집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

iPSC 유래 뇌 오르가노이드는 신경계 및 약물 검진의 병리를 모델링하는 시험관 내 유망한 기술입니다. 이 기술은 최근에 등장했습니다. 아직 초기 단계에 있으며 아직 해결되지 않은 몇 가지 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 약물 발견 및 전임상 연구를 위해 오르가노이드를 얻는 것이 충분히 일관되지 않습니다. 오르가노이드의 성숙은 1 년까지 걸릴 수 있습니다, 동시에 여러 분화 프로세스를 시작하는 연구원을 밀어. 그것은 공간과 장비의 측면에서 실험실에 대한 추가 비용을 부과한다. 또한, 뇌 오르가노이드는 종종 중앙에 괴사 영역을 가지고, 이는 영양소와 산소 결핍으로 고통. 따라서, 대부분의 현재 프로토콜은 영양을 개선하기 위해 배양 매체에 대한 순환 시스템을 사용합니다.

한편, 오르가노이드 재배를 위한 저렴한 동적 시스템이나 생물 반응기는 없습니다. 이 논문은 컴팩트하고 저렴한 수제 미니 바이오 리액터에서 뇌 오르가노이드를 생산하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 대량으로 고품질 의 오르가노이드를 얻을 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 모델은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환^1의연구에서 널리 사용된다. 지난 10 년 동안, 3D 뇌 조직 모델, 소위 뇌 오르가노이드, 본질적으로 전통적인 2D 신경 문화를 보완^2. 오르가노이드는 배아 뇌의 3D 아키텍처를 어느 정도 재구성하고 보다 정확한 모델링을 허용합니다. 대뇌 피질^3,4,5,소뇌^6,중뇌, 전뇌, 시상하부^7,8,9,해마¹⁰: 많은 프로토콜은 다른 뇌 영역을 나타내는 오르가노이드의 생성을 위해 게시된다. 인간 신경계 질환을 연구하기 위해 오르가노이드를 사용하는 여러 가지 예가^{있었다(11)}. 또한, 오르가노이드는 약물^{발견(12)에서} 구현되었고 SARS-Cov-2^13,14를포함한 전염병 연구에 사용되었다.

뇌 오르가노이드는 직경이 최대 몇 밀리미터에 달할 수 있습니다. 따라서 오르가노이드의 내부 영역은 저산소증이나 영양실조로 고생하고 결국 괴사가 될 수 있습니다. 따라서, 많은 프로토콜은 특수 생물 반응기^8,셰이커, 또는 미세 유체^{시스템(15)을}포함한다. 이러한 장치는 고가의 세포 배양 매체의 대량을 요구할 수 있다. 또한 이러한 장비의 비용은 일반적으로 높습니다. 일부 생물 반응기는 재사용을 위해 살균하기 어렵게 만드는 많은 기계적 부품으로 구성됩니다.

대부분의 프로토콜은 동일한 iPSC에서 얻은 오르가노이드 간에 상당한 변동성을 생성하는 "배치 효과"^16으로인해 어려움을 겪습니다. 이 가변성은 균일성을 요구하는 약물 검사 또는 전임상 연구를 방해합니다. 균일 한 크기의 오르가노이드를 선택할 만큼 충분히 오르가노이드의 높은 수율은 부분적으로이 문제를 해결할 수 있습니다.

시간 계수도 중요한 문제입니다. 마쓰이 외(2018)는 뇌 오르가노이드가 성숙도^17에도달하기 위해서는 최소 6개월이 필요하다는 것을 보여주었다. Trujillo 외(2019)는 또한 전기생리활성이 6개월간의 재배 후^18일후에만 오르가노이드에서 발생했다는 것을 입증하였다. 긴 오르가노이드 성숙 시간으로 인해 연구자들은 종종 이전 을 완료하기 전에 새로운 차별화를 시작합니다. 차별화의 여러 병렬 프로세스에는 추가 비용, 장비 및 실험실 공간이 필요합니다.

최근에는 19위에 언급된 문제를 주로 해결하는 미니 바이오반응기를^{개발했습니다.} 이 집에서 만든 생물 반응기는 중앙에 플라스틱 노브가있는 초저 접착 또는 처리되지 않은 페트리 접시로 구성되어 있습니다. 이 플라스틱 노브는 셰이커의 회전에 의해 발생하는 페트리 접시의 중심에 오르가노이드의 혼잡과 그들의 응축을 방지합니다. 이 논문은 이 저렴하고 간단한 수제 미니 바이오 리액터가 어떻게 고품질의 뇌 오르가노이드를 대량으로 생성할 수 있는지 설명합니다.

