Tavşanda travma sonrası osteoartrit oluşturmak için tekrarlanabilir bir kıkırdak etki modeli

Tavşanlarda açık medial femoral kondil etki modeli, travma sonrası osteoartrit (PTOA) ve PTOA ilerlemesini azaltmak için yeni terapötik stratejiler üzerinde çalışmak için güvenilirdir. Bu protokol, bir çarpma kafasına sahip taşıyıcı tabanlı bir düşme kulesi kullanılarak tavşanlarda posterior medial femoral kondilin izole bir kıkırdak defektini oluşturur.

Travma sonrası osteoartrit (PTOA), Amerika Birleşik Devletleri'ndeki tüm osteoartrit vakalarının %12'sinden sorumludur. PTOA, eklem kıkırdağına etki eden yüksek etkili bir yük gibi tek bir travmatik olayla veya ön çapraz bağ yırtılmasında olduğu gibi eklem instabilitesi ile başlatılabilir. Şu anda PTOA'yı önlemek için etkili bir terapötik yoktur. Kıkırdak hasarının ilerlediği mekanizmaları daha iyi anlamak ve PTOA'nın ilerlemesini hafifletmek veya önlemek için yeni tedavi stratejilerini araştırmak için güvenilir bir PTOA hayvan modeli geliştirmek gereklidir. Bu protokol, kıkırdak hasarını indüklemek için açık, düşme kulesi tabanlı bir tavşan femoral kondil etki modelini açıklar. Bu model, 579,1 ± 71,1 N'lik pik yükler ve 2,4 ± 0,5 ms'lik bir pik-yük süresiyle 81,9 ± 10,1 MPa'lık pik gerilimler sağladı. Etkilenmiş medial femoral kondillerden (MFC'ler) eklem kıkırdağı daha yüksek apoptotik hücre oranlarına sahipti (p = 0.0058) ve etkilenmemiş kontralateral MFC'lere (0.56 ± 0.42) ve gömülü dizin diğer kıkırdak yüzeylerine (p < 0.0001) kıyasla 3.38 ± 1.43 gibi daha yüksek Osteoarthritis Research Society (OARSI) skorlarına sahipti. Etkilenmeyen eklem yüzeyleri arasında OARSI skorlarında fark saptanmadı (p > 0.05).

Travma sonrası osteoartrit (PTOA) dünya çapında önde gelen bir sakatlık nedenidir ve semptomatik osteoartritin (OA^{) %}12-16'sını oluşturur1. Son dönem OA tedavisi için mevcut altın standart, son dönem tibiotalar veya subtalar artritte olduğu gibi total diz ve kalça artroplastisi² veya artrodezdir. Büyük ölçüde başarılı olmasına rağmen, artroplastinin maliyetli ve morbid komplikasyonları olabilir³. Ek olarak, artroplasti, %77-83 gibi düşük revizyonsuz implant sağkalımı göz önüne alındığında, 50 yaşın altındaki hastalarda daha az arzu ^edilir4,5. Şu anda, PTOA'nın ilerlemesini önlemek veya hafifletmek için FDA onaylı bir tedavi yoktur.

PTOA, sinovyal doku, subkondral kemik ve eklem kıkırdağı dahil olmak üzere tüm eklemi etkiler. Eklem kıkırdağı dejenerasyonu, sinovyal inflamasyon, subkondral kemik yeniden şekillenmesi ve osteofit oluşumu^ile karakterizedir ^6,7. PTOA'nın fenotipi, kıkırdak, sinovyum ve subkondral kemik arasındaki karmaşık bir etkileşim süreci ile gelişir. Mevcut anlayış, kıkırdak hasarının tip 2 kollajen (COL2) ve agrekan (ACAN) gibi hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerinin serbest kalmasına yol açtığıdır. Bu ECM bileşen fragmanları proinflamatuardır ve IL-6, IL-1β ve reaktif oksijen türlerinin üretiminin artmasına neden olur. Bu aracılar kondrositler üzerinde etki ederek, eklem kıkırdağını bozan ve aynı zamanda matris sentezini azaltan MMP-13 gibi matris metaloproteinazların (MMP'ler) yukarı regülasyonuna neden olarak eklem kıkırdağı için genel bir katabolik ortama yol açar⁸. Ek olarak, primer osteoartritte artmış kondrosit apoptozu ve PTOA ^9,10 kanıtı vardır. Mitokondriyal disfonksiyon, kıkırdak 11,12,13,14'ün suprafizyolojik yüklenmesinden sonra ortaya çıkar ve bu da kondrosit apoptozunun^{artmasına neden} olabilir ^12,15. Gelişmiş kondrosit apoptozu, artmış proteoglikan tükenmesi ve kıkırdak katabolizması ile ilişkilendirilmiştir ve kıkırdak ve subkondral kemik yeniden şekillenmesindeki değişikliklerden önce geldiği gösterilmiştir^16,17,18.

