Генерация органоидов мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в самодельных мини-биореакторах

Здесь мы описываем протокол генерации органоидов мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). Для получения органоидов головного мозга в больших количествах и высокого качества мы используем самодельные мини-биореакторы.

Органоид мозга, полученный из iPSC, является перспективной технологией для моделирования in vitro патологий нервной системы и скрининга лекарств. Эта технология появилась недавно. Он все еще находится в зачаточном зачаточном начале и имеет некоторые ограничения, которые еще не решены. Существующие протоколы не позволяют получить органоиды, чтобы быть достаточно последовательными для открытия лекарств и доклинических исследований. Созревание органоидов может занять до года, подталкивая исследователей к запуску нескольких процессов дифференцировки одновременно. Это налагает дополнительные расходы на лабораторию с точки зрения площади и оборудования. Кроме того, органоиды головного мозга часто имеют некротическую зону в центре, которая страдает от дефицита питательных веществ и кислорода. Следовательно, большинство современных протоколов используют циркулирующую систему для культивирования среды для улучшения питания.

Между тем, не существует недорогих динамических систем или биореакторов для культивирования органоидов. В этой статье описывается протокол производства органоидов головного мозга в компактных и недорогих самодельных мини-биореакторах. Этот протокол позволяет получать высококачественные органоиды в больших количествах.

Модели, полученные из iPSC человека, широко используются в исследованиях нейроразвития и нейродегенеративных расстройств¹. За последнее десятилетие 3D-модели мозговой ткани, так называемые органоиды мозга, существенно дополнили традиционные 2D-нейронные культуры^2. Органоиды в некоторой степени повторяют 3D-архитектуру эмбрионального мозга и позволяют более точно моделировать. Опубликовано много протоколов для генерации органоидов, представляющих различные области мозга: кора головного мозга^3,4,5,мозжечок^6,средний мозг, передний мозг, гипоталамус^7,8,9и гиппокамп^10. Было несколько примеров использования органоидов для изучения заболеваний нервной системы человека^11. Также органоиды были внедрены в лекарственные открытия¹² и использованы в исследованиях инфекционных заболеваний, в том числе SARS-Cov-2^13,14.

Органоиды головного мозга могут достигать до нескольких миллиметров в диаметре. Так, внутренняя зона органоида может страдать от гипоксии или неправильного питания и со временем становиться некротической. Поэтому многие протоколы включают специальные биореакторы^8,шейкеры или микрофлюидные системы^15. Эти устройства могут потребовать больших объемов дорогостоящих клеточных культур. Также стоимость такого оборудования обычно высока. Некоторые биореакторы состоят из множества механических частей, которые затрудняют их стерилизацию для повторного использования.

Большинство протоколов страдают от «пакетного эффекта»^16,который порождает значительную вариабельность среди органоидов, полученных из идентичных ИПСК. Эта изменчивость препятствует тестированию лекарств или доклиническим исследованиям, требующим единообразия. Высокий выход органоидов, достаточный для выбора органоидов однородного размера, может частично решить эту проблему.

Фактор времени также является существенной проблемой. Matsui et al. (2018) показали, что органоидам мозга требуется не менее шести месяцев, чтобы достичь зрелости^17. Trujillo et al. (2019) также продемонстрировали, что электрофизиологическая активность возникала у органоидов только после шести месяцев культивирования^18. Из-за длительного времени созревания органоидов исследователи часто запускают новую дифференциацию до завершения предыдущей. Множественные параллельные процессы дифференциации требуют дополнительных затрат, оборудования и лабораторного пространства.