참고 : 1.2 단계와 1.3 단계를 제외하고 프로토콜 전체에 멸균 기술을 사용합니다. 세포 나 오르가노이드에 적용하기 전에 모든 배양 매체와 솔루션을 37 °C로 따뜻하게하십시오. CO₂ 인큐베이터에서 80% 습도에 따라 5% CO_2에서 37°C에서 세포를 재배합니다. 프로토콜 구성표는 그림 1에표시됩니다.

1. 페트리 접시를 미니 바이오 반응기로 변환

1. 높이 7-8mm의 고리에 멸균 15 mL 원심분리기 튜브를 잘라; 링을 자동 복제합니다.
2. 낮은 접착, 치료되지 않은 또는 미생물 페트리 접시를 부스러기로 나누기. 액체 플라스틱을 준비하기 위해 밤새 10mL의 클로로포름에 플라스틱 부스러기 1 g을 녹입니다.
   주의: 연기 후드에서 작업합니다.
3. 결과 액체 플라스틱이 파이펫팅에 충분히 점성이 있는지 확인하십시오. 그 드롭구형 형태를 유지하고 표면에 확산되지 않습니다. 매우 액체인 경우 플라스틱 부스러기를 더 추가합니다. 두꺼운 경우 클로로폼을 추가합니다.
4. 멸균 초저 접착 6cm 페트리 접시의 중앙에 플라스틱 손잡이를 만드십시오. 아래에 자세히 설명된 두 가지 적절한 방법이 있습니다.
   1. 오토클레이브 플라스틱 링을 중앙에 놓고 액체 플라스틱을 링 안쪽에 놓습니다.
   2. 플라스틱 링없이 페트리 접시의 중앙에 액체 플라스틱을 떨어 뜨립니다.
5. 건조될 때까지 라미나르 플로우 후드에 2-3시간 동안 요리를 열어 둡니다. 말린 요리는 15-20 분 동안 자외선으로 처리하십시오.

2. iPSC의 신경 분화 유도

1. 다능성 줄기 세포를 위한 매체에서 iPSCs를 35mm 페트리 접시에 세포외 단백질로 구성된 매트릭스로 미리 코팅하여 최대 75-90% 결합하도록 경배합니다.
2. 중간 크기 A-SR을 준비합니다. 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
3. 재배 배지를 흡인하고 0일째에 A-SR 배지2mL를 첨가한다.
4. 중간 크기 A를 준비합니다(표 2참조).
5. 2-14일부터 2주 동안 중간 크기의 A에서 세포를 재배하고, 페트리 요리에 매번 상쾌한 매체를 재배합니다.

3. 14일째에 신경피상전구체 세포에서 스페로이드형성

1. 14일째되는 날, 각우물(도 2C)에약 1,200마이크로웰을 함유한 특수 24웰 배양판을 사용하여 신경전구체로부터 스페로이드를 만듭니다. 아래에 주어진 절차를 따르십시오.
   참고 : 이 분화 단계에서 35mm 페트리 접시에는 보통 3 -3.5 x 10⁶ 신경 전구체 세포가 들어 있습니다. 따라서, 신경전구체 세포를 가진 35mm 페트리 접시 1개는 마이크로웰이 있는 24웰 배양판의 3-4웰에 충분합니다.
2. 마이크로웰이 장착된 24웰 배양 판을 준비: 각 웰에 1mL의 중간 A. 원심분리기를 1,300 x g에 5분 간 간단히 추가합니다. 마이크로웰에 거품이 없다는 현미경의 밑에 통제합니다.
3. 중간 값 B(표 3)를준비합니다.
4. 신경 피상화 전구체 세포와 페트리 접시에서 배지를 제거; DMEM/F12의 2mL로 셀을 세척합니다. 세포 분리의 경우, PBS에서 제조된 0.48 mM EDTA 용액의 1.5mL로 세포를 치료한다. 현미경의 밑에 세포 분리를 통제합니다.
5. 세포를 15mL 튜브로 수확합니다. 세포를 세척하기 위해 튜브에 DMEM / F125 mL을 추가합니다. 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안. 중간 형 B의 2 mL에서 상체를 제거하고 세포를 다시 중단합니다.
6. Trypan Blue 염색 및 혈종계에 의해 세포 농도 및 생존가능성을 확인하십시오. 총 1 x 10⁶ 실행 가능한 셀을 포함하는 데 필요한 서스펜션의 양을 계산합니다.
7. 마이크로웰이 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 1 x 10⁶ 세포를 포함하는 세포 현탁액을 전달합니다. 중간 크기 B를 각 우물에 최대 2mL로 추가하고, 부드럽게 파이펫 셀을 여러 번 내리고, 원심분리기는 1분 동안 짧게 100 x g씩 미세웰에서 세포를 포획합니다.
   참고: 웰당 셀 수는 1 x 10^6을초과해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면, 이웃 마이크로웰에서 스페로이드퓨즈.
8. 세포가 마이크로웰에 고르게 분포되어 있다는 현미경의 밑에 확인하십시오. 세포가 고르지 않게 분포되는 경우 파이프팅 및 원심분리를 반복합니다.
9. 세포를 스페로이드로 집계할 수 있도록 밤새 플레이트를 배양합니다.