Çoğu insan hastalığında olduğu gibi, hastalığın patofizyolojisini daha iyi anlamak ve yeni terapötikleri test etmek için PTOA'nın güvenilir ve translasyonel modellerine ihtiyaç vardır. PTOA^17,19'un eklem içi kırık ve çarpma modellerinde domuz ve köpek dişleri gibi büyük hayvanlar kullanılmıştır^, ancak maliyetlidirler. Fareler, sıçanlar ve tavşanlar gibi daha küçük hayvan modelleri daha ucuzdur ve tipik olarak ön çapraz bağın (ACL) cerrahi transeksiyonunu ve/veya medial menisküsün bozulmasını içeren eklem destabilizasyonu yoluyla üretilen PTOA'yı incelemek için kullanılır 20,21,22,23,24,25. Eklem travması, bağ yaralanması²⁶ dahil olmak üzere çeşitli sonuçlara yol açabilse de, hemen hemen tüm vakalarda kıkırdağın mekanik olarak aşırı yüklenmesi meydana gelir.

Ligamentöz instabilite (ÖÇB transeksiyonunda olduğu gibi) ve akut kondral yaralanma sonrası PTOA gelişiminin arkasındaki patolojinin farklı mekanizmalara bağlı olduğuna dair kanıtlar ortaya çıkmaktadır²⁷. Bu nedenle, kıkırdağa doğrudan yaralanma modelleri geliştirmek önemlidir. Şu anda sıçanlarda ve farelerde osteokondral veya kondral yaralanma oluşturan sınırlı sayıda etki modeli bulunmaktadır^28,29. Bununla birlikte, murin kıkırdağı, izole kondral defektler oluşturmak için uygun değildir. Bunun nedeni, murin eklem kıkırdağının sadece 3-5 hücre tabakası kalınlığında olması ve organize yüzeysel, radyal ve geçiş kıkırdak bölgelerinin yanı sıra insanlarda ve daha büyük hayvanlarda bulunan kalın kalsifiye kıkırdak tabakasından yoksun olmasıdır. Murin modelleri ayrıca kısmi kıkırdak defektlerinin spontan çözünürlüğünü gösterir^30,31. Bu nedenle, kıkırdak kalınlığı ve organizasyonu insanlarınkine benzer olduğu için bu etki modeli için tavşanı seçtik ve PTOA ile sonuçlanan tutarlı bir kondral etkinin sağlanmasına izin verecek en küçük hayvan modelidir. Tavşanda femoral kondil etkisinin önceki açık cerrahi modellerinde bir sarkaç³², elde tutulan yaylı bir kıkırdak impaksiyonasyon cihazı 33 ve tavşana özgü çarpma tertibatı oluşturmaya izin veren bir düşme kulesi³⁴ kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar in vivo verilerden yoksundu. Diğerleri, sarkaç tabanlı³⁵, pnömatik³⁶ ve yaylı³⁷ darbe cihazları¹⁰ ile in vivo veriler bildirmiştir ve bu çalışmalar, yöntemler arasında tepe gerilimi ve yükleme oranlarında yüksek oranda değişkenlik göstermektedir. Yine de, alan, akut kıkırdak travmasını in vivo güvenilir bir şekilde modellemek için tutarlı bir yaklaşımdan yoksundur.

Mevcut protokol, tavşan dizinin posterior medial kondiline tutarlı bir etki sağlamak için düşme kulesi tabanlı bir sistem kullanır. Posterior medial femoral kondili ortaya çıkarmak için dize posterior yaklaşım kullanılır. Daha sonra eklem yüzeyi ile aynı hizada medialden laterale femoral kondiller boyunca bir Steinman pimi yerleştirilir ve platforma sabitlenir. Sabitlendikten sonra, posterior medial femoral kondile bir yük verilir. Bu yöntem, tavşan distal femurunun ağırlık taşıyan yüzeyine tutarlı kıkırdak hasarının iletilmesine izin verir.

Aşağıdaki prosedür, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçekleştirildi. Tüm sağkalım ameliyatları, NIH kılavuzlarında belirtildiği gibi steril koşullar altında gerçekleştirildi. Ağrı ve enfeksiyon riskleri, başarılı sonuçları optimize etmek için uygun analjezikler ve antibiyotiklerle yönetildi. Bu çalışma için 3.0-4.0 kg ağırlığındaki iskeletsel olarak olgun erkek Yeni Zelanda Beyaz tavşanları kullanıldı.

1. Düşme kulesi imalatı

1. Steinman pimini sabitlemek için düşme kulesi, taban platformu ve mekanizmanın bileşenleri için CAD çizimleri oluşturun (Ek Şekil 1-14).
2. Piyasada bulunan bileşenleri satın alın (Bkz. Malzeme Tablosu).
3. Cihazın makine parçalarını tedarik edin veya CAD çizimlerini imalat için bir makiniste verin.
   NOT: 3 mm çaplı çarpma tertibatı ucunu imal etmek için alet yapma kabiliyetine sahip yüksek hassasiyetli bir makinist gereklidir (Ek Şekil 1, bölüm 20 ve Ek Şekil 13,14). Çarpma kafasının çarpma yüzü, medial tavşan kondili 35'in eğriliğine uymak için sagital ve koronal düzlemlerde sırasıyla^7.14 mm ve 5.56 mm eğriliklere sahipti (Ek Şekil 13,14).
4. Parçaları, düşme kulesi, sabit hizalamalı lineer bilyalı rulmanlar aracılığıyla iki dikey çubuk üzerinde hareket eden bir taşıyıcıdan oluşacak ve taban platformu tavşanı destekleyecek ve Steinman pimini sabitleyecek şekilde monte edin (Şekil 1 ve Şekil 2).
   NOT: Bu tasarımın taşıyıcı kirişi, kabul edilebilir bir titreşim seviyesine sahip önceki bir düşme kulesinin^38'ine eşit bir bükülme sertliğine sahiptir.

