Ek Oksijenin Kistik Fibrozis Hava Yolu Mikrobiyomu Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Modelin Tasarımı ve Geliştirilmesi

Bu protokolün amacı hiperoksinin kistik fibrozis hava yolu mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisi için bir model sistemi geliştirmektir. Yapay balgam ortamı balgam bileşimine öykünür ve hiperoksik kültür koşulları ek oksijenin akciğer mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkilerini modeller.

Hava yolu mikrobiyal topluluklarının kistik fibrozis (CF) ve diğer kronik pulmoner hastalıkların ilerlemesinde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Mikroplar geleneksel olarak oksijen kullanma veya tolere etme yeteneklerine göre sınıflandırılmıştır. Ek oksijen kistik fibrozis (pwCF) olan kişilere uygulanan yaygın bir tıbbi tedavidir; bununla birlikte, oksijen ve hava yolu mikrobiyomu üzerinde yapılan mevcut çalışmalar, hiperoksi (yüksek oksijen) yerine hipoksinin (düşük oksijen) ağırlıklı olarak aerobik ve öğretim üyesi anaerobik akciğer mikrobiyal topluluklarını nasıl etkilediğine odaklanmıştır. Bu kritik bilgi açığını gidermek için, bu protokol pwCF'den balgam bileşimini taklit eden yapay bir balgam ortamı kullanılarak geliştirilmiştir. Şeffaf bir ortam sağlayan filtre sterilizasyonunun kullanımı, optik yöntemlerin süspansiyon kültürlerinde tek hücreli mikropların büyümesini takip etmesini sağlar. Hiperoksik koşullar yaratmak için, bu model sistemi hiperoksik koşulları incelemek için yerleşik anaerobik kültleme tekniklerinden yararlanır; oksijeni çıkarmak yerine, serum şişelerinin sıkıştırılmış oksijen ve hava karışımı ile günlük olarak parçalanarak kültürlere oksijen eklenir. 50 pwCF'den balgam, bu modelin diferansiyel oksijen koşullarını koruma yeteneğini doğrulamak için 72-h süre boyunca günlük sparging geçirdi. Kistik fibrozis balgamında yaygın olarak bulunan kommensal ve patojenik mikropların büyümesini desteklemek için bu ortamın yeteneğini doğrulamak için 11 pwCF'den kültürlü ve kültürsüz balgam örneklerine av tüfeği metagenomik dizilemesi yapıldı. Bu yapay balgam ortamının yaygın kistik fibrozis patojenlerinin büyümesini destekleme yeteneğini doğrulamak için pwCF'den elde edilen 112 izolattan büyüme eğrileri elde edildi. Bu modelin CF balgamında çok çeşitli patojenleri ve kommensalları kültüre edebildiğini, normoksik koşullar altında kültürsüz balgama çok benzeyen bir topluluğu kurtardığını ve değişen oksijen koşullarında farklı kültür fenotipleri oluşturduğunu görüyoruz. Bu yeni yaklaşım, pwCF'de oksijen kullanımının hava yolu mikrobiyal toplulukları ve yaygın solunum yolu patojenleri üzerinde neden olduğu beklenmedik etkilerin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

Kistik fibrozis (CF), akciğerlerden kalın mukusu temizleyememe ile karakterize genetik bir hastalıktır ve sıklıkla akciğer nakli veya ölüm ihtiyacı ile sonuçlanan tekrarlayan enfeksiyonlara ve ilerleyici akciğer fonksiyon düşüşüne yol açar. Kistik fibrozis (pwCF) olan kişilerin hava yolu mikrobiyomu hastalık aktivitesini izler¹, olumsuz uzun vadeli sonuçlarla ilişkili mikrobiyal çeşitlilikte bir azalma^{ile 2,3}. PwCF'nin klinik çalışmalarında, ek oksijen tedavisi daha ileri hastalık^4,5ile ilişkilendirilmiştir , geleneksel olarak, oksijen tedavisinin kullanımı sadece hastalık şiddeti için bir belirteç olarak açılmıştır⁶. Solunum yetmezliği olan hastaların klinik çalışmalarından elde edilen son çalışmalar, daha yüksek hasta oksijen seviyelerinin paradoksal olarak ciddi bakteriyel enfeksiyonlardaki artış ve daha yüksek mortalite⁷ile ilişkili olduğunu göstermiştir Ek oksijenin hastalık patogenezine katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Ek oksijenin kistik fibrozis akciğer mikrobiyomu ve ilişkili akciğer ve hava yolu mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisi iyi incelenmemiştir.

Mekanistik çalışmalar genellikle lojistik zorluklar ve bilinmeyen tıbbi fayda veya zarar müdahaleleriyle ilişkili potansiyel etik sorunlar nedeniyle doğrudan insan denekler üzerinde yapılamamaktadır. İnsan biyospepsimenlerini model sistemlerine entegre eden çeviri yaklaşımları bu durumlarda önemli biyolojik içgörüler sunabilir. Oksijen kullanma veya tolere etme yeteneği geleneksel olarak mikrobiyal sınıflandırmanın önemli bir bileşeni olsa da, ek oksijenin çevreye terapötik olarak tanıtılmasının hava yolu mikrobiyal topluluklarını nasıl bozabileceği hakkında çok az şey bilinmektedir. Ek oksijenin pwCF'nin hava yolu mikrobiyomları üzerindeki bilinmeyen etkilerine ışık tutmak için iki büyük zorluğu ele almamız gerekiyordu; birincisi, fizyolojik olarak CF balgamının bileşimine yakın bir kültür ortamının oluşturulması; ikinci olarak, kültürdeki yüksek oksijen konsantrasyonlarının uzun süreler boyunca korunmasına izin veren bir model sisteminin oluşturulması.

