensör (SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDC'ler) virüs spike antijeninin seri tespitini gerçekleştirmeye hazırdır.
4. Virüs spike proteininin daha fazla algılanması için, geniş bir tespit limiti elde etmek için 1.0 mg ila 1.0 fg arasında farklı konsantrasyonlar hazırlayın.

Burada, SARS-CoV-2 virüsünün S1 proteinini grafen oksit sırlı çift sayısallar arası kapasitif (DIDC) algılama çipi kullanarak algılamak için bir protokol sunulmaktadır. Şekil 1 , son derece hassas ve geri dönüştürülebilir grafen oksit modifiyeli çift sayısallaştırılmış kapasitif (DIDC) algılama çipinin şematik bir temsilini (devre düzeni ile fabrikasyon) göstermektedir. Ayrıntılı adım adım imalat süreci Şekil 2'de gösterilmektedir. Şekil 3 , atomik kuvvet mikroskobu (AFM) aracılığıyla yüzey işlevselliği karakterizasyonunu temsil etmektedir. Fabrikasyon çipin tipik bir üstten görünümü, FTIR spektroskopik karakterizasyonu ve yüzey temas açısı Şekil 4'te gösterilmektedir. Şekil 5 , metal elektrotlar ile öngörülen prototip arasındaki elektrik alanını bozan S1 antijeninin biyomoleküllerini, DIDC çipinin hassasiyetini, DIDC çipinin seçiciliğini, doğrusallık için konsantrasyona karşı kapasitans grafiğini (18.56 nF/g) ve çoklu konsantrasyonların tepki sürelerini göstermektedir. Şekil 6 , zaman (saat olarak) ve günlere göre sabitlik ve tekrarlanabilirlik değerlendirmesini göstermektedir. Şekil 7 , rejenerasyondan sonra DIDC çipinin yeniden kullanılabilirlik testi sonuçlarını göstermektedir. Şekil 8 , geri dönüştürülebilir DIDC çiplerinin kapasitansa karşı virüs spike (S1) antijen algılama performansı açısından Nyquist grafiklerini sunmaktadır. Aşamalı üretim süreci AFM ve SEM karakterizasyonu ile analiz edildi ve kimyasal bağlama ve işlevselleştirme FTIR ile analiz edildi.

Öngörülen biyosensörümüzün şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 1A ve B'de temsil edilen oluşturulan SARS-CoV-2 S1 protein biyosensörü, yukarıda belirtilen bileşenlerle iki katlı GrO tabanlı çift sayısallaştırılmış kapasitif (DIDC) çip özelliklerini sergiledi; üretilen iki katlı interdigitated capacitor (DIDC) çipinin aynı devre formatı Şekil 1C'de gösterilmektedir. CL, ana anotlar için kapasitörleri temsil eder ve CS, seri olarak bağlanmış küçük odak terminalleri için kapasitörleri temsil eder; Çipin genişliği ve uzunluğu sırasıyla 4,1 mm ve 5 mm'dir. Virüs S1 antijen proteinini (belirlenmiş analit olarak) kısıtlayan hareketsizleştirilmiş anti-SARS-CoV-2 Abs'ye sahip GrO tabanlı DIDC tespit çipi Şekil 1D'de gösterilmektedir. Elektron mikroskobu (SEM) ile 1 μm ölçeğinde GrO'ya implante edilen anti-SARS-CoV-2 Abs'nin morfolojik incelemesi Şekil 1E'de gösterilmiştir; AFM'den alınan ek resim, grafen oksit pullarının 25 nm seviyesinde benzer şekilde dağıldığını gösteriyor. Şekil 1F , ortaya çıkarılan bir çipin taramalı elektron mikroskobu görüntüsünü göstermektedir ve iki metal parmağın (yani 20 μm) tahmini Şekil 1G'de sunulmuştur.