4. 오르가노이드의 획득 및 재배

1. 다음날 아침(15일)은 현미경으로 스페로이드의 품질을 확인합니다. 건강하다면 투명하고 매끄러운지 확인하십시오(그림2A,B). 각 우물에서 15mL 튜브로 스페로이드를 조심스럽게 수집하고, 스페로이드를 2-3분 동안 중력에 의해 침전한 다음 상체를 제거합니다.
2. 얼음에 동시에 해동 매트릭스의 스페로이드 2 mL에 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
3. 매트릭스의 과잉을 세척하려면, 튜브에 중간 값 B. 파이펫을 부드럽게 추가 한 다음 100 x g에서1 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.
   참고: 스페로이드의 돌이킬 수 없는 응집을 피하기 위해 원심 분리의 시간과 속도를 초과하지 마십시오.
4. 상부체를 제거합니다. 튜브에 중간 B, 파이펫을 부드럽게 넣습니다. 스페로이드 현탁액을 2개의 미니 바이오 반응기로 분할하여 각각 4mL의 중간 B를 함유하고 있으며, 미니 바이오액터를 15cm 페트리 접시에 놓아 물의 증발을 방지하고 오염을 방지합니다.
5. 페트리 접시에 미니 바이오 리액터를 궤도 셰이커에 놓습니다. 70-75 rpm의 회전 속도로 오르가노이드를 재배합니다.
6. 16일째에 중간C(표 4)를준비한다.
7. 오가노이드를 15mL 튜브로 옮기습니다. 5 분 동안, 그들은 바닥에 떨어질 수 있도록, 슈퍼 나티를 흡인, 중간 C. 미니 생물 반응기에 오르가노이드를 반환의 5 mL을 추가.
   참고: 투명하고 거의 보이지 않는 스페로이드를 잃지 않도록 주의하십시오.
8. 중간 C에서 2 주 동안 스페로이드를 재배하고 2 일마다 배지를 상쾌하게합니다. 이 2 주 말에, 다음 재배를 위해 미니 생물 반응기 당 약 100 스페로이드를 둡니다. 액체 질소의 동결 배지에 과도한 스페로이드를 동결합니다.
9. 30일째에 중간D(표 5)를준비합니다.
10. 성숙 배지인 중간 D로 재배 매체를 변경한다. 3 주 동안 2-3 일마다 재배 배지를 새로 고친 다음 BDNF 및 GDNF없이 중간 D를 사용합니다.

프로토콜 구성표는 그림 1에표시됩니다. 프로토콜에는 iPSC가 적어도 한 달 동안 뇌 오르가노이드로 분화된 5개의 미디어가 포함되어 있습니다. 차별화는 iPSC가 75-90%의합류(그림 2A,B)에도달한 후 시작되었다. 세포가 "로제트"(도2C)로클러스터되기 시작했을 때 중간 A에서 iPSC 재배의 일 10-11일에 신경을 향한 분화의 첫 징후가 관찰되었다. 14-15 일, iPSCs는 신경 상피 선조로 분화했습니다. 세포의 99%는 신경피상동맥 마커 SOX1에 양성이었고 만능 세포 마커 TRA-1-81 및 OCT4(보충도면 S1)를발현하지 않았다. 그런 다음 EDTA 함유 용액을 사용하여 세포를 수확하고 마이크로웰(그림2D)을함유한 특수 24웰 배양판으로 중간 B로 옮겼습니다. 도 2E에도시된 바와 같이 마이크로웰로 이송된 직후세포. 각 마이크로웰은 세포의 집합을 단일 스페로이드로 승진시켰습니다. 모든 마이크로웰의 스페로이드는 동일한 크기였으며 약 100개의세포(도 2J)를함유하였다. 스페로이드가 형성된 후, 갓 해동된 매트릭스로 코팅되어 중간 C에서 집에서 만든 미니 바이오 리액터(그림2H)로옮겼습니다. 미니 바이오 액터는 70-75 rpm의 속도로 궤도 셰이커에서 회전했습니다. 구체는 모두 고르게 자란 뇌 오르가노이드로 분화되었고, 형태발생은 모든 오르가노이드에서 동일하게 진행되었습니다.