Yapay balgam ortamı (ASM), akciğer balgam ex vivo8 , 9^,10' u taklit etmek için yaygın olarak kullanılır, ancak belirli bir tarif üzerinde net bir fikir birliği yoktur. Bu protokol, pwCF'den fizyolojik olarak balgam hakkında dikkatlice tasarlanmış yapay bir balgam ortamı tarifi ve hazırlama stratejisini açıklar. Tablo 1, yayınlanan literatüre göre seçilen tarif değerlerini özetlemektedir. Temel kimyasal bileşenler ve pH, insan CF balgam^{11 , 12,13}çalışmaları ile tanımlanan değerlerle eşleştirildi. Düşük konsantrasyonda fizyolojik besinler, son hacim^10'un%0.25'i olarak dahil edilen yumurta sarısı kullanılarak eklenmiştir vitamin ve eser metal karışımları^14,15. Balgam^16'nınanahtar bileşeni olan Mucin, %1 w/v¹⁴'te dahil edildi. Daha emek yoğun olmasına rağmen, temel ortam bileşenlerinin ısı kaynaklı denatürasyonundan kaynaklanan potansiyel sorunları azaltmak için daha geleneksel ısı sterilizasyonu uygulaması yerine filtre sterilizasyonu seçilmiştir¹⁰. Filtre sterilizasyonunun ek bir yararı, şeffaf ortamlar üretmesidir (ısı sterilizasyonu, tuzların ve proteinlerin yağması ve pıhtılaşması nedeniyle bulanık ortam oluşturabilir), bu yapay balgam ortamlarının bulanıklıktaki artışlara dayalı mikrobiyal büyümeyi takip etmek için kullanılmasına izin verir.

Hiperoksik kültür için bu model sistemi, pwCF için ek oksijen kullanımının etkisi için bir model oluşturarak oksijenin çıkarılması yerine eklendiği anaerobik kültleme tekniklerine dayanmaktadır. Şekil 1 ve ilgili oksijen sparging protokolü, genel laboratuvar ve hastane tedarikçilerinden düşük maliyetle elde edilebilen bir oksijen sıçrama sisteminin bileşenlerini özetlemektedir. Bu sistem basınçlı oksijen ve havanın %21-%100 oksijen arasında değişen sabit konsantrasyonlara karıştırılmasını sağlar. Bir oksijen sensörünün entegrasyonu, çıkış gazı karışımının konsantrasyonunun doğrulanmasının yanı sıra, oksijen koşullarının istenen aralıkta korunduğunu doğrulamak için daha önce sıçramış serum şişelerinin çıkış gazı bileşimini kontrol etmeyi sağlar.

Bu protokol, yapay bir balgam ortamı oluşturma prosedürlerini, bir oksijen sıçrama sisteminin inşasını ve kullanımını ve her ikisinin de diferansiyel oksijen koşulları altında kültür CF balgamının uygulanmasını özetlemektedir.

Bu çalışma Ortaklar Kurumsal İnceleme Kurulu'ndan onay almıştır (Protokol # 2018P002934). İnklüzyon kriteri, çalışma için yazılı bilgilendirilmiş onay sağlayan kistik fibrozisli yetişkin hastaları içeriyordu. Dışlama kriteri yoktu. Protokol yönergelerine göre, tüm balgam örnekleri klinik sağlayıcıları ile planlanan bir ayaktan ziyaret sırasında kistik fibrozisli hastalardan toplanmıştır.

1. Yapay Balgam Orta Hazırlık

NOT: Burada listelenen miktarlar 1 L nihai yapay balgam ortamının üretimi içindir ve Malzeme Tablosundalistelenen belirli reaktifleri varsayar. Sayılar, aynı nihai ürünü sağlamak için diğer hacimler veya farklı reaktiflerin kullanımı için ayarlanmalıdır. Hedef konsantrasyonlar için Tablo 1'e bakın.