Daha da önemlisi, virüs S1 proteininin DIDC tabanlı tespiti için biyosensör üretimi, dielektrik sabiti, iletkenlik ve yük dağılımı^18,45 gibi belirli temel unsurlara bağlıdır. Tespit proteini, DIDC biyosensörü üzerine yerleştirilir ve bağışıklayıcı ve antijen ile anahtar eleman, DIDC kapasitif reaktansa kıyasla sınırları tespit edecek şekilde modifiye edilir. Yönlendirilmiş keşif çalışma sürecinin şematik bir tasviri Şekil 2A-E'de gösterilmiştir. DIDC, Şekil 0.2A'da veri analizi için bir PC ile bir LCR ölçer (el tipi, 200 GΩ, 2 pF, 1 kHz, 2 kH, U1730C serisi) kullanılarak değerlendirildi. DIDC biyosensörü boyunca 1 kHz frekanslı 0 V DC voltaj uygulandı. İlk olarak, sensör alanı, 80 ° C'de 3: 1 oranında (H₂SO₄: H₂O₂) bir piranha çözeltisi ile temizlik ile kuruldu ve daha sonra, önceki araştırmada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hidrofilik reaktifleri ortadan kaldırmak için alan DI suyu ile temizlendi^46,47. Çalıştırma etkileşiminden sonra, yüzey bir spin-kaplayıcı vasıtasıyla 1.300 rpm'de GrO (4 μL) ile imal edildi (Şekil 2B). Daha sonra, DIDC çipi üzerindeki grafen oksit, çip 80 °C'de 1 saat boyunca sıcak bir plaka üzerine yerleştirilerek güçlendirildi. Temperleme işleminden sonra, EDC-NHS kimyası (4 μL; 0.4M ve 0.1 M,), Şekil 2C'de ele alındığı gibi, amid bağı³⁵gelişimi yoluyla amin ve karboksilik grupların kovalent oluşumunu oluşturmak için yükseltilmiş bir döngü kullanılarak⁴⁸ gerçekleştirildi. Daha sonra, 0.1 M reaktan tamponu ve 1 μg/mL dekontamine nötrleştirici ile bir sulandırma tamponu kullanıldı. Abs virüsünün oluşumu için (S1 proteinine düşman tavşan mAbs tarafından çoğaltılır), NHS ile yürürlüğe giren grafen oksit üzerine 4 μL'lik bir damlacık eklendi (Şekil 2D). Dikkat çekici bir şekilde, antikorların Fab alanı, polar doğası nedeniyle genellikle birçok alıcı amin ve karboksilik grup içerir; bu şekilde, ilerleyici açık immobilizasyon, Şekil 2E'de karakterize edildiği gibi sağlam kovalent "kuyrukta" Ab'ye özgü oryantasyon²⁶ ile sonuçlanır. Önemli bir şekilde, sığır serum albümini (BSA) ile tedavi, algılama çipinin spesifik olmayan bölgelerini bloke etmek için oda sıcaklığında 20 dakika çalkalanarak kullanıldı. Kuruduktan sonra, virüs spike antijenini sıralı olarak tespit etmek için DIDC (SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-Glass-DIDCs) bazlı kapasitif immünosensör^49,50 hazırlandı.

DIDC çipinin yüzey morfolojisini değerlendirmek için, çıplak çip veya grafen oksit ile ilgili olarak, S1 Abs virüsüne ve virüs spike antijenine düşman olan EDC-NHS aktivasyonu, AFM ve SEM kullanılarak gerçekleştirildi. Yüzey işlevselleştirme süreci Şekil 3A-D'de sunulmuştur. Ardışık yüzeyler mikro ölçekte çeşitli morfolojiler ve seviyeler göstermiştir. DIDC çipinde standartlaştırılmış 25 nm grafen oksit morfolojisi görülürken (Şekil 3A), GrO ile işlevselleştirilmiş DIDC çipinde, anti-SARS-CoV-2 antikorlarının EDC-NHS-GrO-Pt/Ti DIDC çipi üzerine immobilizasyonu gözlendi ve daha sonra 400 nm'ye kadar daha fazla seviye genişlemesi görüldü (Şekil 3B). EDC-NHS çapraz bağlayıcı, 40 nm'lik bir seviyede dağıtıldı (Şekil 3C), bu da SARS-CoV-2'ye karşı antikorların işlevselleştirilmiş DIDC çipine hareketsiz hale getirildiğini doğruladı. Ayrıca, virüs spike antijeninin genişlemesinden sonra, Şekil 3D'de gösterildiği gibi, spike (S1) proteini nedeniyle 600 nm'de keskin bir tepe gözlendi ve bu da "kuyruk üzerinde" antikor-antijen yönelimini gösterdi.