오르가노이드는 처음 3 개월 동안 성장한 다음 성장이 둔화되고 결국 멈췄습니다. 6 개월 동안 배양 된 뇌 오르가노이드의 최대 크기는 약 6mm였습니다. 더 큰 오르가노이드는 종종 충치 또는 괴사 영역(그림 3)과느슨한 중앙 영역을 했다. 분화의 d45에서 오르가노이드의 극저부미저분의 면역조직화학적 염색은 미성숙뉴런(도4B)을나타내는 SOX2 양성 세포의 큰 클러스터를 드러냈다. 2개월 된 오르가노이드는 티로신 하이드록실라제(TH), PAX6, 베타-III-튜룰린(TUBB3), MAP2 및 GFAP단백질(도 4A,4C및 4D)과같은 신경 및 신경질 마커를 발현하였다. 고품질의 오르가노이드에 대한 최대 재배 시간은 약 ~ 7 개월이었습니다.

따라서, 동일한 크기의 스페로이드의 형성은 미니 생물 반응기에서 동적 조건하에서 재배에 이어 동일한 형태 발생을 통해 개발된 표준 크기의 오르가노이드를 초래한다.

그림 1: 프로토콜의 주요 단계입니다. 처음에 iPSC는 최대 70-95%의 만능 줄기 세포를 위한 상용 배지에서 재배된다. 프로토콜의 다음 단계는 두 단계로 구성됩니다. 첫째, 1-2일 동안, 만능 줄기 세포를 위한 배지는 중간 A-SR로 변경된다. 둘째, 세포는 2주 동안 중간 A에서 재배된다. 신경상피성 세포의 장미를 형성하면 세포는 중간 B가있는 마이크로웰이있는 배양 판으로 옮겨져 스페로이드를 형성합니다. 다음날, 얻어진 스페로이드는 중간 C와 함께 미니 생물 반응기로 옮겨진다. 오르가노이드의 추가 성숙은 중간 D.에서 진행됩니다.

그림 2: 프로토콜 실행 중에 현미경으로 관찰되는 주요 형태학적 구조. (A)낮은 인플루엔자에 있는 iPSC, 분화의 시작에 불충분. (B)합류내의 iPSC는 분화를 시작하기에 적합하다. (C).수확하기 전에 신경 상피 전구, 소위 로제트의 클러스터. (D)배양판 바닥에 있는 빈 마이크로웰. (E)마이크로웰이 있는 배양판에서 파종 직후의 세포. (F)하룻밤 잠복 후, 세포는 각 마이크로웰에서 스페로이드로 집계된다. (J).좋은 품질의 스페로이드. H. 매트릭스 코팅 후 스페로이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 유기체의 헤마톡시린 -eosin 염색. (A-D) 조밀한 중앙 영역이 있는 일반 오르가노이드. (E)상피 가 늘어선 캐비티가 있는 오르가노이드. (F)괴사 중심 영역이있는 오르가노이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 오르가노이드의 면역 조직 화학 염색. 오르가노이드는 신경 전구체 (SOX2, B) 및 신경 세포의 마커를 발현하는 세포의 클러스터를 가졌다 (TH, PAX6, A; 터브비3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI는 핵 DNA를 염색하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 중간 A-SR의 구성.

표 2: 중간 크기의 A의 조성.

표 3: 중간 B의 조성.

표 4: 중간 크기의 A의 구성.

표 5: 중간 D의 구성.

보조 도서 S1: 분화의 d14에서, 세포 집단 순도는 유동 세포측정및 RT-PCR를 사용하여 평가되었다. (A)세포의 98% 이상이 자발성 마커 TRA-1-81을 잃었다. (B)대부분의 세포(>99%)는 신경피상화마커 SOX1을 나타냈다. (C)주요 pluripotency 인자 OCT4를 코딩하는 POU5F1 유전자의 발현은 3개의 상이한 iPSC 라인(IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L)에서 크게 감소하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

설명된 프로토콜에는 균일한 크기의 고품질 오르가노이드생성을 허용하는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 오르가노이드는 세포 수와 세포 성숙도에서 거의 동일한 스페로이드에서 증가합니다. 둘째, 집에서 만든 생물 반응기는 각 오르가노이드가 군중이나 함께 붙어 있지 않는 균일 한 환경을 제공합니다.