2. Hayvan hazırlama

1. Tavşanı tartın ve 2.5 mg / kg alfaxalone ve 0.15 mg / kg midazolam IM kullanarak uyuşturun (Malzeme Tablosuna bakınız). İndüksiyondan sonra her iki göze de göz merhemi sürün. ~% 2 -% 3 izofluran kullanarak anesteziyi sürdürün. Analjezi için buprenorfin SR (0.1 mg/kg) SQ ve perioperatif enrofloksasin (10 mg/kg) SQ verin. Buprenorfin yerine, Carprofen, 4mg/kg veya Meloksikam, 0.2 – 0.3mg/kg veya Ketoprofen, 3mg/kg gibi NSAID'ler SQ enjeksiyonları olarak verilebilir.
2. Tavşanın arka ayağını ayak bileğinden arka kısma kadar tıraş edin. Kesinin kirlenmesini önlemek için tavşan epilasyonunda ekstra dikkatli olunması önerilir. Bir dizi özel, keskin tavşan saç kesme makinesi kullanmak önemlidir.
3. Paslanmaz çelik ön ayak bloğunu (Ek Şekil 1, parça No. 2 ve Ek Şekil 4) darbe platformunun ucunun altına yerleştirin ve platformu bir ısıtma yastığı ile örtün. Tavşan sternalini (yani yüzüstü) ısıtma yastığına yerleştirin. Kontralateral kalçanın altına yastıklı bir yumru yerleştirin.
   1. Operatif ekstremitenin dizin ortalandığından ve polietilen blok üzerinde durduğundan emin olun (Şekil 2A1). Kuyruğu operatif ekstremiteye üstün ve kontralateral olarak nazikçe geri çekmek için ipek bant kullanın.
4. Ameliyat bölgesini kloroheksidin ve% 70 alkole batırılmış steril gazlı bezle silin. Ameliyat bölgesini arka dizden başlayarak dışa doğru dairesel bir süpürme ile fırçalayın. % 70 alkolle biten taze fırçalarla en az 3 kez tekrarlayın.
5. Ameliyat ayağının üzerine ayak bileğine kadar steril bir eldiven yerleştirin ve steril yapışkan bir sargı ile sarın.
6. Cerrahi bölgeyi üç örtü ile steril bir şekilde örtün: biri doğrudan ameliyat ekstremitesinin altında, diğer ikisi ise vücudun geri kalanını örtmek için. Perdeleri havlu kelepçeleriyle sabitleyin.

3. Cerrahi maruziyet

NOT: Ameliyat ve darbeden önce, subkondral kemik kırığı olmadan görünür kıkırdak hasarı veren ağırlık ve düşme yüksekliği, tavşanın spesifik suşu, yaşı ve cinsiyeti için ampirik olarak belirlenmelidir.

1. Patellanın distalinde bulunan diz ekleminin pozisyonunu tahmin etmek için patellanın pozisyonunu öne doğru palpe edin. 15 bıçaklı bir bıçak kullanarak, uzatılmış dizin arka yüzü boyunca patellanın üst kutbu seviyesinden distal olarak 3-4 cm'lik bir kesi yapın.
2. Altta yatan yüzeysel fasya boyunca künt ve keskin diseksiyonlar yapın. Cildin medial ve medial gastroknemius arasındaki aralığı lateral olarak geliştirin. Bu aralığa kendi kendini tutan bir Weitlaner ekartörü yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
   1. Sekan arter ve venin hemen üzerinde ikincil bir fasyal tabaka görünür hale gelecektir. Safenin lateralini diseksiyon yapın ve vaskülatürü medial olarak ve posterior gastroksolus kompleksini lateral olarak geri çekin.
      NOT: Bu damar sistemini kesmemeye dikkat edin. Bu arter hasar görürse, ameliyat sonrası hemorajik şok meydana gelebileceğinden uygun ligasyonu sağlayın.
3. Posterior medial femoral kondil üzerinde küçük bir hareketli fabella tanımlanana kadar distal diseksiyon. Fabella superolateral'ı harekete geçirmek için bir artrotomi yapın ve altta yatan medial femoral kondili açığa çıkarın. Medial femoral kondilin posterior yönünü ortaya çıkarmak için yumuşak dokuyu künt ve keskin diseksiyonla nazikçe çıkarın. Yumuşak dokuları bu seviyede geri çekmek için bir Freer ve Cricket kendinden tutucu kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
4. Kondili açıkta tutarken, medial femoral kondilin üst yönünden başlayarak ve medial femoral kondilin ön-arka yönünde, kondilin posterior yönünden kabaca 5 mm uzakta, distal femur boyunca 0.062 inçlik bir Steinman pimi (Malzeme Tablosuna bakınız) ilerletin.
   1. Pille çalışan bir Steinman pim sürücüsü kullanarak teli eklem yüzeyine paralel olarak kemik ve yan deriden yanal olarak sürün. Lateral epikondilin palpasyonu, Steinman piminin uygun yörüngesini sağlayacaktır.
5. Ekartörleri çıkarın ve cildi 3-0 polisorb sütürle kapatın (bkz. Malzeme Tablosu). Kesiği steril gazlı bezle örtün.