Tipik üstten görünüm SEM resimleri Şekil 4A-D'de gösterilmektedir. 500 μm'de Şekil 4A, başarılı bir fotorezist kaplı SiO₂gofret ve Ti/Pt terminaline maruz kalan bir DIDC çipi sunar; Ek olarak, 20 μm'deki iç kısım, iki metal parmak arasındaki mesafedir. Fabrikasyon DIDC çip yüzeyi, homojen ve pürüzsüz bir yüzey morfolojisini gösterir; çipin grafen oksit ile işlevselleştirilmiş kısmı, EDC-NHS ile yürürlüğe girmiş kısım, virüse düşman olacak şekilde aşılanmış kısım ve virüs proteini çivili çipler sırasıyla (A), (B), (C) ve (D) panellerinde görüntülenir. Soyulmuş grafen oksit damlaları, çipe bir hidroksil grubu (-OH) ve bir karboksilik grup (-COOH) sağlar, bu da hassasiyet ve seçicilik açısından algılamayı artırır. Şekil 4A, homojen GrO pullarının 1 μm'de yayılmasını göstermektedir. Şekil 4B, 3 μm'de virüse düşman olan boş, yuvarlak, içi boş bir yapıya sahip EDC-NHS eşleşmesini göstermektedir. Şekil 4C, 1 μm'de grafen oksit-EDC-NHS işlevselleştirilmiş tespit çipine implante edilmiş çivili bir antikoru göstermektedir. Şekil 4D 10 μm'de çivili antikor ile güçlendirilmiş virüs çivili antijen benzeri havuz yapısını gösterir. GrO-DIDC biyosensörünün aşamalı üretimi sırasında beklenen bağların gelişimi, Şekil 4E(i-iv)'de gösterildiği gibi FTIR spektroskopisi ile gösterilmiştir. FTIR sonuçları²⁶ aşağıdaki gibidir: (i) çip yüzeyindeki antikorların neden olduğu 2.976 ^cm-1 C-H bağ zirvesi; (ii) Nitro grubunun varlığını gösteren 1.567 ^cm-1'de bir N-O tepe noktası ile EDC-NHS işlevselleştirmesi; (iii) 1.038 ^cm-1'de bir tepe noktası, DIDC çipi üzerine hareketsiz hale getirilmiş grafen oksit ayarında CO bağlarının (kokulu ester) ve aromatik halkaların varlığını düşündürür; ve (iv) 1.060 ^cm-1'de zayıf bir yoğunluğa sahip birincil alkolü (yani CO bağları) gösteren açıkta kalan DIDC çipi.

Önerilen geri dönüştürülebilir DIDC biyonik çipi, açık monoklonal antikorları bir grafen oksit-EDC-NHS bağlama yüzeyine hareketsiz hale getirerek virüs spike S1 proteinini hedeflemek için tasarlanmış ve üretilmiştir. Çip, anti-SARS-CoV-2 Abs'nin oluşumu için biyomühendislik ürünü bir yüzey ve düzen içerdiğinden, elektriksel kapasitans ile gösterildiği gibi çapraz bağlayıcıların şarj hareket hızını artırma kapasitesi, çipin etkisini doğrulamak için kullanılabilir (Şekil 5A). Şaşırtıcı bir şekilde, immünosensör, virüsü tespit etmek için mevcut biyo-algılama sistemlerinden daha düşük olan minimum 1.0 fg / mL'lik bir LOD gösterdi. Kritik olarak, önerilen elektriksel kapasitif immünosensör ayrıca daha iyi kontrasta sahiptir ve diğer elektrokimyasal eğilim biyosensörleri, duyarlılık, reaksiyon süresi, seçicilik ve yeniden kullanılabilirlik açısından virüs proteininin konumu için bu kadar uzun bir yol göstermiştir.