1. Yapay balgam kimyasal karışımı (ASCM)
   NOT: ASCM son orta hacmin %25'ini oluşturur. Rafa sabittir ve toplu olarak veya önceden hazırlanabilir. Daha sonra kullanılmak üzere hazırlanıyorsa, kimyasal karışımı otoklavlayın ve oda sıcaklığında güvenle saklayın.
   1. Kurucu kimyasal stok çözeltilerini karıştırın.
      1. 1 M NaCl stoğu hazırlayın: Litre steril su başına 58,44 g NaCl ekleyin.
      2. 1 M KCl stoğu hazırlayın: Steril suyun litresi başına 74,55 g KCl ekleyin.
      3. 1 M MgSO₄ stok hazırlayın: Steril su litresi başına 246,47 g MgSO_{4·7H 2}O veya steril su litresi başına 120,37 g susuz MgSO4 ekleyin.
      4. 1 M glikoz stoğu hazırlayın: Steril suyun litresi başına 180,16 g glikoz ekleyin.
   2. Otoklav, kimyasal stok çözeltilerini ve boş bir 250 mL şişeyi sterilize eder. 30 dakika boyunca en az 121 °C ve 15 PSI standart değerlere otomatik engelleme adımlarını gerçekleştirin.
   3. Boş 250 mL şişeye 80,59 mL steril su ekleyin.
   4. Karışıma 152,30 mL 1 M NaCl stoğu ekleyin.
   5. Karışıma 15,8 mL 1 M KCl stok ekleyin.
   6. Karışıma 610 μL 1 M MgSO₄ stok ekleyin.
   7. Karışıma 700 μL 1 M glikoz stoğu ekleyin.
2. Yapay balgam mucin karışımı (ASMM)
   NOT: ASMM, son orta hacmin %50'sini oluşturur. Son orta parti ile aynı gün hazırlandığından emin olun.
   1. Boş bir 1 L şişeye 450 mL steril su ekleyin.
   2. Şişeye 50 mL 10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ekleyin.
   3. Şişeye tek kullanımlık bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin.
   4. PBS ve karıştırma çubuğunu içeren şişeyi otoklavlayın.
   5. 10 g mucin toz ölçün ve PBS'ye ekleyin.
   6. Ön karıştırma için şişeyi kuvvetlice çalkalayın.
   7. Şişeyi manyetik karıştırıcı ile sıcak bir tabağa yerleştirin. Isıyı orta-yüksek hedefleme 50 °C'ye ve karıştırma hızını 1100 rpm'ye ayarlayın. Çubuğun mıknatıstan uçmaması için hızı kademeli olarak artırın.
      1. 15 dakika boyunca ısıtmaya ve karıştırmaya bırakın.
      2. Şişeyi ısıya dayanıklı eldivenlerle alın. Mucin tozunun çözeltinin dışına yerleşip yerleşmey olduğunu kontrol etmek için gözlemleyin.
      3. Mucin tozu tam olarak çözülmemişse, şişeyi tamamen çözünene kadar 5 dakikalık aralıklarla ısıya / karıştırıcıya geri döndürün.
   8. Mücin karışımının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
3. Yapay balgam biyolojik karışımı (ASBM)
   NOT: ASBM son orta hacmin %25'idir. Son orta parti ile aynı gün hazırlayın ve diğer karışımların aksine, bileşenlerini herhangi bir ısıya maruz bırakmayın.
   1. 100x vitamin stoğunu 4 °C'lik bir buzdolabında veya buzda çözün.
      NOT: Donma/çözülme döngülerinin sayısını en aza indirmek için vitamin stoğunu 10 mL aliquots içine ön porsiyon.
   2. Boş otoklavlı 250 mL şişeye 124,24 mL steril su ekleyin.
   3. Karışıma 25,76 mL 50x esansiyel amino asit stoğu ekleyin.
   4. Karışıma 80,14 mL 100x esansiyel olmayan amino asit stoğu ekleyin.
   5. Karışıma 10 mL (çözülmüş) 100x vitamin stoğu ekleyin.
   6. Karışıma 1 mL 1000x iz metal stoğu ekleyin.
   7. Karışıma 8.33 mL% 30 yumurta sarısı emülsiyon ekleyin.
   8. Karışıma 400 μL 10 g/L ferritin stoğu ekleyin.
   9. Çözeltiyi manuel sallama ile iyice karıştırın.
4. Yapay balgam ortamı (ASM)
   1. ASMM içeren 1 L şişeye 250 mL ASCM ekleyin.
   2. Orta şişeye 250 mL ASBM ekleyin.
   3. Ortamı, dar aralıklı pH kağıdında 6,3 pH'a ulaşmak için temel MOPS tamponu (1 M) ile titratın. Titrasyondan önce, orta karışım çok asidik olacaktır.
   4. Elde ettiği suni balgam ortamını filtrasyona hazır olana kadar 4 °C'de soğutun.
   5. Filtrasyon işlemini başlatmak için, 200 mL filtresiz suni balgam ortamını 0,22 μm gözenek boyutu filtresine sahip bir vakum filtrasyon sistemine aktarın.
   6. Filtrasyon sistemini vakum pompasına bağlayın, vakum pompasını açın, 70 mbar'a ayarlayın ve ardından odayı 4 °C'de soğuk bir odada 90 rpm'de sallanan bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin.
      1. Kayda değer bir miktar filtrelendikçe ortamın ek 150 mL'si ile üst üste yerleştirin. 1 L ortamın tamamen filtrelenerek 1-2 gün sürer.
      2. Tüm ortam filtrelenene kadar ek bölmelerle tekrarlayın.
         NOT: Mucin filtreyi zamanla takacağından, ortamın 350 mL'den fazlasını aynı 0,22 μm filtreden filtrelememeye çalışın.
   7. Filtrelenmiş yapay balgam ortamını kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de soğutun. En iyi sonuçlar için hazırlık aşamasından sonraki bir ay içinde ASM'i kullanın.