4. Femoral kondilin etkisi

1. Ameliyat uzvunun altındaki örtüyü çıkarın ve Steinman pimini özelleştirilebilir ve ayarlanabilir bir yükseklik darbe platformuna sabitleyin. İlk olarak, Steinman pim sabitleme aparatının yüksekliği ayarlanabilir, alt yönünü pimin altına yerleştirin (Şekil 2A2). Vida yüksekliklerini gerektiği gibi ayarlayarak telin bu platformda zemine paralel olduğundan emin olun.
   1. Steinman piminin yere paralel olduğundan emin olduktan sonra, güvenli platformun üst vida tabanlı yönünü (Şekil 2A3) yüksekliği ayarlanabilir parçanın alt vida tabanlı yönüne yerleştirin. Üst çubuğu pim tutma platformunun yüksekliği ayarlanabilir alt kısmına vidalayarak Steinman piminin sıkıca sabitlendiğinden emin olun (Şekil 2A2).
2. Steinman pimi platforma sabitlendikten sonra dikişi çıkarın ve kesiği yeniden açın. Medial femoral kondili, kendi kendini tutan Weitlaner ve kriket ekartörleri ile ortaya çıkarın. İlave yumuşak dokuyu çarpma ucunun yolundan geri çekmek için ek bir Freer gerekebilir (Şekil 2B).
3. Düşme kulesini onaylı bir dezenfektanla silin. Steril 3 mm çarpma kafasını (Şekil 2A4) düşme kulesi taşıyıcısına takın. Düşme kulesini operatif ekstremitenin üzerine getirin ve tabanını (Şekil 2A6) çarpan platformun altına yerleştirin (Şekil 3A).
4. Çarpma tertibatını (Ek Şekil 2, bölüm 20 ve Ek Şekil 13) posterior medial femoral kondilin merkezine yavaşça indirin. Çarpma tertibatının yolunda yumuşak doku olmadığından emin olun.
   1. Çarpma tertibatı başının posterior medial femoral kondil üzerinde ortalandığından emin olmak için tavşanı veya kuleyi gerektiği gibi hareket ettirin (Şekil 3B). Tavşan her hareket ettirildiğinde veya yeniden konumlandırıldığında, bu cerrahi bölge sterilitede olası kırılmalar açısından değerlendirilmeli ve gerekirse alan yeniden sterilize edilmelidir.
5. Uygun yörünge sağlandıktan sonra, kuleyi mafsallı kelepçelerle platforma kelepçeleyin (Şekil 2A5,  bkz. Malzeme Tablosu).
6. İnhalan anesteziyi artırmadan daha derin anestezi için darbeden 5-10 dakika önce bir doz intravenöz alfaksalone (0.5-0.7 mg / kg) uygulayın.
   NOT: Palpebral refleks, pedal çekme ve kulak kepçesi refleksi eksikliği daha derin anesteziyi kanıtlar. Bu daha derin anestezi, aparata yerleştirme sırasında ve darbe sırasında olası uzuv reaksiyonlarını önlemeye yardımcı olur.
   DİKKAT: Çok hızlı verilirse, alfaxalone tavşanlarda geçici apne ve hipoksiye neden olabilir ve 1-2 dakika boyunca yavaşça verilmelidir. Hipoksi meydana gelirse, devam etmeden önce yeterli oksijenlenmeyi ve hayati değerlerin restorasyonunu sağlayın.
7. Çarpma tertibatını düşme kulesine medial femoral kondilin üzerinde istenen yüksekliğe ayarlayın. 1.41 kg kütleli rulmanlar da dahil olmak üzere mevcut taşıma tertibatı için bu 7 cm'lik bir yüksekliktir.
   NOT: Düşme kulesi yüksekliği kadavra dokusu üzerinde yapılan pilot çalışmalardan belirlenmiştir. Bu yükseklik, bu çalışmada tavşanlar için görünür kıkırdak hasarı oluşturdu, ancak subkondral kemik kırığı oluşturmadı.
8. Taşıyıcıyı serbest bırakmak ve yerçekimi kuvveti altında düşmesine izin vermek için iş mili durdurucusunu serbest bırakmadan hemen önce LabVIEW veri toplama yazılımındaki (Ek Kodlama Dosyası 14) Başlat düğmesine tıklayın (Ek Şekil 2, öğe No. 14).
   NOT: Veri toplama yazılımı, bir veri toplama modülüne bağlı bir dizüstü bilgisayar kullanarak 100 kHz'de çarpma sırasında çarpma tertibatı ile taşıyıcı ve bir ivmeölçer (Şekil 1, 7) arasına yerleştirilmiş bir yük hücresinden (Şekil 1, 6) verileri toplayacaktır.
9. Veri toplama yazılımı tarafından oluşturulan txt dosyasını Matlab veri analiz kodu (Ek Kodlama Dosyası 2) ile aynı klasöre yerleştirin ve ham verileri filtrelemek ve etki parametrelerini hesaplamak için veri analiz kodunu çalıştırın.
10. Maksimum yükün tanımlandığından emin olun. İlişkili zaman noktası, maksimum deformasyon ve sıfır hız zamanı olarak kabul edilir.
    NOT: Veri analiz kodu, klasördeki tüm txt dosyalarını analiz edecek ve her dosya için sonuçları raporlayacaktır. Kod, yükleme süresi verilerindeki değişikliklere bağlı olarak etkinin başlangıcını ve sonunu belirler. İvmeölçerden gelen veriler, hızı hesaplamak için sayısal olarak entegre edilecek ve yer değiştirmeyi hesaplamak için tekrar entegre edilecektir. Veri analizi kodu, aşağıdaki formüllerden darbe, iş ve kinetik enerjiyi sayısal olarak hesaplayacaktır:
    
