自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。

iPSC由来の脳オルガノイドは、イン ビトロで 神経系の病理と薬物スクリーニングをモデル化するための有望な技術です。この技術は最近登場しました。それはまだ初期段階にあり、まだ未解決のいくつかの制限があります。現在のプロトコルは、オルガノイドを得ることを薬物発見および前臨床試験のために十分に一貫することを可能にしていない。オルガノイドの成熟には最大1年かかる可能性が高く、研究者は複数の分化プロセスを同時に開始する。それはスペースおよび装置の点で実験室のための付加的な費用を課す。さらに、脳オルガノイドは、多くの場合、栄養と酸素欠乏症に苦しむ中心に壊死領域を持っています。したがって、ほとんどの現行プロトコルは、栄養を改善するために培養培地の循環系を使用する。

一方、オルガノイド栽培のための安価な動的システムやバイオリアクターはありません。本論文では、小型で安価な自家製ミニバイオリアクターで脳オルガノイドを製造するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、大量に高品質のオルガノイドを得ることができます。

ヒトiPSC由来モデルは、神経発達および神経変性疾患の研究に広く使用されている^。過去10年間で、3D脳組織モデル、いわゆる脳オルガノイドは、本質的に伝統的な2Dニューロン^培養2を補完した。オルガノイドはある程度胚性脳の3Dアーキテクチャを再現し、より正確なモデリングを可能にする。大脳皮質^3、4、5、小脳^6、中脳、前脳、視床下部^7、8、9、海馬¹⁰の異なる脳領域を表すオルガノイドの生成のために多くのプロトコルが公開されています。ヒト神経系疾患¹¹を研究するためにオルガノイドを使用する複数の例がある。また、オルガノイドは、薬物発見¹²に実施され、感染症の研究に使用され、SARS-Cov-2^13,14を含む。

脳オルガノイドは直径数ミリメートルまで達することができます。だから、オルガノイドの内領域は、低酸素症や栄養失調に苦しみ、最終的に壊死的になることがあります。したがって、多くのプロトコルは、特殊なバイオリアクター^8、シェーカー、またはマイクロ流体システム¹⁵を含む。これらの装置は、大量の高価な細胞培養培地を必要とするかもしれない。また、このような機器のコストは通常高いです。一部のバイオリアクターは、再利用のために殺菌することが困難になる多くの機械的な部品で構成されています。

ほとんどのプロトコルは、同一のiPSCから得られたオルガノイド間で有意な変動性を生み出す「バッチ効果^」16に苦しんでいる。この変動は、薬物検査または均一性を必要とする前臨床試験を妨げる。オルガノイドの収率が高いため、均一なサイズのオルガノイドを選択できるほど、部分的にこの問題を解決できる。

時間係数も重大な問題です。松井ら(2018)は、脳オルガノイドが成熟¹⁷に達するまでに少なくとも6ヶ月を要することを示した。Trujilloら(2019)はまた、6ヶ月の培養¹⁸の後にのみオルガノイドで電気生理活性が起こったことを実証した。オルガノイド成熟時間が長いため、研究者はしばしば前の分化を完了する前に新しい分化を開始します。分化の複数の並列プロセスには、追加の費用、設備、および実験室スペースが必要です。

我々は最近、主に¹⁹上記の問題を解決するミニバイオリアクターを開発しました。この自家製バイオリアクターは、中央にプラスチックノブを備えた超低接着または未処理のペトリ皿で構成されています。このプラスチックノブは、シェーカーの回転によって引き起こされるペトリ皿の中央にオルガノイドとその凝集の混雑を防ぎます。この安価でシンプルな自家製ミニバイオリアクターが、高品質の脳オルガノイドを大量に生成する方法について説明します。

メモ:手順1.2と1.3を除いて、プロトコル全体で無菌技術を使用してください。細胞またはオルガノイドに塗布する前に、すべての培養培地と溶液を37°Cに温めます。CO2インキュベーターで、湿度80%で5%CO2で37°Cで細胞を培養します。プロトコル スキームを図1に示します。

1. ペトリ皿をミニバイオリアクターに変える

1. 高さ7-8ミリメートルのリングで滅菌15 mL遠心分離チューブをカット;リングをオートクレーブします。
2. 低接着、未処理または微生物学的なペトリ皿をパン粉に分解します。10mLのクロロホルムに約1gのプラスチックパン粉を一晩溶かし、液体プラスチックを調製する。
   注意:ヒュームフードで作業してください。
3. 得られた液体プラスチックがピペット処理に十分な粘性であることを確認してください。その落下は球形を保持し、表面に広がりません。それは非常に液体である場合は、より多くのプラスチックパン粉を追加します。厚い場合はクロロホルムを加えます。
4. 無菌超低接着6cmペトリ皿の中央にプラスチックノブを作ります。以下に詳しく説明する 2 つの適切な方法があります。
   1. オートクレーブプラスチックリングを中央に置き、液体プラスチックをリングの内側に落とします。
   2. プラスチック製のリングがない場合は、ペトリ皿の中央に液体プラスチックを落とします。
5. 乾燥するまで、皿流フードで2〜3時間開いたままにしておきます。乾燥した食器を15~20分間紫外線で処理します。