Oluşturulan SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDC'lerin immüno-aşamasının duyarlılığını test etmek için, 13 aşamalı miktarda S1-His proteini aldık (1.0 × 10⁻³ g ila 1.0 × 10⁻¹⁵ g) ve proteini DIDC çiplerine eklemek ve çeşitli antijen fiksasyonlarına göre kapasitansı ölçmek için damla projeksiyon tekniği kullanıldı; daha sonra, spektrumlar kontrol spektrumları ile karşılaştırıldı (Şekil 5B). Ayrıca, doğal örneklerde enterferans yapan maddelerin potansiyel etkilerini incelemek için virüs antijenlerine karşı seçiciliği de tahmin ettik (Şekil 5C); örneğin, PSA ve amiloid β_1-42 proteinleri kirletici olabilir. Enterferans yapan proteinin konsantrasyonu hem PSA hem de amiloid için 1.0 μg/mL idi_{β 1-42}. Seçicilik testi, enterferans yapan proteinlerin varlığında ve yokluğunda çalıştı. Testler 10 farklı sensörle gerçekleştirildi; Spesifik olarak, birinci ila beşinci sensörler, enterferans yapan protein mevcut olduğunda test edildi ve sensörlerin geri kalanı (altıncı ila onuncu), enterferans yapan protein olmadan test edildi. Bu koşullar arasında herhangi bir fark görülmedi. Birinci sensörden beşinci sensöre kadar kapasitans 286.9 nf'den 275.5 nf'ye değişti ve altıncı sensörden onuncu sensöre kadar kapasitans 271.9-273.0 nF arasında değişti. Numunelerin her biri 0.1 M PBS beşik düzeninde (pH 7.4) hazırlandı. Testler, hedef olmayan protein biyomoleküllerinin hem varlığı olan hem de olmadığı koşullar için yaklaşık 1.0 μg/mL virüs S1 proteini kullanılarak gerçekleştirildi. Tek bir inkübasyon adımından sonra, bu kapasitif immünosensing çipi, kısa bir süre içinde 5 μL'lik çözelti numuneleri ile ilgili kantitatif sonuçlar verdi; Kapasitans, virüs antijenlerine göre 3 saniye içinde değişti ve spesifik olmayan analitlerle önemli bir çapraz reaktivite olmadı. Virüs antijen proteininin duyarlılık tahmini, kapasitans ile fiksasyon arasında düz bir ilişki gösterdi (yani, y = mx + c). Burada y, x'in bir elemanıdır, m eğimdir, çizginin x-pivotuna olan noktasıdır ve c, y-hub üzerindeki bir bloktur. Olgusal tahminde, her tahmin birden çok kez bir temel oluşturmuş ve tipik bir değer kullanılmıştır; yanıt verme hızı 18.56 nF/g olarak karakterize edildi (Şekil 5D). Oluşturulan SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO 2-DIDC immün aşamasının reaksiyon durumunu kontrol etmek için, 1.0 × 10⁻¹⁵ g/mL, 1 × 10⁻⁹ g/mL ve 1 × 10⁻³ g/mL dahil olmak üzere üç spesifik antijen konsantrasyonu seçildi. Kapasitans tahmini, Şekil 5E'de gösterildiği gibi, her odak seviyesinde ayrı ayrı 3 saniyeden az olmamak üzere kapanır.

Daha sonra biyokompozitin (SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO 2-DIDC'ler) dayanıklılığı kontrol edildi; bunun için cipsler 10 gün boyunca 5 °C'de nemli bir odaya yerleştirildi. Kritik olarak, fabrikasyon DIDC çipinin sunumunda, depolama süresinde artımlı artışlarla önemli bir değişiklik görülmedi Şekil 6A. Ayrıca, DIDC tabanlı sensörün tekrarlanabilirliği, Şekil 6B'de gösterildiği gibi ek olarak değerlendirildi. SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDC'lerin kapasitans değerleri 10 saat boyunca değerlendirildi. Önemli bir şekilde, kapasitans değerleri, destek noktaları arasındaki değerlerde %±5'ten fazla sapma olmaksızın sabit kaldı. Ayrıca, yukarıdaki dayanıklılık sonuçlarını takiben, 10 gün boyunca tekrarlanabilirliği de aynı şekilde değerlendirdik. Dikkat çekici bir şekilde, bu kapasitans tahminleri de aynı şekilde destek noktaları arasında %±5'ten daha az bir oranda değişmiştir. Dikkat çekici bir şekilde, ikinci gün, büyük olasılıkla çipi oda sıcaklığından düşük bir sıcaklığa taşıdığımız için küçük bir kontrast (8.8 nF ila 7.2 nF arasında) fark ettik; Nitekim, ikinci günden itibaren kapasitans değerleri sabit kaldı. Kritik olarak, ilk günden onuncu güne kadar, kapasitans değerleri 8.8 nF'den 7.2 nF'ye kaymıştır ve standart sapma (SD), bağıl standart sapma (RSD) ve ortalamaya (x̄) dayalı tekrarlanabilirlik / tekrarlanabilirlikte önemli bir değişiklik gözlenmemiştir .