    
    
    burada F, yük sensörü tarafından ölçülen kuvvettir, x 0 ve t ₀, çarpmanın başlangıcındaki yer değiştirme ve zamandır ve x ve t_f, çarpmanın sonundaki yer değiştirme ve zamandır. Yükleme hızı, çarpmanın yükleme aşamasında dσ/dt'nin ortalaması olarak sayısal olarak hesaplanacaktır. Tepe gerilimi, tepe yükünün çarpma tertibatı kafasının temas alanına bölünmesiyle hesaplanacaktır.
11. Uygun kıkırdak hasarının oluşup oluşmadığını belirlemek için kıkırdak yüzeyinin görselleştirilmesini gerçekleştirin (Şekil 4A).

5. Cerrahi alanın kapatılması

1. Düşme kulesini operatif ekstremitenin üzerinden çıkarın. Kullanılmış tüm cerrahi aletleri bir kenara koyun ve yeni steril eldivenlerle değiştirin.
   NOT: Düşme kulesinin steril olmadığı göz önüne alındığında, darbeye kadar kullanılan tüm aletler artık kontamine olarak kabul edilmelidir.
2. Alt ekstremiteye tekrar steril bir örtü uygulayın ve kullanılmayan steril kendinden ekartörler elde edin.
3. Medial femoral kondili tekrar açığa çıkarın ve cerrahi bölgeyi 50-60 mL steril salin ile iyice sulayın.
4. Arka kapsül 5-0 polisorb sütür ile kapatılır, ardından cilt 4-0 monosorb sütür ile kapatılır (bkz.
5. İnderiyal insizyon çevresinde lokal analjezi için 2 mL lidokain / bupivakain enjekte edin.
6. Yumuşak doku yaralanmasını en aza indirmek için salınım yaparak Steinman pimini bir güç sürücü seti ile çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın).
7. Yarayı yapışkan olmayan bir pansumanla ve ardından yapışkan bantla sarın. Kırık olmadığından ve uygun pim yerleşiminden emin olmak için operatif ekstremitenin röntgenini çekin (Şekil 4B).

6. Ameliyat sonrası yönetim

1. Tavşanı kafesine geri koyun ve anesteziden çıkana kadar (~25 dakika) ısıtılmış battaniyeler üzerinde izleyin.
2. Düzgün bir şekilde iyileşmelerini ve hareket kabiliyetlerini yeniden kazanmalarını sağlamak için ameliyattan sonraki birkaç gün boyunca tavşanları yakından izlemeye devam edin. Enfeksiyon profilaksisi için ameliyat sonrası 2 gün boyunca enrofloksasin (10 mg / kg) uygulayın. Ameliyattan sonra her 2-3 günde bir ve gerektiğinde buprenorfin SR analjezisini (0.1 mg/kg) deri altından uygulayın. Buprenorfin yerine, Carprofen, günde 4 mg / kg SQ, Meloksikam, 3 güne kadar günde 0.2 - 0.3 mg / kg SQ veya Ketoprofen, günde 3 mg / kg SQ gibi NSAID'ler ameliyattan 3-5 gün sonra ve gerektiğinde uygulanabilir.
   NOT: İnsan yenidoğan pantolonunun arka ayakların üzerine yerleştirilmesiyle tavşan yalaması veya çiğneme nedeniyle ameliyat sonrası yara ayrılmasını önlemeyi başardık³⁹. Tavşan pantolonu çiğnerse, kesiğin çiğnenmesini önlemek için bir Elizabeth yakası ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirilebilir.