Недавно мы разработали мини-биореактор, который в основном решает проблемы, упомянутые выше^19. Этот самодельный биореактор состоит из сверхнизкой адгезии или необработанная чашка Петри с пластиковой ручкой в центре. Эта пластиковая ручка предотвращает скопление органоидов и их смешение в центре чашки Петри, что вызвано вращением шейкер. В данной работе описано, как этот недорогой и простой самодельный мини-биореактор позволяет генерировать высококачественные органоиды мозга в больших количествах.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильный метод во всем протоколе, исключая этапы 1.2 и 1.3. Прогрейте все культуральные среды и растворы до 37 °C перед нанесением на клетки или органоиды. Культивируйте клетки в инкубаторе_CO2 при 37 °C при 5% CO₂ при влажности 80%. Схема протокола показана на рисунке 1.

1. Превращение чашек Петри в мини-биореакторы

1. Нарезать стерильные 15 мл центрифужные трубки в кольца высотой 7-8 мм; автоклав колец.
2. Разбейте низкоадгезионные, необработанные или микробиологические чашки Петри на крошки. Растворите около 1 г пластиковой крошки в 10 мл хлороформа на ночь для приготовления жидкого пластика.
   ВНИМАНИЕ: Работайте в вытяжном капюшоне.
3. Убедитесь, что полученный жидкий пластик достаточно вязкий для пипетки; его капля сохраняет сферическую форму и не распространяется по поверхности. Если он очень жидкий, добавьте больше пластиковых крошек. Если он густой, то добавляют хлороформ.
4. Сделайте пластиковую ручку в центре стерильной сверхнизкой адгезии 6-сантиметровой чашки Петри. Есть два одинаково подходящих способа, как подробно описано ниже.
   1. Поместите автоклавное пластиковое кольцо по центру и опустите жидкий пластик внутрь кольца.
   2. Без пластикового кольца опустите жидкий пластик на центр чашки Петри.
5. Оставьте посуду открытой на 2-3 ч в ламинарном проточном вытяжке до полного высыхания. Обработать высушенную посуду ультрафиолетовым излучением в течение 15-20 мин.

2. Индукция нейронной дифференцировки ИПСК

1. Культивируют иПСК в среде для плюрипотентных стволовых клеток до 75-90% слияния в 35 мм чашках Петри, предварительно покрытых матрицей, состоящей из внеклеточных белков.
2. Готовят среду A-SR. Подробную информацию см. в таблице 1.
3. Аспирировать питательную среду и добавить 2 мл среды A-SR на 0-й день дифференцировки.
4. Подготовьте носитель А (см. табл. 2).
5. Культивируют клетки в среде А в течение двух недель со 2-14 дней, освежая среду в чашках Петри через день.

3. Образование сфероидов из нейроэпителиальных клеток-предшественников на 14 день

1. На 14-й день делают сфероиды из нейроэпителиальных клеток-предшественников, используя специальную 24-скважинную культуральную пластину, содержащую примерно 1 200 микроядер в каждой скважине(рисунок 2C). Следуйте процедуре, приведенной ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии дифференцировки чашка Петри размером 35 мм обычно содержит 3 - 3,5 х 10⁶ нейроэпителиальных клеток-предшественников. Таким образом, одной 35-миллиметровой чашки Петри с нейроэпителиальными клетками-предшественниками достаточно для 3 - 4 скважин 24-скважинной культуральной пластины с микроэлементами.
2. Подготовьте 24-скважинную культурную пластину с микролунками: к каждой скважине добавьте 1 мл среды А. Центрифуга ненадолго при 1 300 х г в течение 5 мин в качающемся роторе ковша, оснащенном держателем пластины. Контролируйте под микроскопом, чтобы в микровеллах не было пузырьков.
3. Готовят среду В(таблица 3).
4. Удалить среду из чашки Петри с нейроэпителиальными клетками-предшественниками; промыть ячейки 2 мл DMEM/F12. Для отслоения клеток обработать клетки 1,5 мл раствора ЭДТА 0,48 мМ, приготовленным в PBS. Контролируйте отсоединение клеток под микроскопом.
5. Соберите клетки в трубку 15 мл. Добавьте 5 мл DMEM/F12 в пробирку для промывки клеток. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удаляют супернатант и повторно суспендировали клетки в 2 мл среды В.
6. Проверьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью окрашивания Trypan Blue и гемоцитометра. Рассчитайте объем суспензии, необходимый для содержания 1 х 10⁶ жизнеспособных клеток в общей сложности.
7. Перенесите клеточную суспензию, содержащую 1^{х 10 6} клеток, в каждую скважину 24-скважинной пластины с микроэлементами. Добавьте среду B до 2 мл в каждую скважину, аккуратно пипетку клеток вверх и вниз несколько раз и центрифугируйте ненадолго 100 х г в течение 1 мин для захвата клеток в микролунках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек в скважине не должно превышать 1 х 10^6. В противном случае сфероиды из соседних микроуровнях сливаются.
8. Проверьте под микроскопом, что клетки равномерно распределены в микрозвеллах. Повторите пипетку и центрифугирование, если ячейки распределены неравномерно.
9. Инкубируйте пластину в течение ночи, чтобы позволить клеткам объединяться в сфероиды.