Son olarak, virüs DIDC çipinin yeniden kullanılabilirliği değerlendirildi. Antikorları sensör yüzeyinden çıkarmak için, 2.7 pH'ta 0.1 M'lik bir glisin-HCl elüsyon tamponu kullanıldı; dikkat çekici bir şekilde, vücutta fizyolojik olarak mümkün olmayan 7 ile 7.4 arasında bir pH, immünoaffinite ile bozukluğu değerlendirmek için seçilmiştir. Önemli bir şekilde, elüsyon tamponu sensör yüzeyine bir kez uygulandı ve uygulamadan sonra kapasitans değeri, işlevselleştirilmiş GrO (1.2 nF) ile bulunana benzer bir seviyeye ulaştı. Kısa bir süre sonra, 80 °C'de DIDC sensörüne piranha çözeltisi eklendi ve daha sonra kapasitansın maruz kalan DIDC çipininkine (0.26 nF) neredeyse eşdeğer bir seviyede olduğu gösterildi; gerçekten de, DIDC çipi ortaya çıkarılan niteliklerinin %96'sını geri kazandı. Özellikle, sonuçlar birinci ve ikinci iyileşmelerden sonra karşılaştırıldı ve Şekil 7A, B ve Şekil 8A-C'de gösterildiği gibi önemli bir değişiklik tespit edilmedi.

