在自制迷你生物反应器中从诱导多能干细胞中生成脑类器官

在这里，我们描述了一种从人类诱导多能干细胞（iPSCs）产生脑类器官的方案。为了获得大量和高质量的脑类器官，我们使用自制的迷你生物反应器。

iPSC衍生的脑类器官是一种有前途的技术，用于 体外 建模神经系统的病理学和药物筛选。这项技术最近才出现。它仍处于起步阶段，并且有一些限制尚未解决。目前的方案不允许获得足够一致的类器官用于药物发现和临床前研究。类器官的成熟可能需要长达一年的时间，这促使研究人员同时启动多个分化过程。这在空间和设备方面给实验室带来了额外的成本。此外，脑类器官通常在中心有一个坏死区，患有营养和缺氧。因此，大多数现行方案使用循环系统作为培养基以改善营养。

同时，没有用于类器官培养的廉价动态系统或生物反应器。本文描述了一种在紧凑且廉价的自制小型生物反应器中生产脑类器官的方案。该协议允许大量获得高质量的类器官。

人类iPSC衍生的模型广泛用于神经发育和神经退行性疾病的研究^1。在过去的十年中，3D脑组织模型，即所谓的脑类器官，基本上补充了传统的2D神经元培养^物2。类器官在一定程度上概括了胚胎大脑的3D结构，并允许更精确的建模。许多方案已经发表，用于产生代表不同大脑区域的类器官:大脑皮层^3，4，5，小脑^6，中脑，前脑，下丘脑^7，8，9和海马^体10。已经有多个使用类器官研究人类神经系统疾病的例子¹¹。此外，类器官在药物发现¹²中实施，并用于传染病研究，包括SARS-Cov-2^13，14。

大脑类器官的直径可达几毫米。因此，类器官的内区可能患有缺氧或营养不良，最终变得坏死。因此，许多方案包括特殊的生物反应器^8、振荡器或微流体系统^15。这些设备可能需要大量昂贵的细胞培养基。此外，这种设备的成本通常很高。一些生物反应器由许多机械部件组成，使其难以灭菌以重复使用。

大多数方案都受到"批处理效应^"16的影响，这在从相同的iPSC获得的类器官之间产生了显着的变异性。这种变异性阻碍了需要一致性的药物测试或临床前研究。类器官的高产量足以选择大小均匀的类器官，可以部分解决这个问题。

时间因素也是一个重大问题。Matsui等人（2018）表明，脑类器官至少需要六个月才能达到成熟^17。Trujillo等人（2019）还证明，只有在培养六个月后，类器官中才会发生电生理活性¹⁸。由于类器官成熟时间长，研究人员经常在完成前一个分化之前启动新的分化。多个并行的差异化过程需要额外的费用、设备和实验室空间。

我们最近开发了一种迷你生物反应器，主要解决了上述^问题19。这款自制生物反应器由超低附着力或未经处理的培养皿组成，中间有一个塑料旋钮。这种塑料旋钮可防止类器官拥挤及其在培养皿中心的凝结，这是由振荡器的旋转引起的。本文描述了这种廉价而简单的自制迷你生物反应器如何能够大量产生高质量的脑类器官。

注意:在整个方案中使用无菌技术，不包括步骤1.2和1.3。在应用于细胞或类器官之前，将所有培养基和溶液加热至37°C。在37°C的CO₂ 培养箱中培养细胞，在80%湿度下在5%CO₂ 中培养细胞。协议方案如图 1所示。

1. 将培养皿转变为微型生物反应器

1. 将无菌的15 mL离心管切割成7-8毫米高的环;高压灭菌环。
2. 将低附着力、未经处理或微生物培养皿分解成碎屑。将约1克塑料屑溶解在10毫升氯仿中过夜，以制备液体塑料。
   注意:在通风橱中工作。
3. 检查得到的液体塑料是否足够粘稠，可以移液;它的液滴保持球形，不会在表面上扩散。如果非常液体，请添加更多的塑料屑。如果很厚，则加入氯仿。
4. 在无菌超低附着力6厘米培养皿的中心制作一个塑料旋钮。有两种同样合适的方法，详见下文。
   1. 将高压灭菌的塑料环放在中心，然后将液体塑料滴到环的内部。
   2. 在没有任何塑料环的情况下，将液体塑料放在培养皿的中心。
5. 将盘子在层流罩中打开2-3小时，直到干燥完成。用紫外线辐射处理干燥的盘子15-20分钟。