4. Получение и культивирование органоидов

1. На следующее утро (день 15) проверьте качество сфероидов под микроскопом. Убедитесь, что они прозрачные и гладкие, если они здоровы(рисунок 2A,B). Осторожно соберите сфероиды из каждой лунки в трубку 15 мл, оставьте сфероиды выпадать в осадок под действием силы тяжести в течение 2-3 мин, а затем удалите супернатант.
2. Добавьте к сфероидам 2 мл матрицы, размороженные за это же время на льду. Аккуратно перемешать путем пипетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. Для промывания избытка матрицы добавляют в пробирку 8 мл среды Б. Пипетку аккуратно, затем центрифугируют трубку в течение 1 мин при 100 х г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте время и скорость центрифугирования, чтобы избежать необратимой агрегации сфероидов.
4. Удалите супернатант. Добавьте в туба 2 мл среды В, аккуратно пипетку. Разделите сфероидную суспензию между двумя мини-биореакторами, каждый из которых содержит 4 мл среды B. Поместите мини-биореакторы в чашку Петри 15 см, чтобы предотвратить испарение воды и избежать загрязнения.
5. Поставьте чашку Петри с мини-биореакторами на орбитальный шейкер. Культивируют органоиды со скоростью вращения 70-75 об/мин.
6. На 16 день приготовьте среду С(табл. 4).
7. Перенесите органоиды в трубку 15 мл. В течение 5 мин дайте им упасть на дно, аспирировать супернатант, добавить 5 мл среды С. Верните органоиды в мини-биореакторы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не потерять сфероиды, которые прозрачны и едва заметны.
8. Культивируйте сфероиды в среде С в течение двух недель, освежая среду каждые два дня. В конце этих двух недель оставьте около 100 сфероидов на мини-биореактор для последующего культивирования. Заморозьте избыточные сфероиды в морозильной среде в жидком азоте.
9. На 30 день приготовьте среду D(табл. 5).
10. Измените среду культивации на среду D, которая является средой созревания. Обновляйте культивирование среды каждые 2-3 дня в течение трех недель, затем используйте среду D без BDNF и GDNF.

Схема протокола показана на рисунке 1. Протокол включал пять сред, в которых IPSCs дифференцировались на органоиды мозга в течение как минимум одного месяца. Дифференциация была начата, после чего ИПСК достигли 75-90% слияния(Рисунок 2А,В). Первые признаки дифференцировки в сторону нейронов наблюдались на 10-11 день культивирования иПСК в среде А, когда клетки начали группироваться в «розетки»(рисунок 2С). На 14-15 день ИПСК дифференцировались в нейроэпителиальные прародители. 99% клеток были положительными на нейроэпителиальный маркер SOX1 и не экспрессировали плюрипотентные клеточные маркеры TRA-1-81 и OCT4(дополнительный рисунок S1). Затем мы собрали клетки с использованием ЭДТА-содержащего раствора и перенесли их в среде B на специальную 24-скважинную культурную пластину с микроуслугами(рисунок 2D). Клетки сразу после переноса в микроязыки, как показано на рисунке 2E. Каждая микровелла способствовала агрегации клеток в один сфероид. Сфероиды из всех микроувел были одинакового размера и содержали около 100 клеток(рисунок 2J). После образования сфероидов их покрывали свежеотмороженным матриксом и переносили в среде С в самодельные мини-биореакторы(рисунок 2Н). Мини-биореакторы вращались на орбитальном шейкере со скоростью 70-75 об/мин. Сфероиды дифференцировались в органоиды головного мозга, которые все росли равномерно, и морфогенез протекал одинаково у всех органоидов.