Şekil 1: Ultra hassas ve yeniden kullanılabilir grafen oksit modifiyeli çift sayısallaştırılmış kapasitif (DIDC) algılama çipinin şematik gösterimi. (A) Virüs S1 proteininin yapısı. (B) Üretilen iki katlı sayısallaştırılmış kapasitif algılama çipinin (DIDC) bir taslağı. (C) Devre (eşdeğer) ile iki katlı interdigitated kondansatör (DIDC). CL = seri olarak bağlanan ana terminaller için kondansatör; CS = seri olarak bağlanmış küçük odak elektrotları için kondansatör; çipin genişliği 4,1 mm ve uzunluğu 5 mm'dir. (D) Virüs S1 antijenine özgü hareketsizleştirilmiş anti-SARS-CoV-2 Abs'ye sahip GrO sırlı iki katlı sayısallaştırılmış kapasitif (DIDC) tespit çipi (analit odaklı). (E) 1 μm ölçeğinde grafen oksit içine gömülü anti-virüs Abs'nin morfolojik sunumu; ekteki resim, 25 nm seviyesinde homojen bir şekilde dağılan grafen oksit pullarının AFM'sini göstermektedir. (F) Açıkta kalan çipin bir SEM görüntüsü. (G) İki parmak (metal) arasındaki mesafe tanımlanmıştır. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakam Sharma ve ^ark.26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: AFM ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile yüzey değişikliklerinin ve işlevlerinin değerlendirilmesi ve DIDC üretiminin aşamalı süreci. (A) Fotorezist kaplı SiO₂gofret ve açıkta kalan Ti/Pt elektrot ile fabrikasyon DIDC algılama çipi. (B) GrO'nun 1.300 rpm'de spin kaplama yoluyla çip üzerinde imalatı. (C) İki katlı GrO kaplı interdigitated kapasitif (DIDC) tespit çipi için EDC-NHS kimya etkileşimi. (D) Antikor bağlanması, virüs S1 proteinine EDC-NHS (EDC-NHS-GrO-Ti / Pt-SiO 2-DIDC'ler) nedeniyle "kuyruk açık" Ab hizalaması ile yanıt verir. (E) SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDC'lere virüs S1 proteini bağlanması.Bu rakam Sharma ve ^ark.26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: AFM karakterizasyonu. DIDC çipinin ayrı ayrı ve (A) grafen oksit, (B) virüs çivili proteine karşı antikor, (C) EDC-NHS ve (D) atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile gerçekleştirildiği gibi virüsün çivili antijeni ile ilgili olarak yüzeysel olarak açıklığa kavuşturulması. Bu rakam Sharma ve ^ark.26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: SEM ve FTIR karakterizasyonu. (M.S.) Bu, tipik üstten görünüm SEM resimlerini gösterir. DIDC kapsamındaki örnekler, tamamlayıcı ve ek bir standardize yüzey etiyolojisi sunar; (A) çipin grafen oksit ile işlevselleştirilmiş kısmı, (B) EDC-NHS tarafından yürürlüğe konmuş kısım, (C) virüse düşman olacak şekilde işlevselleştirilmiş kısım ve (D) virüs proteini çivili çipler görüntülenir. (B) FTIR ve temas noktası tahminleri. (E) FTIR spektroskopisi: (i) virüsün antikorlarına düşman, (ii) EDC-NHS bağlantısı, (iii) grafen oksit ile kaplanmış DIDC çipi ve (iv) çıplak DIDC çipi. (F) Su temas açısı ölçümü: (i) çıplak DIDC çipi (82.0 ° ± 3.0 °), (ii) GrO (80.4 ° ± 3.0 °) ve (iii) EDC-NHS (75.4 ° ± 3.0 °). Ayrıca, çeşitli talaşların ıslanabilirliği, 5 μL'lik bir su damlasının temas açısı cinsinden tahmin edilmiştir. Sıvı (su), Şekil F(i)'deki sıyrılmış talaşlara göre daha yüksek bir temas noktası (yaklaşık 82.0° ± 3.0°) gösterdi. Dikkat çekici bir şekilde, bu nokta Şekil F(ii)'de olduğu gibi GrO (80.4° ± 3.0°) ve Şekil F(iii)'de olduğu gibi EDC-NHS (75.4° ± 3.0°) ile azalmıştır. Bu yüzey temas noktaları, grafen oksit ve EDC-NHS ile muamele edilmiş çiplerin, açıkta kalan çift sayısallaştırılmış kapasitif elektrotlardan daha hidrofilik olduğunu göstermektedir. Bu rakam Sharma ve ^ark.26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Duyarlılık ve fonksiyonel karakterizasyon. (A) Virüs biyomoleküllerinin antikorları ve antijeni tarafından bağlanan Ti/Pt bazlı DIDC katotları, metal (parmaklar) boyunca/arasındaki elektrik alanını bozar ve üretilen DIDC çipinin kapasitansı üzerindeki etki, kapasitans tahmin cihazı kullanılarak değerlendirilir. (B)Düzenlenmiş SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO 2-DIDCs immüno-aşama tespit çipinin hassasiyeti geniş bir aralığı kapsıyordu (yani, 1.0 mg/mL ila 1.0 fg/mL); Ortaya çıkarılan çipin üstündeki kapasitans, Chip-GrO, Chip-Gro-EDC-NHS-SARS-CoV-2-Ab ve EDC_NHS+ SARS-CoV-2-Ab+ SARS-CoV-2-Ag. (C) Enterferans yapan bir proteinin varlığı olsun ve olmasın, düzenlenmiş SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO 2-DIDCs immüno-aşama biyosensörünün seçiciliği. (D) Doğrusallık, çok çeşitli konsantrasyonlar için 18.56 nF / g idi ve güçlü bir doğrudan nüks çizgisi vardı; eğik ve nüks katsayısı (R) bilgilerin uydurulmasıyla belirlendi. (E) Protein numuneleri uygulandıktan sonra kapasitans değerlerine karşı 1.0 × 10⁻¹⁵ g/mL, 1 × 10⁻⁹ g/mL ve 1 × ¹⁰⁻³ g/mL konsantrasyonlarının tepki süresi (3 s). Bu rakam Sharma ve ^ark.26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Biyosensörün kararlılığının ve tekrarlanabilirliğinin değerlendirilmesi. (A) SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-Glass-DIDCs kapasitansına karşı 1-10 saat arasındaki zaman diyagramı, destek noktası değerleri arasında %±5'lik bir sapma ile. (B) Düzenlenmiş SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-Glass-DIDC'lerin zaman içinde tekrarlanabilirliğini değerlendiren stabilite sonuçları, destek noktası değerleri arasında 10 gün içinde %±5'lik bir sapma gösterdi. Bu rakam Sharma ve ^ark.26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Atomik kuvvet mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu görüntülerine dayalı DIDC çipinin yeniden kullanılabilirliği. (A) Bir denemeden sonra DIDC çipinin bir 3D AFM resmi; Çipin kalınlaşması 250 nm'ye kadar açıkça görülür. (B) 1 mm ölçeğinde virüs spike antijen tespitinin bir denemesinden sonra yüksek çözünürlüklü (HR) bir SEM resmi; merkezde, 50 μm'de Pt/Ti katotlarının resimleri, 10 μm'de metal elektrot parmak HR resmi ve iki parmak arasındaki mesafenin (yani 20 μm) resimleri sunulmaktadır. Hem AFM hem de SEM resimlerinde herhangi bir kusur veya kırılma fark edilmedi ve aynı çip bir analiz denemesi daha için kullanıldı. Bu rakam Sharma ve ^ark.26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Farklı konsantrasyonlarda kapasitans v/s SARS-CoV-2 spike (S1) antijen algılama ve DIDC çipinin rejenerasyonu ve yeniden kullanılabilirliği: (A) Bir empedans analizörü ile ölçülen grafen oksit kaplı DIDC biyonik elektrotun Nyquist çizimleri; PBS çözeltisinde 1.0 mg / mL ila 1.0 fg / mL konsantrasyonlarda spike S1 antijenleri olmadan ve bunlarla kapasitans yöntemi. (ıı,ı A'dakilere karşılık gelen Nyquist arazileri. (B) Bir glisin-HCl elüsyon tamponu (0,1 M) ve pirana temizliği kullanılarak düşük pH'da (2,7) başarılı bir sensör geri kazanımından sonra. İyileşme 20 dakika veya daha kısa sürede sağlandı. Tüm odaklar için, (B,C) içindeki oturum açma (A) işaretinin %96'sı kadardı. (C) iki ardışık sensör rejenerasyonundan sonra. Tahminlerin her biri için, grafen oksit kaplı DIDC biyonik anotlar için yük hareket eder; kontrol olarak 0.1 M PBS tampon düzenlemesi (pH 7.4) kullanıldı. Virüs spike (S1) antijeninin farklı konsantrasyonları için üç ardışık okuma elde edildi. Bu verileri toplamak için 1 kHz frekans uygulandı. Bu rakam Sharma ve ^ark.26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Ortalama (x̄), standart sapma (SD) ve bağıl standart sapma (RSD) değerleri ile tekrarlanabilirliğin/tekrarlanabilirliğin değerlendirilmesi.