세포 의 질과 세포 성숙의 상태는 프로토콜을 수행하는 데 필수적이다. iPSC의 75-90% 합류에서 신경 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 세포 밀도가 너무 낮은 경우 iPSC는 비 신경 방향으로 분화 할 수 있습니다. 신경 선조는 나중에 더 취약해지기 때문에 iPSCs의 신경 유도의 2 주를 초과하지 않는 것이 중요합니다. 분화 하는 동안, 세포와 오르가노이드는 정기적으로 신선한 매체와 함께 공급 되어야 기아 가 오가노이드 품질의 급격한 감소에 이르게 하기 때문에. 단기 휴식만 동적 재배에 허용됩니다.

프로토콜의 일부 수정이 허용됩니다. 모든 불활성 생물학적 물질은 불소 플라스틱, 폴리에틸렌, 폴리 프로필렌 : 미니 생물 반응기의 중앙 부분에 노브를 만들기 위해 적용 할 수 있습니다. 미생물학을 위한 페트리 접시가 액체 플라스틱을 준비하는 데 사용되는 경우, 그 결과 미니 생물 반응기는 뉴런 세포 독성을 검사해야합니다. 다른 직경의 페트리 요리는 생물 반응기의 기초역할을 할 수 있습니다. 그러나 회전 속도의 조정이 필요합니다. 또한 매체의 부피가 변경되면 회전 속도를 조정해야 합니다. 예를 들어, 6cm 페트리 접시에서 매체의 8mL의 경우 최적의 속도는 70-75 rpm입니다.

매체의 레시피는 다른 뇌^{영역(20)에}특정한 더 성숙한 뇌 오르가노이드 또는 오르가노이드를 얻기 위해 재공식화될 수 있다. 또한, 마이크로웰이 있는 배양 판은 복잡한 스페로이드의 형성에 적합합니다. 예를 들어, 신경 전구체를 내피 전구체와 혼합하여 혈관화된 뇌^{오르간로이드(21)를}받을 수 있다. 다른 iPSC 유도체는 또한 마이크로웰이 있는 배양판에서 스페로이드로 응집하여 다른 오르가노이드를 얻을 수 있습니다: 콘드로스피어^22,장 내장 오르가노이드²³등

프로토콜은 오르가노이드 성숙 기간 동안 매 2-3 일마다 매체를 변경해야하며, 이는 일년 중 절반이 걸릴 수 있습니다. 따라서 멸균 기술을 사용할 때는 특별한 주의를 기울여야 합니다. 그것은 마이코 플라즈마 감염의 예방을 위한 항균제의 예방 복용량을 사용할 수 있습니다.

프로토콜 제한은 산소와 영양소가 큰 오르가노이드의 중심으로 제한된 확산에서 발생합니다. 오르가노이드 생성을 위한 대부분의 현재 프로토콜은 이^{문제(24)로}인해 어려움을 겪고 있다. 우리의 조건에서, 성장이 멈추고 오르가노이드는 6mm에 도달합니다. 더 큰 크기의 오르가노이드는 중앙에 있는 괴사 영역을 개발했습니다. 아마, 이 문제는^{혈관화(21)} 또는 과산소화(25)를 이용하여 해결할 수 있다.

다른 생물 반응기와 비교하여, 집에서 만든 미니 생물 반응기는 비용과 경제성 면에서 명백한 이점을 가지고 있습니다. 또한, 그들은 작습니다. 우리는 인큐베이터의 한 궤도 셰이커에 수십 개의 집에서 만든 생물 반응기를 유지할 수 있습니다. 교반 된 생물 반응기를 사용할 때 인큐베이터에서 이러한 많은 생물 반응기를 유지하는 것은 불가능합니다.

결론적으로, 제시된 프로토콜은 인간 두뇌의 체외 모델링이 요구되는 생물 의학 및 약리학 연구 결과에 도움이 됩니다. 우리는 차별화 미디어 구성을 변화시킴으로써 다른 뇌 영역과 다른 성숙도의 뇌 오르가노이드를 얻을 수 있다고 믿습니다. 더욱이, 미니 생물반응기의 사용은 신경 분화에 국한되지 않으며, 프로토콜이 수정되면, 또한 다능성 또는 성인 줄기 세포로부터 다른 오르가노이드를 확립하는 데 사용될 수 있다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 작품은 러시아 연방 과학 고등 교육부 (RT-PCR 분석)의 보조금 075-15-2019-1669 및 러시아 과학 재단 (다른 모든 작업에 대한)에서 19-15-00425 호를 지원했습니다. 저자는 또한 비디오 편집에 대한 그의 도움에 대한 파벨 벨리코프에게 감사드립니다. 원고의 수치는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.