Органоиды росли в течение первых трех месяцев, затем их рост замедлился и в конечном итоге остановился. Максимальный размер органоидов мозга, культивированных в течение полугода, составлял около 6 мм. Более крупные органоиды имели свободную центральную зону, часто с полостями или некротическими областями(рисунок 3). Иммуногистохимическое окрашивание криосекций органоидов при d45 дифференцировки выявило большие скопления SOX2-положительных клеток, указывающих на незрелые нейроны(рисунок 4В). Двухмесячные органоиды экспрессировали нейрональные и глиальные маркеры, такие как тирозингидрилаза (TH), PAX6, бета-III-тубулин (TUBB3), MAP2 и белки GFAP(рисунок 4A,4Cи 4D). Максимальное время культивирования органоидов высокого качества составило ~7 месяцев.

Таким образом, образование сфероидов одинакового размера с последующим культивированием в динамических условиях в мини-биореакторах приводит к образованию органоидов стандартного размера путем идентичного морфогенеза.

Рисунок 1:Основные этапы протокола. Вначале иПСК культивируют в коммерческой среде для плюрипотентных стволовых клеток до 70-95% слияния. Следующий этап протокола состоит из двух этапов. Сначала в течение 1-2 дней среда для плюрипотентных стволовых клеток меняется на среду A-SR. Во-вторых, клетки культивируются в среде А в течение двух недель. При образовании розеток нейроэпителиальных клеток клетки переносятся в культуральную пластину с микроэлементами со средой В с образованием сфероидов. На следующий день полученные сфероиды переносят в мини-биореакторы со средой С. Дальнейшее созревание органоидов происходит в среде D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Ключевые морфологические структуры, наблюдаемые под микроскопом во время выполнения протокола. (А) ИПСК в низком слиянии, недостаточные для начала дифференцировки. (B)ИПСК в слиянии, пригодные для запуска дифференциации. (В). Скопления нейроэпителиальных прародителей, так называемые розетки перед сбором урожая. (D) Пустые микрозаростки на дне культурального листа. (E) Клетки сразу после посева в культуральная пластина с микроуслугами. (F)После ночной инкубации клетки объединяются в сфероид в каждой микрояме. (J). Сфероид хорошего качества. H. Сфероиды после покрытия матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Гематоксилин-эозин окрашивание органоидов. (А-Д) Нормальные органоиды с плотной центральной зоной. (E) Органоид с эпителием, выстливкой полости. (F) Органоид с некротической центральной зоной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Иммуногистохимическое окрашивание органоидов. Органоиды имели кластеры клеток, экспрессирующих маркеры нейронных прародителей (SOX2, B) и нервных клеток (TH, PAX6, A; ТУББ3, С; GFAP, MAP2, D). DAPI использовался для окрашивания ядерной ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав среды А-СР.

Таблица 2: Состав среды А.

Таблица 3: Состав среды В.

Таблица 4: Состав среды А.

Таблица 5: Состав среды D.