2. Oksijen Sıçraması

1. Spagep istasyonu kurulumu
   NOT: Bu protokolün yalnızca bir kez tam olarak yapılması gerekir, bu noktadan sonra kurulum gerektiğinde basit bakım yoluyla sürdürülebilir. Oksijen sıçrama sisteminin görsel şeması için Şekil 1'e bakın.
   1. Basınçlı hava ve oksijen tanklarını elde edin ve uygun şekilde sabitleyin.
      DİkKAT: Yüksek basınç, yanlış işlendiğinde tankları son derece tehlikeli hale getirir. Tankların tamamen kapalı ve emniyetli olduğundan, tank kapatıldığında sızıntı olmadığından ve tüm taşıma personelinin kullanımlarında tam olarak eğitildiğinden emin olun.
   2. Basınçlı hava tankına bir İngiliz anahtarı ile bir hava regülatörü takın. Regülatörde optimum akış okuması için regülatörü mümkün olduğunca dik bir konuma takın.
   3. Sıkıştırılmış oksijen tankına bir oksijen regülatörü takın, dik konuma mümkün olduğunca yakın takın. Oksijen tankına bağlı olarak, sıkılaşmak için yönü tersine çevirmemiz gerekebilir.
   4. İki tanktan gelen gaz akışını birleştirmek için boruyu regülatörlerden bir Y konektörüne bağlayın.
   5. Y konnektörünün çıkışını merkezi T bağlantı valfine bağlayın.
   6. Merkezi T-junction vanasının bir tarafını bir gaz basınç göstergesine bağlayın.
   7. Gaz basıncı göstergesinin diğer tarafını 0,22 μm gözenek boyutuna sahip 25 mm çapında steril şırınna filtresine bağlayın.
   8. Spagepleme sırasında gaz salınımı olarak kullanılacak pistonsuz bir şırındıya ikinci bir 25 mm çapında şırıng filtresi takın.
   9. Merkezi T bağlantı vanasının son tarafını oksijen monitörü için ikinci bir T-bağlantı valfine bağlayın.
   10. 25 mm çapında bir şırınga filtresini bu ikinci T-bağlantı valfinin bir tarafına bağlayın ve 18 G iğne takmak için boru takın.
   11. İkinci T-junction vanasının son tarafını oksijen izleme cihazına bağlayın.
   12. İzleme sırasında gaz salınımı olarak kullanılacak oksijen izleme cihazının diğer tarafına bir kesme tüpü bağlayın.
       DİkKAT: Oksijen sıçrama sistemini test ederken/kullanırken, T bağlantılarının konumunu dikkatlice not alın ve sistem boyunca hedeflenen yola eşleştiğinden emin olun. Bunun yapılmaması, sistem içinde basınç birikmesine neden olur ve bileşenlerin başarısız olmasına ve parçalanmasına neden olur.
   13. Sistemin bakımı ve optimum performansta çalışmasını sağlamak için aşağıdaki uygulamalar faydalıdır.
       1. Sızdırmazlıklarını büyük ölçüde iyileştirmek ve bileşenlerin iç basınçtan ayrılma olasılığını azaltmak için liberal miktarlarda Teflon bantla bağlantıları güçlendirin.
       2. Maksimum basıncı azaltmak ve arızaları önlemek için birleşik akış hızını 10 L/dk'nın altında tutun.
       3. Bir sızıntıdan şüphelenilirse, herhangi bir gaz sızıntısının üzerinde kabaracağından, konumunu kolayca tanımlamak için ticari olarak mevcut sıvı sızıntı dedektörleri gibi bir deterjan çözeltisi kullanın. Polytetrafloroetilen bant (örneğin, Teflon) kullanılarak yama sızıntıları.
       4. Oksijen sıçrama sistemindeki 25 mm çapındaki şırıng filtrelerini iki haftada bir değiştirin, ancak bu kullanım sıklığına göre değişir. Zamanla, filtreye takılan parçacıklar gaz akış hızını azaltır ve basınç birikmesine neden olur.
       5. Ölçümleri yapmadan önce oksijen monitörünü %21 oksijen basınçlı havaya kalibre edin.
       6. Sistem kullanımının tamamlanmasından sonra, tankları kapatın ve akış tamamen durana kadar regülatörlerden fazla gazın kanını akıtın.
2. Serum şişe kültürü sparging
   1. Örnek tanımlayıcıları, aşılama tarihi/saati ve hedef oksijen yüzdesi ile 500 mL otoklavlı serum şişelerini etiketle.
   2. Biyolojik bir kaputta, kurulan her serum şişesine 24 mL yapay balgam ortamı ekleyin.
   3. Her serum şişesine 18-G iğne ile homojenize edilmiş 1 mL hasta balgamı ekleyin (her kültür durumu için yeterli miktarda örnek elde etmek için gerekirse steril salin ile seyreltilir).
   4. Steril cımbız kullanarak, otomatik kapatılmış kauçuk durdurucuları her serum şişesinin üstüne yerleştirin.
   5. Lastik stoperlere bastırın, stoperin altına ellerle dokunmamaya dikkat edin.
   6. Şişeleri kaputtan çıkarın, alüminyum contaları uygulayın ve kıvrın. Orta parçayı contalardan çıkarın.
   7. Şişelerin üst kısmını alkol silme ile silin ve Bir Bunsen brülörü alevinden geçirin.
   8. Filtreli pistonsuz bir şırıngaya steril 18-G iğne yapıştırın. Bu gaz salınımını önce şişeye yerleştirin.
   9. Sistemden gaz çıkışına steril bir 18-G iğne yapıştırın ve gaz çıkış iğnesini de şişeye yerleştirin.
   10. Tanklardaki T bağlantılarını oksijen monitöründen geçirin. Hedef oksijen konsantrasyonun sistemden aktığını doğrulayın. Hedef yaklaşık 5 L/dk gaz akışı.
   11. T bağlantılarını tanklardan gaz çıkışına yönlendirin. Gaz serum şişesinin içinden akmaya başlar.
       DİkKAT: Oksijen sıçraması sırasında basınç göstergesine çok dikkat edin. Basınç beklenmedik şekilde artarsa, sistemi hemen kapatın.
   12. Serum şişesinin içinden 1 dakika boyunca oksijen sparge çalıştırın. 5 L/dk'da bu, 10 hava değişimine izin verir ve iç atmosferin istenen kısmi basınca ulaşmasını sağlar.
   13. Gaz salınımını 18-G iğnesi çıkarın.
   14. Serum şişeslerindeki basıncın +1 atmosfere (deniz seviyesinde 2 atmosfer) inşa etmesine izin verin ve ardından gaz çıkış iğnesini hemen çıkarın.
       NOT: Basınç, hiperoksik koşulların zaman içinde tutulmasına yardımcı olur.
   15. Serum şişesini 150 RPM'de 37 °C inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin. Örnekleri üç 24 saat aralıklarla kuluçkaya yatır. Her 24 saat aralıkta, aşağı akış analizi için bir aliquot alın, örnekleri yeniden sparge edin ve toplam 72 saat kuluçka süresi için inkübasyona geri döndürün.
3. Çıkış oksijen ölçümü
   1. Oksijen ölçeri %21 basınçlı havaya kalibre edin ve ardından tankı kapatın.
   2. Serum şişesi alımını oksijen monitöründen geçirin ve sonuna steril bir iğne yapıştırın.
   3. İğneyi lastik durdurucudan serum şişesine yerleştirin.
   4. Çıkış okumasının dengelenmesi için bekleyin. Serum şişelerinden düşük bir akış hızı, bunun 2 dakika kadar sürebileceği anlamına gelir. Oda havasından en yüksek farkı bildirin (%21'den en uzak sayı).
   5. Birden fazla okuma yapıyorsanız, sistemi okumalar arasında basınçlı hava ile yıkayın.