2. iPSCの神経分化誘導

1. 細胞外タンパク質からなるマトリックスをあらかじめコーティングした35mmペトリ皿で、最大75~90%の合流度合流を可能にする多能性幹細胞用培地でiPSCを培養します。
2. 中程度のA-SRを準備します。詳細については 、表 1 を参照してください。
3. 培養培地を吸引し、0日目の分化時にA-SR培地の2mLを加える。
4. メディア A を準備します ( 表 2 を参照)。
5. 2~14日目から2週間、1日おきにペトリ料理で培地をリフレッシュし、培地Aで細胞を培養します。

3. 14日目の神経上皮前駆細胞からのスフェロイドの形成

1. 14日目に、各ウェルに約1,200のマイクロウェルを含む特別な24ウェル培養プレートを用いて神経上皮前駆細胞からスフェロイドを作る(図2C)。以下の手順に従ってください。
   注:この分化段階では、35 mmのペトリ皿は通常3-3.5 x 10⁶ 神経上皮前駆細胞を含む。したがって、神経上皮前駆細胞を有する1つの35mmペトリ皿は、マイクロウェルを有する24ウェル培養プレートの3〜4ウェルで十分である。
2. マイクロウェル付きの24ウェル培養プレートを準備する:各井戸に、プレートホルダーを取り付けたスイングバケットローターで5分間、1,300 x g で1mLのミディアムA.遠心分離機を短時間追加します。マイクロウェルに気泡がないことを顕微鏡でコントロールする。
3. 媒体Bを準備する (表 3)。
4. ペトリ皿から神経上皮前駆細胞を除去する。DMEM/F12の2 mLで細胞を洗浄してください。細胞剥離の場合、PBSで調製した0.48 mM EDTA溶液の1.5 mLで細胞を処理します。顕微鏡下で細胞剥離を制御します。
5. 細胞を15 mLチューブに収穫します。チューブに5mLのDMEM/F12を加えて、細胞を洗浄します。200 x g で 5 分間遠心分離機。上清を取り除き、培地Bの2mLで細胞を再懸濁する。
6. トリパンブルー染色と血球計で細胞の濃度と生存率を確認します。合計で1 x 10⁶ の生存細胞を含むために必要な懸濁液の量を計算します。
7. 1 x 10⁶ 個の細胞を含む細胞懸濁液をマイクロウェル付き24ウェルプレートの各ウェルに移します。各ウェルに最大2 mLの培地Bを加え、ピペット細胞を数回上下に軽くピペットし、遠心分離機を1分間100 x g にしてマイクロウェル内の細胞を捕捉します。
   注:ウェルあたりのセルの数は1 x 10⁶を超えてはならない。それ以外の場合は、隣接するマイクロウェルからのスフェロイドが融合します。
8. 顕微鏡下で、細胞がマイクロウェルに均等に分布していることを確認します。細胞が不均一に分布している場合は、ピペット処理と遠心分離を繰り返します。
9. プレートを一晩インキュベートし、細胞をスフェロイドに凝集させます。

4. オルガノイドの入手と栽培

1. 翌朝(15日目)、顕微鏡下でのスフェロイドの品質を確認する。正常であれば、透明で滑らかであることを確認します(図2A、B)。慎重に15 mLチューブに各ウェルからスフェロイドを収集し、2〜3分間重力で沈殿するためにスフェロイドを残し、その後、上清を除去します。
2. 氷上で同時に解凍したマトリックスの2mLの回転楕円体に加えます。ピペットで軽く混ぜ、室温で30分間インキュベートします。
3. マトリックスの余分を洗浄するには、ミディアムB.ピペットのチューブ8 mLにそっと加え、100 x gでチューブを1分間遠心します。
   注: 回転楕円体の不可逆的な凝集を避けるために、遠心分離の時間と速度を超えないでください。
4. 上清を取り除く。ミディアムBのチューブ2 mLに、ピペットをそっと加えます。スフェロイド懸濁液を2つのミニバイオリアクターに分割し、それぞれに4mLの媒体Bを含み、ミニバイオリアクターを15cmのペトリ皿に入れて水の蒸発を防ぎ、汚染を避けます。
5. 軌道シェーカーにミニバイオリアクター付きのペトリ皿を置きます。オルガノイドを70~75rpmの回転速度で栽培します。
6. 16日目に、中程度のCを準備します(表4)。
7. オルガノイドを15mLチューブに移します。5分間、底に落ちるようにし、上清を吸引し、5 mLの培地Cを加え、オルガノイドをミニバイオリアクターに戻します。
   注:透明でほとんど見えない回転楕円体を失わないように注意してください。
8. スフェロイドを培地Cで2週間栽培し、2日ごとに培地をリフレッシュする。この2週間の終わりに、ミニバイオリアクターあたり約100個のスフェロイドを残し、次の栽培を行う。液体窒素中の凍結媒体中の過剰なスフェロイドを凍結する。
9. 30日目に、中程度のD(表5)を準備します。
10. 成熟培地である培地Dに栽培培地を変更する。3週間2〜3日ごとに培養培地をリフレッシュし、BDNFおよびGDNFなしで培地Dを使用する。