Дополнительный рисунок S1: При d14 дифференцировки чистоту клеточной популяции оценивали с помощью проточной цитометрии и ОТ-ПЦР. Более98% клеток потеряли маркер плюрипотентности TRA-1-81. (B)Большинство клеток (>99%) демонстрировали нейроэпителиальный маркер SOX1. (C)Экспрессия гена POU5F1, кодирующая ключевой фактор плюрипотентности OCT4, резко снизилась в трех различных линиях iPSC (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Описанный протокол имеет два важных этапа, позволяющих генерацию высококачественных органоидов одинакового размера. Во-первых, органоиды растут из сфероидов, которые почти идентичны по количеству клеток и зрелости клеток. Во-вторых, самодельные биореакторы обеспечивают каждому органоиду однородную среду, где органоиды не сгруппированы и не слипаются.

Качество клеток и состояние созревания клеток имеют важное значение для выполнения протокола. Крайне важно начинать дифференцировку нейронов при 75-90% слиянии иПСК. Если плотность клеток слишком низкая, IPSCs могут дифференцироваться в ненейрональные направления. Важно не превышать двух недель нейронной индукции ИПСК, потому что нейронные прародители позже становятся более уязвимыми. Во время дифференцировки клетки и органоиды должны регулярно снабжаться свежей средой, поскольку голодание приводит к резкому снижению качества органоидов. При динамическом выращивании допускаются только кратковременные перерывы.

Допускаются некоторые модификации протокола. Для изготовления ручки в центральной части мини-биореактора могут быть применены любые инертные биологические материалы: фторопласт, полиэтилен, полипропилен. Если для приготовления жидкого пластика используется чашка Петри для микробиологии, то полученные мини-биореакторы следует проверить на цитотоксичность нейронов. Чашки Петри разного диаметра могут служить основой для биореактора. Однако тогда необходима регулировка скорости вращения. Также скорость вращения необходимо регулировать при изменении объема среды. Например, для 8 мл среды в чашке Петри 6 см оптимальная скорость составляет 70-75 об/мин.

Рецепт среды может быть переформулирован для получения более зрелых органоидов мозга или органоидов, специфичных для различных областей мозга^20. Также культуральная пластина с микроувеликами подходит для образования сложных сфероидов. Например, можно смешивать нейрональные прародители с эндотелиальными прародителями для получения васкуляризированного органоида головного мозга^21. Другие производные iPSC также могут быть агрегированы в сфероиды в культуральной пластинке с микроэлементами для получения других органоидов: хондросферы^22,кишечные органоиды²³и т.д.

Протокол требует смены среды каждые 2-3 дня во время созревания органоидов, что может занять полгода. Поэтому следует проявлять особую осторожность при использовании стерильных методик. Допускается использование профилактической дозы противомикробных препаратов для профилактики микоплазменной инфекции.

Ограничение протокола возникает из-за ограниченной диффузии кислорода и питательных веществ в центр крупных органоидов. Большинство современных протоколов для генерации органоидов страдают от этой проблемы²⁴. В наших условиях рост прекращается, тогда органоид достигает 6 мм. У органоидов большего размера развилась некротическая зона в центре. Вероятно, эту проблему можно решить с помощью васкуляризации²¹ или гипероксигенации^25.

По сравнению с другими биореакторами, самодельные мини-биореакторы имеют очевидные преимущества с точки зрения стоимости и доступности. Кроме того, они небольшие. Мы можем хранить несколько десятков самодельных биореакторов на одном орбитальном шейкере в инкубаторе. Невозможно поддерживать эти многочисленные биореакторы в инкубаторе при использовании перемешаных биореакторов.

В заключение, представленный протокол полезен для биомедицинских и фармакологических исследований, где требуется моделирование мозга человека in vitro. Мы полагаем, что, варьируя состав дифференцирующих сред, можно получить органоиды мозга разных областей мозга и разной степени зрелости. Более того, использование мини-биореакторов, скорее всего, не ограничивается нейронной дифференцировкацией и, если протокол модифицировать, они также могут быть использованы для установления других органоидов из плюрипотентных или взрослых стволовых клеток.

Авторам нечего раскрывать.

Данная работа была поддержана грантом 075-15-2019-1669 Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (анализ ОТ-ПЦР) и грантом No 19-15-00425 Российского научного фонда (на все остальные работы). Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.