Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.

iPSC türevi beyin organoidi, sinir sisteminin patolojilerini ve ilaç taramasını modellemek için umut verici bir teknolojidir. Bu teknoloji son zamanlarda ortaya çıktı. Henüz emekleme aşamasındadır ve henüz çözülmemiş bazı sınırlamaları vardır. Mevcut protokoller organoid elde etmenin ilaç keşfi ve preklinik çalışmalar için yeterince tutarlı olmasına izin vermemektedir. Organoidlerin olgunlaşması bir yıla kadar sürebilir ve araştırmacıları aynı anda birden fazla farklılaşma süreci başlatmaya itebilir. Laboratuvar için alan ve ekipman açısından ek maliyetler getirmektedir. Ek olarak, beyin organoidleri genellikle merkezde besin ve oksijen eksikliğinden muzdarip nekrotik bir bölgeye sahiptir. Bu nedenle, mevcut protokollerin çoğu beslenmeyi iyileştirmek için kültür ortamı için dolaşım sistemi kullanır.

Bu arada organoid yetiştiriciliği için ucuz dinamik sistemler veya biyoreaktörler yoktur. Bu makalede, kompakt ve ucuz ev yapımı mini biyoreaktörlerde beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, büyük miktarlarda yüksek kaliteli organoidlerin elde etmeyi sağlar.

İnsan iPSC türevi modeller nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozuklukların çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır¹. Son on yılda, beyin organoidleri olarak adlandırılan 3D beyin dokusu modelleri, esasen geleneksel 2D nöronal kültürleri tamamlamıştır². Organoidler embriyonik beynin 3D mimarisini bir dereceye kadar yeniden kaplar ve daha hassas modellemeye izin verir. Farklı beyin bölgelerini temsil eden organoidlerin üretimi için birçok protokol yayınlanır: serebral korteks^3,4,5, beyincik⁶, orta beyin, forebrain, hipotalamus 7^,8,9ve hipokampus¹⁰. İnsan sinir sistemi hastalıklarını incelemek için organoid kullanmanın birden fazla örneği olmuştur¹¹. Ayrıca, organoidler ilaç keşiflerinde uygulandı 12 ve SARS-Cov-2^{13 ,14}dahil olmak üzere bulaşıcı hastalıkların çalışmalarında kullanıldı.

Beyin organoidlerinin çapı birkaç milimetreye kadar ulaşabilir. Bu nedenle, organoidin iç bölgesi hipoksi veya yetersiz beslenmeden muzdarip olabilir ve sonunda nekrotik hale gelebilir. Bu nedenle, birçok protokol özel biyoreaktörler⁸, çalkalayıcılar veya mikroakışkan sistemler¹⁵içerir. Bu aygıtlar büyük hacimli pahalı hücre kültürü ortamı gerektirebilir. Ayrıca, bu tür ekipmanların maliyeti genellikle yüksektir. Bazı biyoreaktörler, yeniden kullanım için sterilize etmelerini zorlaştıran birçok mekanik parçadan oluşur.

Çoğu protokol "toplu etkiden"^{muzdariptir 16}Özdeş iPSC'lerden elde edilen organoidler arasında önemli değişkenlik oluşturur. Bu değişkenlik, tekdüzelik gerektiren ilaç testlerini veya preklinik çalışmaları engeller. Tekdüze boyutta organoidleri seçecek kadar yüksek organoid verimi bu sorunu kısmen çözebilir.

Zaman faktörü de önemli bir sorundur. Matsui ve ark. (2018) beyin organoidlerinin olgunluğa ulaşmak için en az altı ay gerektirdiğini gösterdi¹⁷. Trujillo ve ark. (2019) ayrıca organoidlerde elektrofizyolojik aktivitenin sadece altı aylık ekimden sonra meydana geldiğini göstermiştir¹⁸. Uzun organoid olgunlaşma süresi nedeniyle, araştırmacılar genellikle bir öncekini tamamlamadan önce yeni bir farklılaşma başlatırlar. Birden fazla paralel farklılaşma süreci ek masraflar, ekipman ve laboratuvar alanı gerektirir.

Son zamanlarda esas olarak yukarıda belirtilen sorunları çözen bir mini biyoreaktör geliştirdik¹⁹. Bu ev yapımı biyoreaktör, merkezinde plastik bir düğme bulunan ultra düşük yapışma veya işlenmemiş Petri kabından oluşur. Bu plastik düğme, çalkalayıcının dönmesinden kaynaklanan Petri kabının merkezinde organoidlerin kalabalıklaşmasını ve tıkanmasını önler. Bu makale, bu ucuz ve basit ev yapımı mini biyoreaktörün büyük miktarlarda yüksek kaliteli beyin organoidleri üretmeye nasıl izin verdiğini açıklamaktadır.