Verimli bir DIDC çip tabanlı biyosensör oluşturmak için DIDC'nin yük dağılımı, iletkenliği ve dielektrik sabiti son derece önemlidir. Önemli ölçüde, bu algılama sınırlarındaki iyileştirmeler, DIDC ^18,26,27'nin kapasitif reaktansı ile ilgilidir. Bu çalışmada, Abs virüsüne düşman olan ve grafen oksit-DIDC bazlı SiO₂substratı²⁷ üzerinde EDC-NHS eşleşmesi ile işlevselleştirilen bir kapasitans immünosensörü üretildi. Ek olarak, Abs virüsüne karşı işlevsel hale getirmek için GrO substratı üzerine kovalent bağlanma kullanılarak EDC-NHS çapraz bağlama eklendi.

Sensör yüzeyinin hazır olmasını, anti-SARS-CoV-2 Abs immobilizasyonunu ve virüs S1 proteini ile bağlanmasını sağlayan özenle planlanmış prosedürle, immobilizasyonun basitliği, açıklığı ve genel kapasitansın çatışan unsurları arasında bir denge bulundu. GrO tarafından düzenlenen DIDC biyoçipinin ilerlemesi, elektriksel ve optik yüzey incelemesi kullanılarak kontrol edildi. Grafen bazlı malzemelerin geniş yüzey alanı, çeşitli analitlerin adsorpsiyonuna neden olur. Ek olarak, bu süper hassas ve ultra hızlı GrO-DIDC biyoçipi, POC testi için basit ve uygun bir sistemi temsil eder. Bu şekilde, detaylı biyosensör en son teknolojidir. İlk olarak, sensör 70 nF'yi aşan bir kapasitans değişikliği oluşturabilir, çünkü açıkta kalan GrO kaplı DIDC çipi 1.0 fg/mL'lik düşük bir yakınsamaya sahiptir. Kapasitans değişiminin derecesi, hedef virüs antijen protein konsantrasyonu 1.0 mg / mL ila 1.0 fg / mL aralığında artışlarla artar. Bu biyosensörün tanımlama sınırları, faradaik olmayan bir biyosensör (kapasitif) için bugüne kadarki en düşük sınırlar arasındadır. İkinci olarak, sensör açıklığı, hedeflenen ve hedef olmayan biyobelirteçler (protein) arasındaki kapasitans farkı yöntemindeki varyasyon ile gösterilmiştir. Hedef olmayan proteinler için, kapasitanstaki değişiklik temel olarak objektif virüs S1 antijen hedef proteini ile aynı değildi ve hedef olmayan protein fiksasyon artışları ile kapasitansta önemli bir değişiklik yoktu. Üçüncüsü, sensör, mükemmel kapasitans doğrusallığı (yani 18,56 nF/g) ile 1,0 mg/mL ila 1,0 fg/mL arasında geniş bir algılama aralığı elde etti. Bir yandan, virüs S1 antijeninin hızlı bir şekilde tanımlanması, önemli kişisel temasların hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar, tedavi seçeneklerini genişletir ve belirlenmiş tedaviyi destekler; Ayrıca, bu tanımlama, pandemi ile zamanında mücadele etmek için gerekli olan hastalığın yayılmasını engellemeye yardımcı olur. Bu karmaşık ve kısıtlı teknolojinin en önemli kısmı, üretim sürecini ve çip işlevselliğini optimize etmektir. Üretim sürecinin her adımının yönetilmesi gerekir. Üretim sonuçları, nasıl ele alındığına bağlı olarak farklılık gösterebilir ve sınırlı olabilir.