7. Histolojik değerlendirme

1. Yaralanmadan 16 hafta sonra, ötenazi tavşanlarından dizleri toplayın, 48 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin, ardından parafin gömün ve 5 μm kalınlığında dilimler halinde bölümlere ayırın.
2. De-parafinizasyon ve rehidrasyondan sonra, bölümleri standart protokollere^40,41 göre safranin O hızlı yeşil ile boyayın.
3. Hematoksilen⁴² ile karşı boyanmış, üreticinin talimatlarını izleyerek TUNEL Kromojenik Apoptoz Tespit kitini kullanarak bölümlerde terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick ucu etiketleme (TUNEL) testini gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).

Bu prosedürün başarısı, darbeden hemen sonra kondilin cerrah tarafından görüntülenmesi (Şekil 4A) ve kırık olmadığından emin olmak için radyografi (Şekil 4B) ile izlendi. Kondilin intraoperatif kırığına yol açan darbe yetmezliği riski vardır. Bu tipik olarak Steinman piminin yanlış yerleştirilmesinden kaynaklanıyordu (Şekil 5). Bu model kullanıldığında, intraoperatif kırığa sekonder kırık başarısızlığı oranı %9.0 idi (67 ameliyatın 6'sı). Ortalama tepe darbe gerilimi 81,9 ± 10,1 MPa (CV = %12,3) ve ortalama yükleme hızı 36,6 ± 11,0 MPa/ms (CV = %30,1) idi. Diğer parametreler de tutarlıydı ve CV'ler %5-%23.5 arasında değişiyordu (Tablo 1).

Diz eklemlerinin Safranin O-fast yeşil boyalı histolojik kesitleri n = 8 tavşandan kıkırdak yıkımı ve osteoartrit patolojisi açısından Osteoarthritis Research Society International (OARSI) skorlama sistemi kullanılarak değerlendirildi⁴³. Kontralateral yaralanmamış femoral kondilde kıkırdak hasarı gözlenmedi (Şekil 6A) ve esas olarak çarpma bölgesine lokalize oldu (Şekil 6B). Etkilenen 16 haftalık medial femoral kondiller (MFC'ler), OARSI skoru 0.56 ± 0.42 olan kontralateral kontrol MFC'lerine kıyasla 3.38 ± 1.43 daha yüksek OARSI skorlarına sahipti (p < 0.0001) (Şekil 6C). Ayrıca, gömülü diz MFC'leri de aynı dizdeki medial tibial platodan (MTP; 0.71 ± 0.59), lateral tibial platodan (LTP; 0.88 ± 0.64) ve lateral femoral kondilden (LFC; 0.81 ± 1.00) daha yüksek OARSI skorları sergiledi (p < 0.0001) (Şekil 6D). Buna karşılık, kontralateral etkilenmemiş dizin MFC (0.56 ± 0.42), LTP (0.50 ± 0.46), MTP (0.28 ± 0.45) ve LFC (0.25 ± 0.46) kompartmanları arasında OARSI skorlarında fark gözlenmedi (p > 0.05) (Şekil 6E). Etkilenen ve etkilenmeyen LFC, MTP ve LTP eklem yüzeyleri arasında da anlamlı bir fark yoktu (p >0.05) (Şekil 6F).

16. haftada hasat edilen etkilenmiş MFC'den elde edilen eklem kıkırdağı, etkilenmemiş MFC'lere (%53.±4 ± %12.4) kıyasla artmış kondrosit apoptozunu gösteren daha yüksek TUNEL pozitiflik seviyelerine (%69.1 %14.4) sahipti (p = 0.0058) (Şekil 7).