Bu protokoller, Boston, Massachusetts'teki Massachusetts General Hospital'daki bir ayakta kistik fibrozis kliniğine rutin bakım için başvuran pwCF'den 50 balgam söktürücü numuneye uygulandı. Her hastanın balgamı yapay balgam ortamı kullanılarak %21, %50 ve %100 oksijen koşullarının altında kültürlendi ve her kültürden 24 saat, 48 saat ve 72 saat kültür süresi ile 0,5 mL aliquot alındı. Görsel değişiklikleri izlemek için ekstraksiyonlar yapıldığında kültürler fotoğraflandı. Ek olarak, kültlemeden önce her birincil balgam örneğinin 0,5 mL aliquot'u alınmıştır. Bu, hasta başına 10 ayrı örnek ve 500 numunenin son N'si ile sonuçlandı. Bunlardan 11 hastadan balgam (11 kültürsüz balgam, 48 saat inkübasyonda% 21 oksijenden 11 kültürlü balgam) nükleik asit ekstraksiyonu^17,ticari bir DNA kütüphanesi hazırlama kiti kullanılarak sıralama kütüphaneleri oluşturuldu ve metagenomik dizileme, 150 baz çifti ile numune başına ~ 5 Gb diziyi hedefleyen bütün bir genom dizileme platformunda gerçekleştirildi, eşleştirilmiş uç okumaları. Ham okumalar kullanılarak işlendi bioBakery araç paketi¹⁸, kalite kontrolü ve insan "kirletici" dizilerinin kaldırılmasını ve MetaPhlAn3 profil oluşturucu¹⁹ile taksonomik profil oluşturmayı içerir. Nükleik asit ekstraksiyonu sırasında, normalde insan mikrobiyal topluluklarında değil, haliç ekosistemlerinde bulunan halotoleran bir tür olan Imtechella halotolerans'ın10 milyon hücresi her numuneye çivilendi ve her örnek için mutlak mikrobiyal yükün ölçülmesine izin verildi²⁰.

Şekil 2, her oksijen durumu altında kültüre alınan 50 balgam örneği ve görsel diferansiyel kültür fenotipinin bir örneği için kültür süreci boyunca bireysel ve ortalama çıkış oksijen ölçümlerini ve pH seviyelerini göstermektedir. Kültürler, örnek aliquotların sparging ve çıkarılması yapılan kısa süreler dışında 37 °C'de sürdürüldü. Her iki 12 saat ve 24 saat arasında sürtünme aralıkları ile, her üç oksijen durumu için de zaman içinde bir düşüş gözlenmesine rağmen, % 100 oksijenin yaklaşık% 85'e düşmesine,% 50 oksijenin% 40'a düşmesine ve% 21 oksijenin% 18'e düşmesine rağmen, yüksek oksijen konsantrasyonları korundu. Oksijen koşulları farklı kaldı ve daha da önemlisi, hiperoksik numuneler için süreç boyunca yüksek oksijen konsantrasyonları korundu. pH ölçümleri daha yüksek derecede değişkenlik gösterdi, ancak zaman içinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik olmadan fizyolojik olarak normal bir aralıkta kaldı. Bu ölçümler, bu yöntemlerin kültür süreci boyunca ayrık ayırıcı oksijen koşullarını koruduğunu göstermektedir. Son olarak, oksijen konsantrasyonu arasında farklılaşmış birçok görsel kültür fenotipinden birinin bir örneği gösterilmiştir. Bu örnek, 72 saat kültürden sonra bulanıklık farklılıklarını işaretlemiş ve daha düşük görme bulanıklığı ile ilişkili daha yüksek oksijene sahipti. Diferansiyel kültür fenotipleri, kültür toplulukları üzerinde hiperoksi kaynaklı etkilerin varlığını destekler.