2. 诱导iPSCs的神经元分化

1. 在预涂有细胞外蛋白质的基质的35毫米培养皿中培养用于多能干细胞的培养基中培养高达75-90%汇合的iPSCs。
2. 准备介质 A-SR。有关详细信息，请参见表 1。
3. 吸出培养基，并在分化的第0天加入2mL A-SR培养基。
4. 准备培养基A（见表2）。
5. 从第2-14天开始，在培养基A中培养细胞两周，每隔一天在培养皿中刷新培养基。

3. 第14天神经上皮前体细胞球状体的形成

1. 在第14天，使用特殊的24孔培养板从神经上皮前体细胞中制造球状体，每个孔中含有约1，200个微孔（图2C）。请按照下面给出的步骤操作。
   注意:在这个分化阶段，35毫米培养皿通常含有3 - 3.5 x 10⁶ 个神经上皮前体细胞。因此，一个带有神经上皮前体细胞的35mm培养皿足以用于3-4孔具有微孔的24孔培养板。
2. 准备一个带有微孔的24孔培养板:向每个孔中加入1mL培养基A.在装有板架的摆动桶转子中以1，300×g短暂离心5分钟。 在显微镜下控制微孔中没有气泡。
3. 制备培养基B（表3）。
4. 用神经上皮前体细胞从培养皿中取出培养基;用2 mL DMEM / F12洗涤细胞。对于细胞脱离，用PBS制备的1.5mL0.48mM EDTA溶液处理细胞。在显微镜下控制细胞脱离。
5. 将细胞收集到15 mL管中。在试管中加入5mL DMEM / F12以洗涤细胞。以200×g离心5分钟。 除去上清液并将细胞重悬于2mL培养基B中。
6. 通过台盼蓝染色和血细胞计数器检查细胞浓度和活力。计算总共包含1 x 10⁶ 个活细胞所需的悬浮液体积。
7. 将含有1 x 10⁶个细胞的细胞悬浮液转移到具有微孔的24孔板的每个孔中。将培养基B最多2mL加入每个孔中，轻轻地上下移液细胞几次，然后以100×g短暂离心1分钟以捕获微孔中的细胞。
   注意:每孔的细胞数不应超过1 x 10⁶。否则，来自邻近微孔的球体会融合。
8. 在显微镜下检查细胞是否均匀分布在微孔中。如果细胞分布不均匀，则重复移液和离心。
9. 将板孵育过夜，让细胞聚集在球状体中。

4. 获得和培养类器官

1. 第二天早上（第15天），在显微镜下检查球体的质量。如果健康，请确保它们是透明和光滑的（图2A，B）。小心地将每个孔中的球体收集到15 mL管中，让球体通过重力沉淀2-3分钟，然后除去上清液。
2. 加入球体2 mL在冰上同时解冻的基质。通过移液轻轻混合，并在室温下孵育30分钟。
3. 为了洗涤多余的基质，将8mL培养基B.轻轻移液至管中，然后在100×g下离心管1分钟。
   注意:不要超过离心的时间和速度，以避免球体的不可逆聚集。
4. 除去上清液。将2 mL培养基B加入试管中，轻轻移液。将球状悬浮液在两个迷你生物反应器之间分开，每个生物反应器含有4 mL培养基B.将迷你生物反应器放入15厘米培养皿中，以防止水蒸发并避免污染。
5. 将带有迷你生物反应器的培养皿放在轨道振荡器上。以70-75rpm的旋转速率培养类器官。
6. 在第16天，准备培养基C（表4）。
7. 将类器官转移到15 mL管中。5分钟，让它们落到底部，吸出上清液，加入5毫升培养基C.将类器官返回到迷你生物反应器中。
   注意:注意不要丢失球体，这些球体是透明的，几乎看不见。
8. 在培养基C中培养球体两周，每两天刷新培养基。在这两周结束时，每个迷你生物反应器留下约100个球体用于以下培养。在液氮冷冻介质中冷冻过量的球体。
9. 在第30天，准备培养基D（表5）。
10. 将培养基改为培养基D，这是一种成熟培养基。每2-3天刷新培养基，持续三周，然后使用不含BDNF和GDNF的培养基D。