Şekil 1: Düşme kulesi aparatı. (1) Dikey çubuklar. (2) Çubukların presle oturtulduğu alüminyum bir platform. (3) Çubukları daha fazla dizginlemek için bir plaka. (4) Sabit hizalamalı lineer bilyalı rulmanlar. (5) Çarpma kafası taşıyıcıya monte edilmiştir. (6) Yük hücresi. (7) İvmeölçer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Cerrahi işlemler sırasında kullanılan bileşenler ve tavşanın darbe aparatı üzerine yerleştirilmesi. (A) Kıkırdak yaralanması oluşturmak için kullanılan aparat ve bileşenlerin tanımlanması: (1) polietilen darbe platformu, (2) Steinman pim tutma aparatının yüksekliği ayarlanabilir kısmı, (3) yüksekliği ayarlanabilir Steinman pim tutma aparatının üst görünüşü, (4) 3 mm çapında steril çarpma başlığı, (5) darbe platformunu düşme kulesi aparatına ve (6) darbe platformunun tabanına tutmak için geçiş kelepçeleri. (B) Posterior medial femoral kondilin etkisinden önce platforma sabitlenmiş Steinman pimi (kırmızı oklarla gösterilir) ile tavşan arka uzvunun konumlandırılması. Perdeler, gösteri amacıyla rakamlardan çıkarıldı. Resimleri oluşturmak için bir kadavra kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Medial femoral kondil üzerine uygun çarpma tertibatı . (A) Platforma sabitlenmiş tavşan arka ayağı üzerindeki darbe aparatı. (B) Çarpma tertibatı ucunun çarpmadan önce medial femoral kondil üzerine uygun şekilde yerleştirilmesi. Perdeler, gösteri amacıyla rakamlardan çıkarıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Başarılı kıkırdak defekti . (A) Bu modelle oluşturulan kıkırdak yaralanmasının beklenen brüt görünümü. İç kısım, etkilenen kıkırdak yüzeyinin genişlemiş bir alanıdır ve kusur kesikli bir daire ile özetlenmiştir. (B) Distal femurda, arka kıkırdak yüzeyinden en az 5 mm uzaklıkta ve eklem yüzeyinin açısına yakın olacak şekilde uygun Steinman pin pozisyonu (femoral kondillerde radyolüsent daire). Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Başarısız kıkırdak defekti. Medial femoral kondilde yanlış yerleştirilmiş bir pimi gösteren radyografi, çarpma anında osteokondral kırığa neden olur. Kırmızı ok, Steinman piminin yanlış yerleştirildiğini gösterir. Siyah ok, kırık medial femoral kondili gösterir. Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Etkilenen medial femoral kondilde artmış osteoartrit şiddeti. Temsili (A) kontralateral ve (B) etkilenmiş medial femoral kondiller (MFC) kesitleri safranin-O (proteoglikan içerikli kırmızı boya) ve Fast Green (düşük proteoglikan içerikli bağ dokusunun mavi-yeşil boyası) ile boyanmıştır. Büyütme: 400x; ölçek çubuğu = 62.3 μm. (C) Etkilenen ve kontrol MFC'sinin OARSI puanlaması. (D) Gömülü diz ekleminden tüm eklem bölmelerinin OARSI skorları. (E) Etkilenmemiş kontralateral diz ekleminden eklem bölmelerinin OARSI skorları. (F) Gömülü ve darbesiz dizlerden eklem bölmelerinin OARSI skorları. Medial femoral kondil (MFC), medial tibial plato (MTP), lateral tibial plato (LTP) ve lateral femoral kondil (LFC). Grup karşılaştırmaları Student t-testi veya ANOVA ve ardından Tukey's HSD post-hoc testi kullanılarak yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Etkilenen MFC'de artmış apoptotik kondrositler. 400x büyütmede darbeden 16 hafta sonra (A) kontralateral yaralanmamış MFC ve (B) yaralı MFC'nin TUNEL ile boyanmış bölümlerini gösteren temsili görüntüler. Ölçek çubuğu = 62.3 μm. TUNEL pozitifliği kahverengi renkli çekirdeklerle gösterilir. (C) Etkilenen ve kontrol MFC'lerinde TUNEL-pozitif hücrelerin nicelleştirilmesi. Gruplar eşleştirilmiş Student t-testi ile karşılaştırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çalışmanın etki parametreleri. Buna Tepe Stresi (Megapaskal; MPa), Tepe Yükü (Newton; N), Yükleme Hızı (milisaniye başına megapaskal; MPa/ms), Darbe Süresi (milisaniye; ms), Çalışma (Joule; J), İmpuls (Newton saniye; N·s), Kinetik Enerji (Joule; J), İvme (metre bölü saniye kare; m/s²) ve Azami Yüke Kadar Geçen Süre (milisaniye; ms). Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Darbe ameliyatı süreleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Şu anda açıklanan modelin avantajları ve dezavantajları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Temel Platformun ayrıntılı parça açıklaması ve parça listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Drop Tower'ın ayrıntılı parça açıklaması ve parça listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Bölüm 01-Tavşan tutucu tablosunun çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Bölüm 02-Ön bacağın çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Bölüm 03-Ana bacağın çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: Bölüm 04-K-tel tutucu tabanının çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: Parça 05-Vida başlı K-tel tutucunun çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 8: Bölüm 06-Polietilen levhanın çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 9: Parça 07-Plakanın Çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 10: Bölüm 11-Üst tutucunun çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 11: Bölüm 16-Çarpma plakasının çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 12: Bölüm 17-Çarpma kirişinin çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 13: Parça 20-Çarpma Ucunun Çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 14: Çarpma tertibatı uç kafasının eğriliğinin çizimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 1: DropTestVIManual(1).vi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 2: ImpactAnalysis(1).m. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu cerrahi prosedür, bir PTOA modelinde tavşan medial femoral kondilinin ağırlık taşıyan yüzeyinde tutarlı kıkırdak hasarı oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu prosedürün bir avantajı, dize posterior yaklaşımın tüm posterior medial femoral kondilin doğrudan görüntülenmesine izin vermesi ve yaklaşık 37 dakikada gerçekleştirilebilmesidir (Tablo 2). Bunun açık bir yaralanma modeli olduğu ve sinovyum ve eklem kapsülündeki potansiyel hasara bağlı olarak sadece darbenin ötesinde akut inflamatuar değişikliklere yol açabileceği^{de unutulmamalıdır 17,44}. Modelin avantajları ve dezavantajları Tablo 3'te özetlenmiştir. Eklem stabilitesini sağlamak için bağ ve menisküs yapılara zarar vermemeye özen gösterildi. Sonuç olarak, kontralateral kontrol ekstremiteleri ile çarpma bölgesi dışındaki eklem kompartmanlarındaki (medial ve lateral tibial platolar ve lateral femoral kondiller) gömülü ekstremiteler arasında fark saptanmadı.