Sonuç ve bakış açısı
Bu makale, virüs S1 proteinlerini özellikle fg seviyesinde tanımlamak için tasarlanmış ve üretilmiş ultra hızlı ve geri dönüştürülebilir grafen oksit ile değiştirilmiş iki katlı interdigitated kapasitif (DIDC) tespit çipi sunmaktadır. Bu çalışmadaki keşifler, GrO ile işlevselleştirilmiş bir DIDC kapasitif çipinin kullanılmasının algılama sınırlarını daha da geliştirdiğini ve böylece biyoalgılama cihazının yanıt verebilirliğini ve seçiciliğini artırdığını ortaya çıkardı. Kısıtlı hat şekli ve elektriksel özelliklerdeki değişiklikler (empedans kuplajı), bir dizi tanımlama aralığı (1.0 × 10⁻³ gm ila 1.0 × 10⁻¹⁵ gm) için kapasitans değişikliklerine neden oldu. DIDC kapasitif sensörünün işleyişi, BSA biyomolekülleri ve spike proteinleri içeren son derece zayıflamış düzenlemelerde kapsamlı bir şekilde test edildi. Bu çalışmalar, önerilen DIDC kapasitif sensörünün, virüs S1 proteinlerini kısa sürede (~5-6 s) düşük seviyelerde tespit etmek için kullanılabileceğini göstermiştir. Bu nedenle, bu çalışmada önerilen ağrısız, temassız ve hızlı prosedür, virüs S1 proteinini hastalığın başlangıç aşamalarında yüksek hassasiyetle tespit edebilir.

Daha sonra plan, hasta odaklı tedaviyi güçlendirmek ve tüm cihaz parçalarını yükseltmek için POC'de virüs spike proteinlerini tanımlamaktır (yani, tespit çipi, model tabanlı DIDC kapasitif sensörünün gerçek hasta örnekleriyle [aynı anda] tam koordinasyonunu geliştirmek). Sonunda, COVID-19 cep telefonu tabanlı teknoloji kullanılarak tespit edilebilir. Bununla birlikte, tartışılan ve tanıtılan biyosensör, biyolojik numune mevcudiyeti ve etik onay olmaması nedeniyle henüz orijinal numuneler kullanılarak denenmemiştir. COVID-19 ile enfekte olmuş hastalardan biyo-sıvı elde etmek için Güney Kore viroloji ve enfeksiyon laboratuvarları ile yurtdışındaki acil klinikler arasında işbirliği kurmak için ciddi çabalar sarf edilmektedir. Yüksek kaliteli kapasitif sensörümüzü kullanan COVID-19 POC teşhisine yönelik gelecekteki araştırmaların sonuçları başka bir yerde yayınlanacaktır.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, Eğitim Bakanlığı tarafından Hibe 2018R1D1A1A09083353 ve Hibe 2018R1A6A1A03025242 kapsamında desteklenen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı tarafından bir dereceye kadar onaylandı, bir şekilde GCS Group Association Ltd. ve Kore Çevre Bakanlığı (MOE) Enstitüsü tarafından Entegre Kirlilik Önleme ve Kontrol Projesi'ne büyük enerji yatırdı ve 2022'de Kwangwoon Üniversitesi'nin Araştırma Bursu.

EM, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü'nün (5T32EB009035) desteğini kabul eder.