协议方案如图1所示。该协议包括五种培养基，其中iPSCs在至少一个月内分化为脑类器官。开始分化，然后iPSCs达到75-90%的汇合度（图2A，B）。在培养基A中iPSC培养的第10-11天观察到向神经元分化的最初迹象，当时细胞开始聚集成"玫瑰花"（图2C）。在第14-15天，iPSCs分化为神经上皮祖细胞。99%的细胞在神经上皮标志物SOX1上呈阳性，并且没有表达多能细胞标志物TRA-1-81和OCT4（补充图S1）。然后，我们使用含EDTA的溶液收获细胞，并将其在培养基B中转移到具有微孔的特殊24孔培养板中（图2D）。细胞在转移到微孔后立即，如图2E所示。每个微孔促进细胞聚集成单个球体。来自所有微孔的球体具有相同的大小，并且含有约100个细胞（图2J）。在形成球状体后，将它们涂上新鲜解冻的基质，并在培养基C中转移到自制的迷你生物反应器中（图2H）。迷你生物反应器在轨道振动器上以70-75 rpm的速率旋转。球状体分化成脑类器官，它们都均匀生长，所有类器官的形态发生过程相同。

类器官在前三个月生长，然后它们的生长减慢并最终停止。培养六个月的脑类器官的最大尺寸约为6毫米。较大的类器官具有松散的中心区域，通常具有空腔或坏死区域（图3）。在分化d45处对类器官冷冻切片的免疫组化染色显示大簇SOX2阳性细胞，表明未成熟的神经元（图4B）。两个月大的类器官表达神经元和神经胶质标志物，如酪氨酸羟化酶（TH），PAX6，β-III-微管蛋白（TUBB3），MAP2和GFAP蛋白（图4A，4C和4D）。高质量类器官的最长培养时间约为7个月。

因此，形成相同大小的球体，然后在小型生物反应器中动态条件下培养，导致通过相同的形态发生形成标准大小的类器官。

图1:协议的主要阶段。 最初，iPSCs在商业培养基中培养，用于多能干细胞高达70-95%的汇合度。该协议的下一阶段包括两个步骤。首先，对于1-2天，将多能干细胞的培养基改为培养基A-SR。其次，将细胞在培养基A中培养两周。在形成神经上皮细胞的玫瑰花环后，将细胞转移到具有培养基B的微孔的培养板中以形成球状体。第二天，获得的球体被转移到具有培养基C的小型生物反应器中。类器官的进一步成熟在培养基D中进行， 请点击此处查看此图的放大版本。

图2:在实验方案执行过程中在显微镜下观察到的关键形态结构（A）低汇合的iPSCs不足以开始分化。（B） iPSCs在汇合处，适合发射分化。（C）.神经上皮祖细胞簇，即收获前的所谓玫瑰花。（D）培养板底部的空微孔。（E）细胞刚接种在带有微孔的培养板中。（F）孵育过夜后，细胞聚集在每个微孔的球体中。（J）.质量好的椭球体。H.基质涂层后的球体。请点击此处查看此图的放大版本。

图3:类器官的血氧菌素-曙红染色。 （A-D）具有致密中央区的正常类器官。（E） 具有上皮衬里腔的类器官。（F） 具有坏死中心区的类器官。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:类器官的免疫组织化学染色。 类器官具有表达神经祖细胞（SOX2，B）和神经细胞（TH，PAX6，A;TUBB3， C;GFAP， MAP2， D）。DAPI用于染色核DNA。 请点击此处查看此图的放大版本。