Bu protokolün en kritik yönü, femoral kondilde izole bir kıkırdak lezyonunun oluşturulmasıdır. Steinman pin yörüngesi bu yöntemin başarısını büyük ölçüde etkiler. Tel eklem yüzeyine paralel değilse veya medial femoral kondilin merkezine göre çok arkaya yerleştirilirse, femoral kondilin osteokondral kırığına yol açabilir (Şekil 5). Lateral epikondil, uygun bir pim yörüngesi için kullanılabilen, tutarlı bir şekilde elle tutulur bir dönüm noktasıdır.

Subkondral kemik kırığı olan hayvanlar çalışmadan çıkarılmalıdır. Mevcut çalışma yönteminde intraoperatif kırığa sekonder başarısızlık oranı %9.0 (67 ameliyatın 6'sı) olarak saptanmıştır. Bu kırılma oranı, kırılma oranı %28 olan MFC'nin yakın tarihli açık sarkaç tabanlı darbe modelinden daha ^{düşüktür45}. Cerrah ve çalışma ekibi yaklaşım ve sonuç konusunda kendilerini rahat hissedene kadar bu yöntemi kadavra örnekleriyle denemenizi öneririz. Bu yöntem, in vivo deneylerden önce arka bacakların ve tüm Yeni Zelanda Beyaz Tavşanlarının kadavra örneklerinde denendi.

Bu yöntem, daha önce yayınlanmış lapin akut kıkırdak hasarı oluşturma yöntemleriyle karşılaştırılabilir. Bu darbe modelinin 51,0 ± 16,0 MPa/ms'lik yükleme hızı, bir sarkaç (yaklaşık 0,5 ila 6 MPa/ms)35,46,47 veya pnömatik silindir (~^0,4 MPa/ms)³⁶ kullanılarak yapılan önceki çalışmalardan daha yüksekti ve yaylı bir darbe cihazından (~530 MPa/ms)³⁷ daha düşüktü. Mevcut darbe tekniği, önceki modellere kıyasla ılımlı bir yükü modelleyerek, sarkaç, yaylı ve pnömatik silindir beslemeli yüklerin önceki modelleriyle tutarlı olan %12,3'lük bir CV ile 81,9 ± 10,1 MPa'lık bir tepe gerilimi ile sonuçlanır, önceki dört model 10,1-169 MPa'lık gerilimler sağlar, CV'ler %0,85-40,5 arasında ^{değişir36,37, 45,46}.

Bu modelin bir sınırlaması, osteokondral kırıklar oluşturmaması ve dolayısıyla klinik ortamda görülen tipik eklem içi kırıkları tam olarak taklit etmemesidir¹⁷. Ayrıca, düşme kulesi taşıyıcısının çarpmadan önceki ortalama ivmesinin 6,4 ± 0,4 m/s 2 olduğu, muhtemelen bilyalı rulmanların sürtünmesi nedeniyle 9,8 m/s^2'lik yerçekimi serbest düşme ivmesinden daha düşük olduğu kaydedildi. Yine de yöntem, tam olarak anlaşılamayan PTOA patogenezinin etkilenmiş kıkırdak aracılı etkilerinin izole edilmesine izin verir.

Tanımlanan birkaç lapin modeli bir kondral yaralanmaya neden olsa da, düşme kulesi modeli ile dize posterior yaklaşımın kullanılması, patogenezinin incelenmesini ve yeni terapötiklerin test edilmesini sağlayan basit, etkili ve klinik olarak ilgili bir PTOA oluşturma yöntemi olarak öne çıkmaktadır. Genel olarak, lapin açık posteromedial femoral kondil darbe yaralanması modeli, PTOA ile ilişkili hücresel ve moleküler olayları incelemek ve kıkırdak hasarını önlemek veya hafifletmek için yeni terapötik hedefleri^48,49 belirlemek için umut verici bir platformdur.

Roman Natoli, AO Trauma North America için dersler veriyor, Current Osteoporosis Reports için bölüm editörü ve Morgan ve Claypool'dan ders kitabı telif hakları aldı. Todd McKinley, Innomed'dan telif ücreti alıyor. Kalan yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Satın Alma Faaliyeti'nden DoD Hakemli Tıbbi Araştırma Programı - Araştırmacı Tarafından Başlatılan Araştırma Ödülü W81XWH-20-1-0304, NIH NIAMS R01AR076477 ve NIH'den Kapsamlı Kas-İskelet Sistemi T32 Eğitim Programı (AR065971) ve NIH NIAMS Grant R01 AR069657. tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu projeye işleme ve imalat konusundaki uzmanlığını sağladığı için Kevin Carr'a ve histolojiye yardımcı oldukları için Drew Brown ve Indiana Kas-İskelet Sağlığı Kemik Histolojisi Çekirdeği Merkezi'ne teşekkür eder.