プロトコル スキームを図1に示します。このプロトコルには、iPSCが少なくとも1ヶ月間に脳オルガノイドに分化する5つのメディアが含まれていました。分化が開始された後、iPSCは75-90%の合流点に達した(図2A、B)。細胞が「ロゼット」に集まり始めた時、ニューロンに対する分化の最初の兆候は、10~11日目に、細胞が「ロゼット」に集まり始めた時に、A培地でのiPSC培養の10~11日目に観察された(図2C)。14-15日目に、iPSCは神経上皮前駆細胞に分化した。細胞の99%は、神経上皮マーカーSOX1に陽性であり、多能性細胞マーカーTRA-1-81およびOCT4を発現しなかった(補助図S1)。次に、EDTA含有溶液を用いて細胞を採取し、ミディアムBでマイクロウェルを有する特殊な24ウェル培養プレートに移した(図2D)。図 2Eに示すように、マイクロウェルに移った直後のセル。各マイクロウェルは、細胞の凝集を単一のスフェロイドに促進した。すべてのマイクロウェルからのスフェロイドは同じ大きさで、約100個の細胞が含まれていた(図2J)。スフェロイドの形成後、それらは解凍したばかりのマトリックスでコーティングされ、中Cで自家製のミニバイオリアクターに移された(図2H)。ミニバイオリアクターは、70〜75rpmの速度で軌道シェーカー上で回転させた。スフェロイドは脳オルガノイドに分化し、すべてが均等に成長し、形態形成はすべてのオルガノイドで同じように進行した。

オルガノイドは最初の3ヶ月の間に成長し、その後、彼らの成長は減速し、最終的に停止しました。6ヶ月間培養した脳オルガノイドの最大サイズは約6mmであった。大きなオルガノイドは緩い中央ゾーンを有し、しばしば空洞または壊死領域を有する(図3)。分化のd45でのオルガノイドのクライオセクションの免疫組織化学的染色は、SOX2陽性細胞の大規模なクラスターを明らかにし、未熟なニューロンを示す(図4B)。2ヶ月前のオルガノイドは、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、PAX6、β-III-チューブリン(TUBB3)、MAP2、およびGFAPタンパク質(図4A、4C、および4D)などの神経およびグリアマーカーを発現した。高品質のオルガノイドの最大栽培時間は約〜7ヶ月であった。

したがって、ミニバイオリアクターにおける動的条件下での培養に続いて同じサイズのスフェロイドの形成は、同一の形態形成を経て開発された標準サイズのオルガノイドをもたらす。

図1: プロトコルの主要な段階 初めに、iPSCは、70-95%合流までの多能性幹細胞用の市販培地で栽培されています。プロトコルの次の段階は、2 つのステップで構成されます。まず、1〜2日間、多能性幹細胞の培地を培地A-SRに変更する。第二に、細胞は2週間培地Aで培養される。神経上皮細胞のロゼットを形成すると、細胞は、スフェロイドを形成するために、培地Bとマイクロウェルで培養プレートに移されます。翌日、得られたスフェロイドは培地Cと共にミニバイオリアクターに移される。オルガノイドのさらなる成熟は、中Dで 進行します。

図2:プロトコル実行中に顕微鏡下で観察された主要形態構造(A)低合流のiPSCは、分化の開始には不十分である。(B) 合流中のiPSCは、分化を開始するのに適している。(C)神経上皮前駆物質のクラスター、いわゆるロゼットを収穫する前に。(D) 培養プレートの底部にある空のマイクロウェル。(E) ミクロウェルで培養プレートに播種した直後の細胞。(F)一晩インキュベーションした後、各マイクロウェルのスフェロイド中の細胞が凝集する。(J) 良質のスフェロイド。H.マトリックスコーティング後の回転楕円体。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:オルガノイドのヘマトキシリン-エオジン染色 (A-D)密な中央ゾーンを有する正常なオルガノイド。(E) 上皮が並ぶ空洞を有するオルガノイド。(F) 壊死性の中心ゾーンを有するオルガノイド。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:オルガノイドの免疫組織化学的染色 オルガノイドは、神経前駆細胞(SOX2、B)および神経細胞(TH、PAX6、A)のマーカーを発現する細胞のクラスターを持っていた。タブ3、C;GFAP、MAP2、D)。DAPIは核DNAの染色に使用されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:中型A-SRの組成