Şekil 3, kültürsüz balgam ve kültürlü balgam (48 saat boyunca% 21 oksijen durumu) arasındaki mikrobiyal yükü, mikrobiyal çeşitliliği ve mikrobiyal topluluk bileşimini karşılaştırır. Ölçümler, kültleme eyleminin getirdiği tek büyük farkın, kültürsüz balgama kıyasla mikrobiyal yükte yaklaşık 20 kat artış olduğunu ortaya koymaktadır. Bağışıklık sistemi ve öksürük gibi tipik mekanik balgam temizleme mekanizmaları normalde pwCF'de görülenler gibi işlev bozukluğu ve enfeksiyon durumlarında bile akciğerdeki mikrobiyal yükü sınırlayan düzenleyici bir süreç olarak hizmet eder. Ex vivo kültürünün böyle bir düzenleyici mekanizması yoktur ve mikrobiyal topluluklar bunun yerine hücresel doygunluğa doğru ilerlemekte özgürdir. Alfa ve beta çeşitlilik ölçümleri, mikrobiyal yükteki bu farka rağmen, temel topluluk kompozisyonunun, kültür süreci tarafından ortaya konan minimum küresel farklılıklarla iyi korunduğunu göstermektedir.

Şekil 4, 11 hastadan elde edilen kültürlü ve kültürsüz balgamdan elde edilen av tüfeği metanemik dizilimi ile kesin olarak tanımlanan 120 mikrobiyal türün ikili varlığına/yokluğuna bakarak, kültürsüz ve kültürlü balgam örnekleri arasındaki karşılaştırmayı genişletmektedir. Mikroplar filogenetik benzerliklere göre kümelenir. Bu türlerin 46'sı (%38,3) hem kültürsüz hem de kültürlü örneklerde (siyan rengi) tanımlanırken, 35'i (%29,2) sadece kültürsüz örneklerde (sarı) ve 39'u (%32,5) sadece kültürlü örneklerde (mavi) tanımlanmıştır. Mevcut ve olmayanlar açısından sıralamayı kullanarak tanımladığımızdan daha büyük bir eşlik olması muhtemeldir, ancak bazı durumlarda bazı taksonlar sıralama algılama eşiğinin altına düşer. Farklılıklar, kültür sürecinin kültürsüz balgama kıyasla kültürlüde bazı önyargılar ortaya aldığını göstermektedir. En önemlisi, kültleme Candida ve Aspergillusgibi mantarların yanı sıra Escherichia, Serratiave Streptococcus üyeleri de dahil olmak üzere Enterobacterales üyelerinin varlığını arttırır. Aksine, anaerobes olan Prevotella ve Clostridiales gibi Bacteroidetes üyeleri kültürsüz örneklerde mevcuttu, ancak kültürlü örneklerde mevcut değildi. Bu, deneysel modelimizde anaerobik bir durumun olmamasına bağlanabilir.

Şekil 5, 50 farklı pwCF'den elde edilen balgamdan izole edilen yaygın CF akciğer patojenlerinin absorbans bazlı büyüme eğrilerini göstermektedir. Bu izolatlar, Massachusetts General Hospital Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı'ndan zenginleştirme kültürü prosedürleri kullanılarak elde edilen fenotipik olarak farklı klinik izolatları temsil eder, ve Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) ve Achromobacter sp'yi içerir. (N = 7). Büyüme eğrileri, karanlıkta 37 °C'de yapay balgam ortamlarında her bir izolenin kültlenmesiyle elde edildi ve ASM sans bakteriyel inoculation negatif kontrol görevi gördü. ASM'nin şeffaf kalitesi (ısı sterilizasyonu yerine filtreden kaynaklanmaktadır), büyüme eğrilerini tahmin etmek için optik önlemlerin alınmasına izin verir. 600 nm'de (OD600) optik okumalar her 10 dakikada bir alındı ve her eğrinin ilk 24 saati gösterildi. Yalnızca ASM negatif kontrolünde optik okumalarda değişiklik olmaması, kültürlerin kirlenmeden arındırıldıklarına işaret eder. Burada gösterilen gösterici eğriler, bu ASM tarifinin emiciliğe dayalı büyüme eğrileri üretimi için bir ortam olarak uygulanabilirliğini gösteren tipik büyüme eğrisi desenlerini izler.

Tablo 1: Literatürün gözden geçirilmesinden elde edilen yapay balgam ortamı tarifi. (Sütun 1) Yapay balgam ortamının formülasyonunda reaktifler ve anahtar değerler. (Sütunlar 2-7) Extant literatürden tariflerin karşılaştırılması^{8,9,10,12,14,15}. (Sütunlar 8-9) Bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan yapay balgam ortamı tarifi ve seçilen her değeri^{10 , 11 , 12,13,14,15}bildiren ilgili kaynaklar .