NOT : 1.2 ve 1.3 adımları hariç olmak üzere protokol boyunca steril teknik kullanın. Hücrelere veya organoidlere uygulamadan önce tüm kültür ortamlarını ve çözeltilerini 37 °C'ye ısıtın. %80 nem üzerinde_%5 CO 2'de 37 °C'de bir CO₂ inkübatöründe hücre yetiştirin. Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Petri kaplarını mini biyoreaktörlere dönüştürmek

1. Steril 15 mL santrifüj tüplerini 7-8 mm yüksekliğinde halkalar halinde kesin; halkaları otoklavla.
2. Düşük yapışmalı, işlenmemiş veya mikrobiyolojik Petri kaplarını kırıntılara ayırın. Sıvı plastik hazırlamak için yaklaşık 1 g plastik kırıntıyı 10 mL kloroformda bir gecede çözün.
   DİkKAT: Duman kaputunda çalışın.
3. Elde eden sıvı plastiğin pipetleme için yeterince viskoz olup olmadığını kontrol edin; damlası küresel bir form tutar ve yüzeye yayılmaz. Çok sıvıysa, daha fazla plastik kırıntı ekleyin. Kalınsa, kloroform ekleyin.
4. Steril ultra düşük yapışma 6 cm Petri kabının ortasına plastik bir düğme yapın. Aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi eşit derecede uygun iki yol vardır.
   1. Otomatik kapatılmış plastik halkayı ortaya koyun ve sıvı plastiği halkanın içine bırakın.
   2. Herhangi bir plastik halka olmadan, sıvı plastiği Petri kabının ortasına bırakın.
5. Bulaşıkları kurutulana kadar laminer akış davlumbazında 2-3 saat açık bırakın. Kurutulmuş yemekleri 15-20 dakika ultraviyole radyasyonla tedavi edin.

2. iPSC'lerin nöronal farklılaşması indüksiyonu

1. Hücre dışı proteinlerden oluşan bir matrisle önceden kaplanmış 35 mm Petri kaplarında% 75-90'a kadar pluripotent kök hücreler için ortamda iPSC'ler yetiştirin.
2. Orta A-SR hazırlayın. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.
3. Yetiştirme ortamını epire edin ve 0.
4. Orta A'ya hazırlanın (bkz. Tablo 2).
5. Hücreleri 2-14.

3. 14. Günde nöroepithelial öncül hücrelerden sferoid oluşumu

1. 14. Günde, her kuyuda yaklaşık 1.200 mikrowell içeren özel bir 24 kuyu kültür plakası kullanarak nöroepithelial öncü hücrelerden sferoidler yapın (Şekil 2C). Aşağıda verilen prosedürü izleyin.
   NOT: Bu farklılaşma aşamasında, 35 mm Petri kabı genellikle 3 - 3,5 x 10⁶ nöroepithelial öncül hücre içerir. Bu nedenle, nöroepithelial öncü hücrelere sahip bir adet 35 mm Petri kabı, mikrowells ile 24 kuyulu kültür plakasının 3 - 4 kuyusu için yeterlidir.
2. Mikrowells ile 24 kuyulu bir kültür plakası hazırlayın: Her kuyuya, plaka tutucu ile donatılmış sallanan kova rotorunda 5 dakika boyunca 1.300 x g'da kısa bir süre 1 mL orta A. Santrifüj ekleyin. Mikroskop altında mikrowelllerde kabarcık olmadığını kontrol edin.
3. Orta B'ye hazırlanın (Tablo 3).
4. Ortamı nöroepithelial öncü hücrelerle Petri kabından çıkarın; hücreleri 2 mL DMEM/F12 ile yıkayın. Hücre müfrezesi için, PBS'de hazırlanan 1,5 mL 0,48 mM EDTA çözeltisi ile hücreleri tedavi edin. Mikroskop altında hücre müfrezesini kontrol edin.
5. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplar. Hücreleri yıkamak için tüpe 5 mL DMEM/F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj. Süpernatant ve resuspend hücreleri 2 mL orta B'de çıkarın.
6. Trypan Blue boyama ve hemositometre ile hücre konsantrasyonu ve canlılığını kontrol edin. Toplamda 1 x 10⁶ uygulanabilir hücre içermesi için gereken süspansiyon hacmini hesaplayın.
7. 1 x 10⁶ hücre içeren hücre süspansiyonunun mikrowells ile 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın. Her kuyuya 2 mL'ye kadar orta B ekleyin, hücreleri birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı borulayın ve mikrowelllerdeki hücreleri yakalamak için 1 dakika boyunca kısa bir süre 100 x g santrifüjleyin.
   NOT: Kuyu başına hücre sayısı 1 x 10^6'yıgeçmemelidir. Aksi takdirde, komşu mikrowelllerden gelen küreseller kaynaşır.
8. Mikroskop altında hücrelerin mikrowelllerde eşit olarak dağıtılıp dağıtılmadığını kontrol edin. Hücreler eşit olmayan şekilde dağıtılırsa pipetleme ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
9. Hücrelerin küresellerde toplanmasına izin vermek için plakayı bir gecede kuluçkaya yatırın.

4. Organoidlerin eldei ve yetiştirilmesi

1. Ertesi sabah (15. gün), mikroskop altında küresellerin kalitesini kontrol edin. Sağlıklıysa şeffaf ve pürüzsüz olduklarından emin olun (Şekil 2A,B). Küreselleri her kuyudan 15 mL'lik bir tüpe dikkatlice toplayın, küreselleri 2-3 dakika yerçekimi ile çökeltmek üzere bırakın ve ardından süpernatantı çıkarın.
2. Sferoidlere 2 mL matrisin buz üzerinde aynı anda çözülmüş ekleyin. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Matrisin fazlalığını yıkamak için, tüpe 8 mL orta B. Pipet ekleyin, ardından tüpü 100 x g'da1 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Küresellerin geri döndürülemez toplanmasını önlemek için santrifüjleme süresini ve hızını aşmayın.
4. Üsttekini çıkarın. Tüpe 2 mL orta B, pipet yavaşça ekleyin. Küresel süspansiyonu, her biri 4 mL orta B içeren iki mini biyoreaktör arasında bölün.
5. Petri kabını mini biyoreaktörlerle bir yörünge çalkalayıcıya koyun. Organoidleri 70-75 rpm dönme hızında yetiştirin.
6. 16. günde orta C(Tablo 4) hazırlayın.
7. Organoidleri 15 mL tüpe aktarın. 5 dakika boyunca, dibe düşmelerine izin verin, süpernatantı aspire edin, 5 mL orta C ekleyin.
   NOT: Şeffaf ve zar zor görülebilen küreselleri kaybetmemeye dikkat edin.
8. Sferoidleri iki hafta boyunca orta C'de yetiştirin ve ortamı her iki günde bir yenileyin. Bu iki haftanın sonunda, aşağıdaki ekim için mini biyoreaktör başına yaklaşık 100 küresel bırakın. Sıvı nitrojende donma ortamında aşırı küreselleri dondurun.
9. 30. günde orta D 'yi hazırlayın (Tablo 5).
10. Yetiştirme ortamını olgunlaşma ortamı olan orta D olarak değiştirin. Üç hafta boyunca her 2-3 günde bir ekim ortamını yenileyin, ardından BDNF ve GDNF olmadan orta D kullanın.

Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol, iPSC'lerin en az bir ay boyunca beyin organoidlerine farklılaştırılmış beş medyayı içeriyordu. Farklılaşma başladı, daha sonra iPSC'ler% 75-90 izdihama ulaştı (Şekil 2A, B). Nöronlara karşı farklılaşmanın ilk belirtileri, hücrelerin "rozetler" halinde kümelenmeye başladığı orta A'da iPSC ekiminin 10-11 günlerinde gözlenmiştir (Şekil 2C). 14-15. günlerde, iPSC'ler nöroepithelial progenitörlere farklılaştı. Hücrelerin % 99'u nöroepithelial belirteç SOX1 üzerinde pozitifti ve pluripotent hücre belirteçlerini TRA-1-81 ve OCT4(Ek Şekil S1)ifade etmedi. Daha sonra hücreleri EDTA içeren çözelti kullanarak hasat ettik ve orta B'de mikrowells(Şekil 2D)ile özel bir 24 kuyu kültür plakasına aktardık. Şekil 2E'degösterildiği gibi mikrowelllere transferden hemen sonra hücreler. Her mikrowell, hücrelerin tek bir küresele bölünmesini teşvik etti. Tüm mikrowelllerden gelen küreseller aynı boyuttaydı ve yaklaşık 100 hücre içeriyordu (Şekil 2J). Küresellerin oluşumundan sonra, taze çözülmüş matris ile kaplandılar ve orta C'de ev yapımı mini biyoreaktörlere aktarıldılar (Şekil 2H). Mini biyoreaktörler yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde 70-75 rpm hızında döndürüldü. Küreseloidler beyin organoidlerine farklılaştılar, hepsi eşit büyüdü ve morfogenez tüm organoidlerde aynı şekilde ilerledi.

Organoidler ilk üç ay boyunca büyüdü, daha sonra büyümeleri yavaşladı ve sonunda durdu. Altı ay boyunca kültüre edilen beyin organoidlerinin maksimum büyüklüğü yaklaşık 6 mm idi. Daha büyük organoidler, genellikle boşluklar veya nekrotik alanlarla gevşek bir merkezi bölgeye sahipti (Şekil 3). Farklılaşmanın d45'inde organoidlerin kriyoseksiyonlarının immünohistokimyasal lekelenmesi, olgunlaşmamış nöronları gösteren büyük SOX2 pozitif hücre kümelerini ortaya çıkardı (Şekil 4B). İki aylık organoidler tirozin hidroksilaz (TH), PAX6, beta-III-tubulin (TUBB3), MAP2 ve GFAP proteinleri(Şekil 4A , 4Cve 4D)gibi nöronal ve glial belirteçleri ifade ettiler. Yüksek kalitede organoidler için maksimum ekim süresi yaklaşık ~ 7 aydı.

Böylece, mini biyoreaktörlerde dinamik koşullar altında ekimin ardından aynı boyutta sferoidlerin oluşumu, aynı morfogenez yoluyla geliştirilen standart boyutlu organoidlerle sonuçlanır.

Şekil 1: Protokolün ana aşamaları. Başlangıçta, iPSC'ler% 70-95'e kadar pluripotent kök hücreler için ticari bir ortamda yetiştirilir. Protokolün bir sonraki aşaması iki adımdan oluşur. İlk olarak, 1-2 gün boyunca pluripotent kök hücreler için ortam orta A-SR olarak değiştirilir. İkincisi, hücreler iki hafta boyunca orta A'da yetiştirilir. Nöroepithelial hücrelerin rozetlerini oluşturduktan sonra, hücreler sferoid oluşturmak için orta B'li mikrowelllerle kültür plakasına aktarılır. Ertesi gün, elde edilen küreseller orta C ile mini biyoreaktörlere aktarılır. Organoidlerin daha fazla olgunlaşması orta D'de ilerler.

Şekil 2: Protokol yürütme sırasında mikroskop altında gözlenen anahtar morfolojik yapılar. (A) Düşük ikserlerdeki iPSC'ler, farklılaşmanın başlaması için yetersizdir. (B) Birleştiğinde iPSC'ler, farklılaşmayı başlatmak için uygundur. (C). Hasat öncesi rozet adı verilen nöroepithelial progenitors kümeleri. (D) Kültür plakasının altındaki boş mikrowells. (E) Mikrowells ile kültür plakasında tohumlamadan hemen sonra hücreler. (F) Gece kuluçkadan sonra, hücreler her mikrowell içinde küresel olarak toplanır. (J). Kaliteli küresel. H. Matris kaplamadan sonra küreseller. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Organoidlerin hematoksilin-eozin lekesi. (A-D) Yoğun merkezi bölge ile normal organoidler. (E) Epitel kaplı bir boşluğa sahip organoid. (F) Nekrotik merkezi bölgeli organoid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Organoidlerin immünohistokimyasal lekelenimi. Organoidler, nöral progenitörlerin (SOX2, B) ve sinir hücrelerinin (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI nükleer DNA'yı lekelemek için kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Orta A-SR bileşimi.

Tablo 2: Orta A bileşimi.

Tablo 3: Orta B bileşimi.

Tablo 4: Orta A bileşimi.

Tablo 5: Orta D bileşimi.

Ek Şekil S1: Farklılaşmanın d14'ünde hücre popülasyonu saflığı akış sitometrisi ve RT-PCR kullanılarak değerlendirildi. (A) Hücrelerin% 98'inden fazlası TRA-1-81 pluripotency işaretleyicisini kaybetti. (B) Hücrelerin çoğu (%>99) nöroepithelial belirteç SOX1 gösterdi. (C) Pou5F1 geninin anahtar pluripotency faktörü OCT4'ü kodlayan ifadesi üç farklı iPSC hattında (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L) büyük ölçüde azaldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Açıklanan protokol, tek tip boyutta yüksek kaliteli organoidlerin üretilmesine izin vermek için iki önemli adıma sahiptir. İlk olarak, organoidler hücre sayısı ve hücre olgunluğunda neredeyse aynı olan küresellerden büyür. İkincisi, ev yapımı biyoreaktörler her organoide, organoidlerin kalabalıklaşmadığı veya birbirine yapışmadığı tek tip bir ortam sağlar.

Hücre kalitesi ve hücre olgunlaşmasının durumu protokolü gerçekleştirmek için gereklidir. Nöronal farklılaşmanın iPSC'lerin%75-90 birleştiği noktada başlaması kritik öneme sahiptir. Hücre yoğunluğu çok düşükse, iPSC'ler nöronal olmayan yönlere farklılaşabilir. Nöronal progenitörler daha sonra daha savunmasız hale geldiği için iPSC'lerin iki haftalık nöronal indüksiyonunu aşmamak önemlidir. Farklılaşma sırasında, hücreler ve organoidler düzenli olarak taze ortamla birlikte verilmelidir, çünkü açlık organoid kalitesinin keskin bir şekilde düşmesine yol açar. Dinamik ekimde sadece kısa süreli molalara izin verilir.

Protokolün bazı değişikliklerine izin verilir. Herhangi bir inert biyolojik malzeme, mini biyoreaktörün orta kısmında bir düğme yapmak için uygulanabilir: floroplastik, polietilen, polipropilen. Sıvı plastiği hazırlamak için mikrobiyoloji için bir Petri kabı kullanılırsa, elde edilen mini biyoreaktörler nöronal sitotoksiklik açısından kontrol edilmelidir. Farklı çaplardaki Petri kapları biyoreaktör için bir temel görevi görebilirsiniz. Ancak, o zaman dönüş hızının ayarlanmasında gereklidir. Ayrıca, ortamın hacmi değiştirilirse dönüş hızının ayarlanması gerekir. Örneğin, 6 cm Petri kabındaki ortamın 8 mL'si için en uygun hız 70-75 rpm'dir.

Ortamın tarifi, farklı beyin bölgelerine özgü daha olgun beyin organoidleri veya organoidleri elde etmek için yeniden formüle edilebilir²⁰. Ayrıca, mikrowells ile kültür plakası karmaşık sferoidlerin oluşumu için uygundur. Örneğin, damarlı bir beyin organoidi almak için nöronal progenitörleri endotel progenitörleri ile karıştırmak mümkündür²¹. Diğer iPSC türevleri de diğer organoidleri elde etmek için mikrowells ile bir kültür plakasında küresellere toplanabilir: kondrosferler²², bağırsak organoidleri²³, vb.

Protokol, organoid olgunlaşması sırasında her 2-3 günde bir ortam değiştirmeyi gerektirir ve bu da yılın yarısını alabilir. Bu yüzden steril teknikler kullanırken özel dikkat edilmelidir. Mikoplazma enfeksiyonunun önlenmesi için profilaktik antimikrobiyal dozunun kullanılmasına izin verilir.

Protokol sınırlaması, oksijen ve besin maddelerinin büyük organoidlerin merkezine sınırlı yayılmasından kaynaklanmaktadır. Organoid üretimi için mevcut protokollerin çoğu bu sorundan^{muzdariptir 24}. Bizim koşullarımızda, büyüme durur ve organoid 6 mm'ye ulaşır. Daha büyük boyutlu organoidler merkezde nekrotik bölge geliştirdi. Muhtemelen, bu sorun vaskülerizasyon²¹ veya hiperoksijenasyon²⁵kullanılarak çözülebilir.

Diğer biyoreaktörlere kıyasla, ev yapımı mini biyoreaktörler maliyet ve uygun fiyat açısından belirgin avantajlara sahiptir. Ek olarak, küçüktürler. İnkübatördeki bir yörünge çalkalayıcıda birkaç düzine ev yapımı biyoreaktör tutabiliriz. Karıştırılmış biyoreaktörler kullanırken bu kadar çok biyoreaktörün inkübatörde tutulması mümkün değildir.

Sonuç olarak, sunulan protokol, insan beyninin in vitro modellemesinin gerekli olduğu biyomedikal ve farmakolojik çalışmalar için yararlıdır. Farklılaşma medya kompozisyonunu değiştirerek, farklı beyin bölgelerinden ve farklı olgunluk derecelerinde beyin organoidleri elde etmenin mümkün olduğuna inanıyoruz. Ayrıca, mini biyoreaktörlerin kullanımı büyük olasılıkla sinirsel farklılaşma ile sınırlı değildir ve protokol değiştirilirse, pluripotent veya yetişkin kök hücrelerden diğer organoidleri kurmak için de kullanılabilirler.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışma, Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı'ndan 075-15-2019-1669 hibesi (RT-PCR analizi) ve Rusya Bilim Vakfı'ndan 19-15-00425 sayılı hibe ile desteklendi (diğer tüm çalışmalar için). Yazarlar ayrıca Pavel Belikov'a video düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür etti. El yazmasındaki figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.