表2:培地Aの組成

表3:培地Bの組成。

表4:培地Aの組成

表5:培地Dの組成

補足図S1:分化のd14で、細胞集団純度をフローサイトメトリーおよびRT-PCRを用いて評価した。 (A) 細胞の98%以上が多能性マーカーTRA-1-81を失った。(B)ほとんどの細胞(>99%)は、神経上皮マーカーSOX1を示した。(C) 主要多能性因子OCT4をコードするPOU5F1遺伝子の発現は、3つの異なるiPSCライン(IPSRG2L、IPSPDL2.15L、IPSPDP1.5L)において大幅に減少した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

記載されたプロトコルは、均一なサイズの高品質オルガノイドの生成を可能にする2つの重要なステップを有する。まず、オルガノイドは、細胞数と細胞成熟度がほぼ同じスフェロイドから成長する。第二に、自家製のバイオリアクターは、オルガノイドが群がったりくっつくりしない均一な環境を各オルガノイドに提供します。

細胞の品質と細胞成熟の状態は、プロトコルを実行するために不可欠です。iPSCの75~90%合流で神経分化を開始することが重要です。細胞密度が低すぎると、iPSCは非神経方向に分化することができます。後に神経前駆物質が脆弱になるため、iPSCの2週間を超えないことが重要です。分化の間、飢餓はオルガノイドの質の急激な低下につながるので、細胞およびオルガノイドは、定期的に新鮮な培地と一緒に供給されるべきである。動的栽培では、短期休憩のみが許可されます。

プロトコルの一部の変更が許可されます。任意の不活性生物材料は、ミニバイオリアクターの中央部にノブを作るために適用することができます:フッ素樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン。微生物学用のペトリ皿を使用して液体プラスチックを調製する場合、得られたミニバイオリアクターは神経細胞毒性についてチェックする必要があります。異なる直径のペトリ皿は、バイオリアクターのベースとして機能することができます。ただし、その後、回転速度の調整が必要です。また、媒体の音量が変化した場合は回転速度を調整する必要があります。例えば、6cmのペトリ皿中の培地の8 mLに対して、最適な速度は70〜75rpmである。

培地のレシピは、異なる脳領域²⁰に特異的な、より成熟した脳オルガノイドまたはオルガノイドを得るために再定式化することができる。また、マイクロウェルを有する培養プレートは、複雑なスフェロイドの形成に適している。例えば、血管形成された脳オルガノイド²¹を受け取るために、内皮前駆細胞と神経前駆細胞を混合することができる。他のiPSC誘導体は、マイクロウェルを有する培養プレート中のスフェロイドに凝集して、他のオルガノイド(軟骨球^22、腸内オルガノイド²³など)を得ることができる。

プロトコルは、オルガノイド成熟の間に2〜3日ごとに培地を変更する必要があり、これは年の半分を取ることができます。滅菌技術を使用する際には特別な注意が必要です。マイコプラズマ感染の予防のために抗菌剤の予防用量を使用することが許される。

プロトコルの制限は、酸素と栄養素の大きなオルガノイドの中心への限定的な拡散から生じる。オルガノイド生成のためのほとんどの現行プロトコルは、この問題²⁴に苦しんでいます。我々の条件では、成長は停止し、その後、オルガノイドは6ミリメートルに達する。大きなサイズのオルガノイドは、中央に壊死性帯を発達した。おそらく、この問題は血管化²¹ または過酸素化²⁵を用いて解決できる。

他のバイオリアクターと比較して、自家製ミニバイオリアクターは、コストと手頃な価格の面で明らかな利点を持っています。また、それらは小さいです。私たちは、インキュベーターの1つの軌道シェーカーに数十の自家製バイオリアクターを維持することができます。攪拌されたバイオリアクターを使用する場合、インキュベーターでこれらの多くのバイオリアクターを維持することは不可能である。

結論として、提示されたプロトコルは、ヒト脳のインビトロモデリングが必要な生物医学的および薬理学的研究に有用である。分化培地組成を変化させることで、異なる脳領域や成熟度の異なる脳オルガノイドを得ることが可能であると考えています。また、ミニバイオリアクターの使用は神経分化に限定されない可能性が高く、プロトコルが改変された場合、多能性または成体幹細胞から他のオルガノイドを確立するためにも使用できる。

著者らは開示するものは何もない。

この研究は、ロシア連邦科学高等教育省からの助成金075-15-2019-1669(RT-PCR分析)とロシア科学財団からの助成金No.19-15-00425(他のすべての仕事のために)によって支えられました。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。