Tablo 2: Daha önce kistik fibrozis balgamında ve bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan yapay balgam orta tarifinde tanımlanan amino asit konsantrasyonları. (Sütun 1) Anahtar amino asitler. (Sütun 2) Kistik fibrozisli kişilerden balgam amino asit konsantrasyonları¹². (Sütun 3) Yapay balgam ortamındaki amino asit konsantrasyonları bu protokolde ayrıntılı olarak yer uzadı

Şekil 1: Oksijen sparging sistemi bileşenlerinin bağlantı şeması. Serum şişelerini sparge etmek için kullanılan sistemin bileşenleri arasındaki bağlantıların akış şeması% 21 ila% 100 arasında istenen oksijen konsantrasyonlarına. Sistem, iki T bağlantı valfinin konumuna göre belirlenen 3 kullanım moduna sahiptir. Sistem, tanklardan gazı gaz çıkışı veya oksijen yüzdesi monitöründen yönlendirebilir ve zaman geçtikten sonra konsantrasyonu kontrol etmek için daha önce sıçratılmış serum şişelerinden çıkış gazını monitörden yönlendirebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hedef oksijen konsantrasyonları yaklaşık olarak hem 12 h hem de 24 h sparging aralıkları ile korunur ve pH kültür sırasında fizyolojik aralıkta kalır. (A) 72-h süresi boyunca 12 saat ve 24 saat oksijen sıçrama aralıklarından oksijen okumaları dışarı. (B) her 24 saatte bir ölçülen numuneler için pH okumaları(C) 72 saat sonra kültürlü örnek CFB010'un oksijen konsantrasyonlarında diferansiyel bulanıklık gösteren örnek bir görüntüsü. Renk hedef oksijen yüzdesini gösterir; hata çubukları %95 güven aralıklarını gösterir. Kesik çizgilerle kritik eşikler vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kültleme mikrobiyal yükü arttırır, ancak alttaki topluluk kompozisyonu korunur. 48 saat boyunca % 21 oksijende yapay balgam ortamı kullanarak kültürsüz balgam (sarı) ve kültürlü balgam (mavi). Aliquots, kültür koşullarından kaynaklanan olası önyargıyı tespit etmek için nükleik asit ekstraksiyonu ve av tüfeği metanezomik dizilemesi yapıldı. (A) Mutlak mikrobiyal yük (çivili kontrollerle belirlenir) ve alfa çeşitliliği ölçümleri. Doğrusal karışık efekt modelleri kullanarak, kültürsüz ve kültürlü balgam mikrobiyal yükü tahmin etti, ancak alfa çeşitliliğini tahmin etmedi. (B) Beta çeşitlilik ölçümlerinin ilk iki bileşeninin koordinasyonu, mikrobiyal yükteki farkı kontrol eder. PERMANOVA'dan sonra her iki metrikte de önemli bir fark yoktur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tanımlanan taksonların çoğunluğu hem kaynak balgamda hem de kültürde bulunurken, diğerleri sadece kaynak balgam veya kültürde görünür. Kültürsüz ve kültürlü balgam örnekleri arasındaki mikrobiyal topluluk kompozisyonundaki farklılıkları karşılaştırmak için kullanılan av tüfeği metanemik dizilimi. Sıralı örneklerde tanımlanan tüm mikrobiyal türlerin filogenetik ağacı (N = 120). Sarı ile işaretlenmiş türler (N = 35,% 29.2) sadece kültürsüz balgam örneklerinde görüldü. Mavi ile işaretlenmiş türler (N = 39, %32.5) sadece yapay balgam orta kültür örneklerinde görüldü. Hem kültürsüz hem de kültürlü örneklerde siyan ile işaretlenmiş türler (%N = 46, %38,3) görüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yapay balgam ortamı, klinik izolatların kült haline getirmek için büyüme eğrisi aracı olarak kullanılacak kadar şeffaftır. Her 10 dakikada bir 600 nm'de optimum yoğunluk okumaları yapıldı ve her eğrinin ilk 24 saati gösterildi. Gri çizgiler tek tek okumaları, turuncu çizgiler ise her takson için ortalama emiciliği temsil eder. Yapay balgam orta boş bir kontrol olarak dahil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada hiperoksinin akciğer mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisini incelemek için bir in vitro model geliştirilmiştir. Serum şişelerinin yapay balgam ortamına ve günlük spargingine dayanan bu model, yüksek oksijen konsantrasyonlarını korur ve pwCF'den balgamda tanımlanan mikropların büyümesini destekler.

Bu yaklaşımın birkaç kritik adımı vardır. Birincisi, yapay balgam ortamının ısı sterilizasyonu yerine filtre sterilizasyonu kullanma seçimidir. Filtre sterilizasyonu, ortamın mucin ve diğer ısıya duyarlı bileşenlerinin denatüre olmasını önler ve mikrobiyal büyümenin optik önlemleri için kullanılabilecek net bir ortam sağlar. Filtre sterilizasyonu diğer protokollerde önerilmiş olsa da¹⁰Filtrasyon işlemi sırasında yörüngesel sarsıntının eklenmesinin, hazırlanan ortamın minimum miktarı filtrelendiğinde meydana gelen filtrenin tıkanmasını önlemek için gerekli olduğunu gördük. Filtrelenmiş yapay balgam ortamı filtredeki musin etkisi nedeniyle amaçlanandan daha düşük bir son mucin konsantrasyonuna sahip olabilirken, pwCF'den balganın kistik fibrozis olmayan kişilerden balgamdan daha düşük mucin konsantrasyonlarına sahip olduğu gösterilmiştir²¹. Bu protokolde kullanılan% 1'lik başlangıç mucin konsantrasyonu filtre sterilizasyonu kullanan diğer yaklaşımlara göre daha yüksektir, bir grup% 0.5¹⁰başlangıç mucin konsantrasyonu kullanırken, tipik tarifler% 0.5-2 arasında değişen mucin konsantrasyonları kullanır (Tablo 1). Bu nedenle, filtre sterilizasyon işleminde bir mucin kaybı olsa bile, bu protokol kullanılarak hazırlanan son ortamın fizyolojik aralık²²içinde mucin konsantrasyonlarına sahip olması muhtemeldir.