表1:培养基A-SR的组成。

表2:培养基A的组成。

表3:培养基B的组成。

表4:培养基A的组成。

表5:培养基D的组成。

补充图S1:在分化的d14处，使用流式细胞术和RT-PCR评估细胞群纯度。（A）超过98%的细胞失去了多能性标记物TRA-1-81。（B）大多数细胞（>99%）表现出神经上皮标志物SOX1。（C）编码关键多能因子OCT4的POU5F1基因在三个不同的iPSC系（IPSRG2L，IPSPDL2.15L，IPSPDP1.5L）中的表达急剧下降。请点击此处下载此文件。

所描述的方案有两个关键步骤，允许产生大小均匀的高质量类器官。首先，类器官从在细胞数量和细胞成熟度上几乎相同的球体生长。其次，自制的生物反应器为每个类器官提供了一个统一的环境，在这个环境中，类器官不会聚集或粘在一起。

细胞质量和细胞成熟状态对于执行实验方案至关重要。在iPSC汇合75-90%处开始神经元分化至关重要。如果细胞密度太低，iPSC可以分化成非神经元方向。重要的是不要超过两周的神经元诱导iPSCs，因为神经元祖细胞后来变得更加脆弱。在分化过程中，细胞和类器官应定期供应新鲜培养基，因为饥饿会导致类器官质量急剧下降。在动态栽培中只允许短期休息。

允许对协议进行一些修改。任何惰性生物材料都可以应用于在微型生物反应器的中心部分制造旋钮:氟塑料，聚乙烯，聚丙烯。如果使用微生物学培养皿来制备液体塑料，则应检查所得的微型生物反应器的神经元细胞毒性。不同直径的培养皿可以作为生物反应器的基础。但是，那么调整转速是必要的。此外，如果介质的体积发生变化，则需要调整转速。例如，对于6厘米培养皿中的8 mL培养基，最佳速度为70-75 rpm。

培养基的配方可以重新配制，以获得更成熟的脑类器官或特定于不同大脑区域的类器官^20。此外，具有微孔的培养板适用于形成复杂的球体。例如，可以将神经元祖细胞与内皮祖细胞混合以接受血管化的脑类器官^21。其他iPSC衍生物也可以聚集在具有微孔的培养板中的球体中，以获得其他类器官:软球层^22，肠道类器官²³等。

该协议要求在类器官成熟期间每2-3天更换一次培养基，这可能需要一年中的一半时间。因此，使用无菌技术时应特别小心。允许使用预防性剂量的抗菌剂来预防支原体感染。

方案限制源于氧气和营养物质向大型类器官中心的有限扩散。大多数当前的类器官生成方案都存在此问题²⁴.在我们的条件下，生长停止，然后类器官达到6毫米。较大尺寸的类器官在中心发展坏死区。可能，这个问题可以使用血管形成²¹ 或超氧²⁵来解决。

与其他生物反应器相比，自制的微型生物反应器在成本和可负担性方面具有明显的优势。此外，它们很小。我们可以在培养箱中的一个轨道振动台上放置几十个自制的生物反应器。使用搅拌的生物反应器时，不可能在培养箱中维护这些生物反应器。

总之，所提出的方案有助于需要对人脑进行体外建模的生物医学和药理学研究。我们认为，通过改变分化培养基的组成，可以获得不同大脑区域和不同成熟度的脑类器官。此外，微型生物反应器的使用很可能不仅限于神经分化，如果方案被修改，它们也可用于从多能或成体干细胞中建立其他类器官。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了俄罗斯联邦科学和高等教育部（RT-PCR分析）的075-15-2019-1669赠款以及俄罗斯科学基金会第19-15-00425号赠款（用于所有其他工作）的支持。作者还感谢Pavel Belikov在视频编辑方面的帮助。手稿中的人物是用 BioRender.com 创作的。