İkincisi yapay balgam ortamının bileşimidir. Yapay balgam ortamının tarifi pwCF'den balganın mevcut fizyolojik çalışmalarına dayanarak seçilmiştir (Tablo 1). Av tüfeği metasajomik dizilimini kullanarak, bu yapay balgam ortamı ile kültürlenen balganın, kültürsüz balganın mikrobiyal topluluk bileşimini geniş ölçüde yeniden özetlediğini doğrulayabildik (Şekil 3). Normoksik koşullarda, bu ortam kistik fibrozis hastalarının balgamından izole edilen yaygın patojenleri temsil eden 112 farklı klinik izolatın büyümesini de desteklemektedir. Bu nedenle, bu veriler yapay balgam ortamının bu formülasyonunun pwCF'den hava yolu mikrobiyotasının büyümesini desteklediğini göstermektedir. Mevcut tariflere ortak bir ek olan somon sperm DNA'sı (Tablo 1), atlandı. Bu modelin amaçlanan bir uygulaması metasajomik dizilemedir ve bu nedenle somon sperm DNA'sı mikrobiyal olmayan nükleik asitlerin eklenmesini azaltmak için dahil edilmemiştir, çünkü bu okumalar sıralamadan sonra filtrelenecek ve böylece etkili sıralama derinliğimizi azaltacaktır. PwCF'den balgam yüksek konsantrasyonlarda hücre dışı DNA²³'e sahip olsa da, önemli bir kısmı mikrobiyal kökenli²⁴ve yapay balgam ortamına somon sperm DNA'sının eklenmesinin onu daha fizyolojik hale getirip getirmeyeceği veya bu protokolde açıklanan kültür yaklaşımının yüksek düzeyde mikrobiyal türevli hücre dışı DNA'ya yol açıp açmadığı belirsizdir; çalışmalarımızda ekstra ve hücresel içi DNA konsantrasyonlarını ayırt etmedik. Gelecekteki çalışmalar, bu kültleme yöntemiyle oluşturulan hücre dışı DNA konsantrasyonunun doğrulanması isteyebilir.

Üçüncüsü, bilgimize göre, kistik fibrozis akciğer mikrobiyal toplulukları hakkında yayınlanmış hiçbir çalışma hiperoksik koşulları ele almamıştır. Bu model, oksijen sıçrama sistemi oluşturmak için genel laboratuvar veya hastane tedarikçilerinden ucuz ve yaygın olarak bulunan ekipmanları kullanır. Hiperoksik koşulların sürdürülmesi için önemli hususlar arasında serum şişelerindeki mevcut kafa boşluğuna göre kültür ortamının hacmi yer almaktadır. Protokol geliştirme sırasında yapılan ilk denemelerde 125 mL serum şişesi kullanılmıştır. Bununla birlikte, 500 mL serum şişelerinin kullanımı (475 mL kafa boşluğu ile 25 mL kültür oranına izin verir) istenen konsantrasyonun 24 saate kadar korunmasına izin verdi ve böylece oksijen sıçrama sıklığını azalttı. Bu yaklaşım ayrık oksijen koşulları oluşturur, böylece birden fazla oksijen koşulunda farklı hasta örneklerinin eşzamanlı kültürüne izin verir. Anaerobik kültürün diğer araçları, anaerobik kavanozların veya oksijenle kaplı Balç tipi tüplerin kullanımı da dahil olmak üzere hiperoksik kültür için kullanılabilir. Metanenomik dizilim kullanılarak akciğer mikrobiyal topluluklarının analizleri, genel alfa ve beta çeşitliliğinin kültürlü ve kültürsüz balgam arasında karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Tür düzeyinde diferansiyel bolluğu değerlendirirken, Enterobacterale, Streptococcus ve mantarlar da dahil olmak üzere aeropların ve fakülte anaerobelerinin büyümesi için zenginleştirilmiş% 21 oksijende kültleme. Bu muhtemelen pwCF^25,26hava yollarında gözlenen anaerobik bir durumun dışlanmasından kaynaklanmaktadır. Gelecekteki çalışmalar, bir dizi anoksik ve oksiik durumu ve hava yolu mikrobiyal topluluklarında bulunan ilgili aerobik ve anaerobik mikrobiyotayı incelemek için azot gazının bu modele dahil edilmesini düşünebilir.

Bu protokollerde belirtilen temel ilkeler, oksijenin karmaşık mikrobiyal topluluklar veya yaygın akciğer patojenleri üzerindeki etkisi ile ilgili benzer çalışmaların yürütülmesi için öğretici olabilir. Oksijen, tüm ileri akciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılan en yaygın tedavidir ve hava yolu mikrobiyal toplulukları ve yaygın solunum yolu patojenleri üzerinde nasıl beklenmedik etkilere yol açabileceğinin daha iyi anlaşılması pwCF ve diğer kronik akciğer hastalıklarının bakımı için önemli olacaktır.

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu çalışmanın bir kısmı Deniz Biyolojik Laboratuvarı, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (hibe numarası 5600373) ve Simons Vakfı'nın hediyesi ile Deniz Biyolojik Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi.