تصميم وتطوير نموذج لدراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم مجرى الهواء التليف الكيسي

Jacob Vieira; Tara Gallagher; Hui-Yu Sui; Sirus Jesudasen; Katrine Whiteson; George A. O'Toole; Kurt Hanselmann; Peggy S. Lai

doi:10.3791/62888

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير نظام نموذجي لتأثير فرط الأكسجين على المجتمعات الميكروبية التليف الكيسي مجرى الهواء. المتوسط البلغم الاصطناعي يحاكي تكوين البلغم، وظروف زراعة فرط الأكسجين نموذج آثار الأكسجين التكميلي على المجتمعات الميكروبية الرئة.

Abstract

ويعتقد أن المجتمعات الميكروبية مجرى الهواء تلعب دورا هاما في تطور التليف الكيسي (CF) وغيرها من الأمراض الرئوية المزمنة. وقد تم تصنيف الميكروبات تقليديا على أساس قدرتها على استخدام الأكسجين أو تحمله. الأكسجين التكميلي هو العلاج الطبي المشترك تدار للأشخاص الذين يعانون من التليف الكيسي (pwCF); ومع ذلك ، ركزت الدراسات القائمة على الأكسجين والميكروبيوم مجرى الهواء على كيفية نقص الأكسيجة (انخفاض الأكسجين) بدلا من فرط الأكسجين (الأكسجين العالي) يؤثر على المجتمعات الميكروبية الرئة الهوائية والكلية في الغالب. ولمعالجة هذه الفجوة المعرفية الحرجة، تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام وسيط البلغم الاصطناعي الذي يحاكي تكوين البلغم من pwCF. استخدام تعقيم المرشحات، الذي ينتج وسيلة شفافة، يسمح للطرق البصرية لمتابعة نمو الميكروبات وحيدة الخلية في ثقافات التعليق. لخلق ظروف فرط الأكسجين، يستفيد هذا النظام النموذجي من تقنيات الاستزراع اللاهوائي الراسخة لدراسة الظروف المفرطة الأكسجين. بدلا من إزالة الأكسجين، يضاف الأكسجين إلى الثقافات عن طريق التجنيب اليومي من زجاجات المصل مع خليط من الأكسجين المضغوط والهواء. خضع البلغم من 50 pwCF التجنيب اليومي لفترة 72 ساعة للتحقق من قدرة هذا النموذج للحفاظ على ظروف الأكسجين التفاضلية. تم إجراء تسلسل بندقية metagenomic على عينات البلغم المستزرعة وغير المستزرعة من 11 pwCF للتحقق من قدرة هذه الوسيلة على دعم نمو الميكروبات كومينسال ومسببات الأمراض الموجودة عادة في البلغم التليف الكيسي. تم الحصول على منحنيات النمو من 112 عزلة تم الحصول عليها من pwCF للتحقق من قدرة هذا المتوسط البلغم الاصطناعي لدعم نمو مسببات الأمراض التليف الكيسي المشتركة. نجد أن هذا النموذج يمكن أن ثقافة مجموعة واسعة من مسببات الأمراض وcommensals في البلغم CF، يستعيد مجتمع مشابهة إلى حد كبير إلى البلغم غير المستزرعة في ظل ظروف normoxic، ويخلق الأنماط الظاهرية ثقافة مختلفة في ظل ظروف الأكسجين متفاوتة. وقد يؤدي هذا النهج الجديد إلى فهم أفضل للآثار غير المتوقعة الناجمة عن استخدام الأكسجين في البيو سي إف على المجتمعات الميكروبية في مجرى الهواء ومسببات الأمراض التنفسية الشائعة.

Introduction

التليف الكيسي (CF) هو مرض وراثي يتميز بعدم القدرة على إزالة المخاط السميك من الرئتين ، مما يؤدي إلى التهابات متكررة وانخفاض وظائف الرئة التدريجي الذي يؤدي في كثير من الأحيان إلى الحاجة إلى زرع الرئة أو الوفاة. الميكروبيوم مجرى الهواء من الناس مع التليف الكيسي (pwCF) ويبدو أن تتبع نشاط المرض¹, مع انخفاض في التنوع الميكروبي المرتبطة النتائج السلبية على المدى الطويل²^,³. في الدراسات السريرية من pwCF, وقد ارتبط العلاج بالأوكسجين التكميلي مع مرض أكثر تقدما 4^,⁵, على^الرغممن تقليديا, وقد ينظر إلى استخدام العلاج بالأوكسجين باعتباره مجرد علامة لشدة المرض⁶. وقد أظهرت الدراسات الحديثة من التجارب السريرية للمرضى الذين يعانون من فشل في الجهاز التنفسي أن ارتفاع مستويات الأكسجين المريض ترتبط بشكل متناقض مع زيادة في الالتهابات البكتيرية الخطيرة وارتفاع معدل الوفيات⁷, مما يشير إلى أن الأكسجين التكميلي قد تسهم في مرض الإمراض. لم يتم دراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم الرئة التليف الكيسي والمجتمعات الميكروبية الرئة والمجرى الهوائي المرتبطة بها بشكل جيد.

غالبا ما لا يمكن إجراء الدراسات الميكانيكية مباشرة على البشر بسبب الصعوبات اللوجستية والقضايا الأخلاقية المحتملة المرتبطة بالتدخلات ذات الفائدة الطبية غير المعروفة أو الضرر. ويمكن للنهج التحويلية التي تدمج البكبيمنات البيولوجية البشرية في النظم النموذجية أن تقدم رؤى بيولوجية هامة في هذه الحالات. في حين أن القدرة على استخدام الأكسجين أو تحمله كانت تقليديا مكونا مهما في التصنيف الميكروبي ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن كيفية إدخال الأكسجين التكميلي العلاجي إلى البيئة قد يؤدي إلى اضطراب المجتمعات الميكروبية في مجرى الهواء. لإلقاء الضوء على الآثار غير المعروفة للأوكسجين التكميلي على ميكروبيومات مجرى الهواء من pwCF، كنا بحاجة إلى معالجة اثنين من التحديات الرئيسية؛ أولا ، إنشاء وسيط الثقافة التي تقارب من الناحية الفسيولوجية تكوين البلغم CF ؛ ثانيا، إنشاء نظام نموذجي يسمح بالحفاظ على تركيزات الأكسجين المرتفعة في الثقافة على مدى فترات طويلة من الزمن.

وتستخدم وسائل الإعلام البلغم الاصطناعي (ASM) على نطاق واسع لمحاكاة الرئة البلغم ex vivo⁸^,⁹^,¹⁰, ولكن ليس هناك توافق واضح في الآراء على وصفة محددة. يصف هذا البروتوكول وصفة متوسطة البلغم الاصطناعي واستراتيجية إعداد مصممة بعناية لتقريب البلغم من الناحية الفسيولوجية من pwCF. يحدد الجدول 1 قيم الوصفة المختارة استنادا إلى الأدبيات المنشورة. تمت مطابقة المكونات الكيميائية الأساسية وhh للقيم التي حددتها دراسات البلغم CF البشري¹¹^،¹²^،^13. أضيفت العناصر الغذائية الفسيولوجية منخفضة التركيز باستخدام صفار البيض، والتي تم تضمينها على أنها 0.25٪ من المجلد النهائي¹⁰، وكذلك فيتامين وتتبع يمزج المعدن¹⁴^،¹⁵. تم تضمين موسين ، المكون الرئيسي للسبغم¹⁶، في 1 ٪ ث / الخامس¹⁴. على الرغم من أن أكثر كثافة العمالة، تم اختيار تعقيم مرشح على الممارسة التقليدية أكثر من التعقيم الحراري للحد من المشاكل المحتملة من التشبع الناجم عن الحرارة من مكونات وسائل الإعلام الأساسية¹⁰. فائدة إضافية من تعقيم التصفية هو أنه يولد وسائل الإعلام التي هي شفافة (التعقيم الحراري يمكن أن تخلق وسائل الإعلام العكر بسبب هطول الأمطار وتخثر الأملاح والبروتينات)، مما يسمح لهذا الوسائط البلغم الاصطناعي لاستخدامها لمتابعة النمو الميكروبي على أساس الزيادات في العكر.

ويستند هذا النظام النموذجي لثقافة hyperoxic على تقنيات زراعة اللاهوائية حيث يتم إضافة الأكسجين بدلا من إزالتها، وخلق نموذج لتأثير استخدام الأكسجين التكميلي لpwCF. ويبين الشكل 1 وبروتوكول تجنيب الأكسجين المرتبط به مكونات نظام تجنيب الأكسجين، الذي يمكن الحصول عليه بتكلفة منخفضة من موردي المختبرات العامة والمستشفيات. هذا النظام يتيح خلط الأكسجين المضغوط والهواء لتركيزات ثابتة تتراوح بين 21٪ -100٪ الأكسجين. يسمح دمج مستشعر الأكسجين بالتحقق من تركيز خليط غاز الإنتاج ، بالإضافة إلى التحقق من تكوين غاز التدفق الخارجي زجاجات المصل التي تم تجنيبها سابقا للتحقق من الحفاظ على ظروف الأكسجين ضمن النطاق المطلوب.

يحدد هذا البروتوكول الإجراءات لإنشاء وسيط البلغم الاصطناعي ، وبناء واستخدام نظام تجنيب الأكسجين ، وتطبيق كليهما على زراعة البلغم CF في ظل ظروف الأكسجين التفاضلية.

Protocol

حصلت هذه الدراسة على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية للشركاء (البروتوكول رقم 2018P002934). وشمل معيار الإدماج المرضى البالغين الذين يعانون من التليف الكيسي الذين قدموا موافقة خطية مستنيرة على الدراسة. ولم يكن هناك معيار استبعاد. وفقا للمبادئ التوجيهية البروتوكول، تم جمع جميع عينات البلغم من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي خلال زيارة مقررة للمرضى الخارجيين مع مزود السريرية الخاصة بهم.

1. الاصطناعية البلغم إعداد متوسط

ملاحظة: الكميات المذكورة هنا هي لإنتاج 1 لتر من المتوسط البلغم الاصطناعي النهائي، وتفترض الكواشف المحددة المدرجة في جدول المواد. يجب تعديل الأرقام لأحجام أخرى أو لاستخدام الكواشف المختلفة لضمان نفس المنتج النهائي. انظر الجدول 1 للاطلاع على التركيزات المستهدفة.

مزيج كيميائي من البلغم الاصطناعي (ASCM)
ملاحظة: ASCM تشكل 25٪ من حجم المتوسطة النهائية. وهو مستقر على الرف ويمكن إعداده بكميات كبيرة أو مقدما. إذا كان يجري إعدادها للاستخدام في وقت لاحق، autoclave المزيج الكيميائي وتخزينها بأمان في درجة حرارة الغرفة.
1. خلط الحلول المكونة للمخزون الكيميائي.
  1. إعداد 1 M NaCl الأسهم: إضافة 58.44 غرام من NaCl لكل لتر من الماء العقيم.
  2. إعداد 1 M KCl المخزون: إضافة 74.55 غرام من KCl لكل لتر من الماء المعقم.
  3. إعداد 1 M MgSO₄ الأسهم: إضافة 246.47 غرام من MgSO₄· 7H₂O لكل لتر من الماء العقيم، أو 120.37 غرام من MgSO4 اللامائية لكل لتر من الماء العقيم.
  4. إعداد مخزون الجلوكوز 1 M: إضافة 180.16 غرام من الجلوكوز لكل لتر من الماء المعقم.
2. تعقيم الأوتوكلاف الحلول الأسهم الكيميائية، فضلا عن زجاجة فارغة 250 مل. قم بتنفيذ خطوات الاسترداد التلقائي إلى قيم قياسية على الأقل تبلغ 121 درجة مئوية و15 PSI لمدة 30 دقيقة.
3. أضف 80.59 مل من الماء العقيم إلى زجاجة فارغة سعة 250 مل.
4. إضافة 152.30 مل من 1 M NaCl الأسهم إلى هذا المزيج.
5. إضافة 15.8 مل من 1 M KCl الأسهم إلى هذا المزيج.
6. إضافة 610 ميكرولتر من 1 M MgSO₄ الأسهم إلى هذا المزيج.
7. أضف 700 ميكرولتر من مخزون الجلوكوز 1 M إلى المزيج.
مزيج البلغم الموسين الاصطناعي (ASMM)
ملاحظة: ASMM تشكل 50٪ من حجم المتوسطة النهائي. تأكد من أنه يتم إعداده في نفس يوم الدفعة المتوسطة النهائية.
1. أضف 450 مل من الماء العقيم إلى زجاجة فارغة 1 لتر.
2. أضف 50 مل من 10 × ملحي الفوسفات المخزنة (PBS) إلى الزجاجة.
3. أضف شريط اثارة مغناطيسي يمكن التخلص منه إلى الزجاجة.
4. أوتوكلاف الزجاجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني وشريط اثارة.
5. قياس 10 غرام من مسحوق الموسين وإضافته إلى برنامج تلفزيوني.
6. يهز زجاجة بقوة لخلط الأولية.
7. ضع الزجاجة على طبق ساخن مع ستيرر مغناطيسي. ضبط الحرارة على متوسطة عالية تستهدف 50 درجة مئوية وسرعة تحريك إلى 1100 دورة في الدقيقة. تكثيف السرعة تدريجيا بحيث شريط لا يطير قبالة المغناطيس.
  1. اتركيه ليسخن ويحرك لمدة 15 دقيقة.
  2. التقط الزجاجة بقفازات مقاومة للحرارة. لاحظ للتحقق مما إذا كان مسحوق الموسين يستقر خارج المحلول.
  3. إذا لم يذوب مسحوق الموسين بالكامل، أعد الزجاجة إلى الحرارة/الستيرر لمدة 5 دقائق حتى تذوب تماما.
8. السماح للمزيج mucin لتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
مزيج البلغم الاصطناعي البيولوجي (ASBM)
ملاحظة: ASBM هو 25٪ من حجم المتوسطة النهائي. إعداده في نفس اليوم الدفعة المتوسطة النهائية، وخلافا للخلطات الأخرى، لا تعرض مكوناته إلى أي حرارة.
1. إذابة مخزون فيتامين 100x في ثلاجة 4 درجة مئوية أو على الجليد.
  ملاحظة: قبل جزء من المخزون فيتامين في 10 مل aliquots لتقليل عدد من تجميد / ذوبان دورات.
2. أضف 124.24 مل من الماء العقيم إلى زجاجة 250 مل فارغة.
3. إضافة 25.76 مل من 50x مخزون الأحماض الأمينية الأساسية إلى هذا المزيج.
4. إضافة 80.14 مل من 100x مخزون الأحماض الأمينية غير الأساسية إلى هذا المزيج.
5. إضافة 10 مل من (إذابة) 100x فيتامين المخزون إلى هذا المزيج.
6. إضافة 1 مل من 1000x تتبع مخزون المعادن إلى هذا المزيج.
7. إضافة 8.33 مل من 30٪ مستحلب صفار البيض إلى هذا المزيج.
8. إضافة 400 ميكرولتر من 10 غرام / لتر الأسهم فيريتين إلى هذا المزيج.
9. مزيج الحل بشكل جيد عن طريق اهتزاز اليدوي.
متوسط البلغم الاصطناعي (ASM)
1. أضف 250 مل من ASCM إلى زجاجة 1 لتر التي تحتوي على ASMM.
2. أضف 250 مل من ASBM إلى الزجاجة المتوسطة.
3. قم بتكريس الوسط مع المخزن المؤقت MOPS الأساسي (1 M) للوصول إلى درجة الحموضة 6.3 على ورق درجة الحموضة الضيق النطاق. قبل المعايرة، سيكون المزيج المتوسط حمضيا جدا.
4. قم بتبريد متوسط البلغم الاصطناعي الناتج عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للترشيح.
5. لبدء عملية الترشيح، نقل 200 مل من المتوسط البلغم الاصطناعي غير المصفاة إلى نظام الترشيح فراغ مع مرشح حجم المسام 0.22 ميكرومتر.
6. قم بتوصيل نظام الترشيح بمضخة الفراغ، قم بتشغيل مضخة الفراغ، وحددها ب 70 mbar، ثم ضع الغرفة على هزة شاكر مدارية عند 90 دورة في الدقيقة في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية.
  1. أعلى قبالة مع 150 مل إضافية من المتوسط كمبلغ ملحوظ يتم تصفيتها. يستغرق 1-2 أيام لتصفية 1 لتر من المتوسطة تماما.
  2. كرر مع غرف إضافية حتى يتم تصفية جميع وسائل الإعلام.
    ملاحظة: حاول عدم تصفية أكثر من 350 مل من الوسط خلال نفس عامل التصفية 0.22 ميكرومتر لأن الموسين سيقوم بتوصيل الفلتر بمرور الوقت.
7. تبريد المتوسط البلغم الاصطناعي المصفاة في 4 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. استخدم ASM في غضون شهر واحد من التحضير للحصول على أفضل النتائج.

2. الأوكسجين Sparging

إعداد محطة التجنيب
ملاحظة: يجب أن يكون هذا البروتوكول فقط بحاجة إلى القيام به بالكامل مرة واحدة، وبعد ذلك يمكن الاحتفاظ الإعداد من خلال صيانة بسيطة حسب الضرورة. انظر الشكل 1 للحصول على تخطيط مرئي لنظام تجنيب الأكسجين.
1. الحصول على خزانات الهواء والأوكسجين المضغوطة وتأمينها بشكل صحيح.
  تنبيه: الضغط العالي يجعل الدبابات خطيرة للغاية عند سوء التعامل معها. تأكد من أن الدبابات مغلقة تماما ومؤمنة، لا توجد تسربات عند إغلاق الخزان، وأن جميع العاملين في المناولة مدربون تدريبا كاملا على استخدامها.
2. إرفاق منظم الهواء إلى خزان الهواء المضغوط مع وجع. لقراءة التدفق الأمثل على المنظم، قم بإرفاق المنظم في أقرب وقت ممكن بوضع مستقيم.
3. إرفاق منظم الأكسجين إلى خزان الأكسجين المضغوط، وربط أقرب ما يمكن إلى وضع مستقيم. اعتمادا على خزان الأكسجين، قد يحتاج المرء إلى عكس الاتجاه لتشديد.
4. قم بتوصيل الأنابيب من المنظمين بموصل Y لدمج تدفق الغاز من الخزانين.
5. قم بتوصيل مخرج موصل Y بصمام تقاطع T المركزي.
6. قم بتوصيل جانب واحد من صمام تقاطع T المركزي بمقياس ضغط الغاز.
7. قم بتوصيل الجانب الآخر من مقياس ضغط الغاز بمرشح حقنة معقم قطره 25 مم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
8. إرفاق مرشح حقنة قطرها 25 ملم الثانية إلى حقنة دون المكبس لاستخدامها كإطلاق الغاز أثناء التجنيب.
9. قم بتوصيل الجانب الأخير من صمام تقاطع T المركزي بصمام T-junction الثاني لجهاز مراقبة الأكسجين.
10. قم بتوصيل فلتر حقنة قطره 25 مم إلى جانب واحد من صمام T-junction الثاني هذا، إلى جانب أنابيب لإرفاق إبر 18 G.
11. قم بتوصيل الجانب الأخير من صمام T-junction الثاني بجهاز مراقبة الأكسجين.
12. توصيل أنبوب قطع إلى الجانب الآخر من جهاز مراقبة الأكسجين لاستخدامها كإطلاق الغاز أثناء الرصد.
  تنبيه: عند اختبار/استخدام نظام تجنيب الأكسجين، لاحظ بعناية وضع تقاطعات T وتأكد من مطابقته للمسار المقصود من خلال النظام. الفشل في القيام بذلك سيؤدي إلى تراكم الضغط داخل النظام ويتسبب في فشل المكونات وتفككها.
13. لصيانة النظام والحفاظ عليه يعمل في الأداء الأمثل، والممارسات التالية مفيدة.
  1. تعزيز الاتصالات مع كميات ليبرالية من الشريط تفلون لتحسين كبير في الختم والحد من فرصة المكونات التي تأتي بعيدا عن الضغط الداخلي.
  2. حافظ على معدل التدفق المشترك تحت 10 لتر/دقيقة لتخفيف الضغط الأقصى ومنع الأعطال.
  3. إذا اشتبه في حدوث تسرب، فاستخدم محلول المنظفات مثل كاشفات التسرب السائل المتاحة تجاريا لتحديد موقعه بسهولة، حيث أنه سيتضخم فوق أي تسرب للغاز. تسرب التصحيح باستخدام شريط البوليتيترافلوروإيثيلين (على سبيل المثال، تفلون).
  4. استبدل مرشحات المحاقن بقطر 25 مم في نظام تجنيب الأكسجين كل أسبوعين ، ولكن هذا يختلف مع تكرار الاستخدام. مع مرور الوقت، تقلل الجسيمات التي يتم التقاطها في الفلتر من معدل تدفق الغاز وتسبب تراكمات الضغط.
  5. معايرة مراقبة الأكسجين إلى 21٪ الأكسجين ضغط الهواء قبل إجراء القياسات.
  6. عند الانتهاء من استخدام النظام، إيقاف الخزانات ونزيف الغاز الزائد من المنظمين حتى يتوقف التدفق تماما.
مصل زجاجة الثقافة تجنيب
1. تسمية 500 مل زجاجات مصل autoclaved مع معرفات العينة، وتاريخ / وقت التطعيم، ونسبة الأكسجين المستهدفة.
2. في غطاء محرك السيارة البيولوجي، أضف 24 مل من متوسط البلغم الاصطناعي إلى كل زجاجة مصل يتم إعدادها.
3. إضافة 1 مل من البلغم المريض متجانسة مع إبرة 18-G (المخفف مع المالحة العقيمة إذا لزم الأمر للحصول على حجم كاف من العينة لكل حالة ثقافة) إلى كل زجاجة مصل.
4. باستخدام ملاقط معقمة، ضع سدادات المطاط المعبأة تلقائيا على الجزء العلوي من كل زجاجة مصل.
5. اضغط أسفل سدادات المطاط، والحرص على عدم لمس الجانب السفلي من سدادة مع اليدين.
6. إزالة الزجاجات من غطاء محرك السيارة، وتطبيق وتجعيد الأختام الألومنيوم. إزالة قطعة مركز من الأختام.
7. مسح أسفل الجزء العلوي من الزجاجات مع مسح الكحول وتمريرها من خلال لهب الموقد بونسن.
8. لصق إبرة معقمة 18-G إلى حقنة المكبس أقل مع مرشح. أدخل هذا الإصدار من الغاز في الزجاجة أولا.
9. لصق إبرة معقمة 18-G إلى إخراج الغاز من النظام وإدراج إبرة إخراج الغاز في زجاجة كذلك.
10. توجيه T-تقاطعات من الخزانات من خلال رصد الأكسجين. تحقق من أن تركيز الأكسجين المستهدف يتدفق عبر النظام. الهدف ما يقرب من 5 لتر / دقيقة من تدفق الغاز.
11. إعادة توجيه تقاطعات تي من الدبابات من خلال لانتاج الغاز. يبدأ الغاز بالتدفق عبر زجاجة المصل.
  تنبيه: انتبه عن كثب إلى مقياس الضغط أثناء تجنيب الأكسجين. إذا زاد الضغط بشكل غير متوقع، أغلق النظام فورا.
12. تشغيل الأكسجين سبارج من خلال زجاجة المصل لمدة 1 دقيقة. في 5 لتر / دقيقة، وهذا يسمح ل10 التبادلات الجوية ويضمن الغلاف الجوي الداخلي يصل إلى الضغط الجزئي المطلوب.
13. إزالة الغاز الإفراج عن إبرة 18-G.
14. السماح للضغط في زجاجة المصل لبناء إلى +1 الغلاف الجوي (2 الغلاف الجوي على مستوى سطح البحر) ومن ثم إزالة فورا إبرة إخراج الغاز.
  ملاحظة: يساعد الحفاظ على الضغط على الاحتفاظ بظروف فرط الأكسجين بمرور الوقت.
15. ضع زجاجة المصل في حاضنة شاكر 37 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة. احتضان العينات لمدة ثلاث فترات 24 ساعة. في كل فاصل زمني 24 ساعة، واتخاذ aliquot لتحليل المصب، وإعادة sparge العينات وإعادتها إلى الحضانة لمدة حضانة مجموع 72 ساعة.
قياس الأكسجين التدفقي
1. معايرة مقياس الأكسجين إلى 21٪ الهواء المضغوط، ومن ثم إيقاف تشغيل الخزان.
2. توجيه كمية زجاجة المصل من خلال مراقبة الأكسجين ولصق إبرة معقمة حتى النهاية.
3. أدخل الإبرة من خلال سدادة المطاط في زجاجة المصل.
4. انتظر حتى تستقر قراءة التدفق إلى الخارج. انخفاض معدل التدفق من زجاجات المصل يعني أن هذا قد يستغرق ما يصل إلى 2 دقيقة. الإبلاغ عن فرق الذروة من هواء الغرفة (العدد الأبعد من 21٪).
5. إذا كان أداء قراءات متعددة، مسح النظام مع الهواء المضغوط بين القراءات.

النتائج

تم تطبيق هذه البروتوكولات على 50 عينة من البلغم المتوقع من pwCF تقديم الرعاية الروتينية إلى عيادة التليف الكيسي في العيادات الخارجية في مستشفى ماساتشوستس العام في بوسطن، ماساتشوستس. تم استزراع البلغم لكل مريض تحت 21٪ و 50٪ و 100٪ من حالات الأكسجين باستخدام متوسط البلغم الاصطناعي ، مع 0.5 مل aliquots مأخوذة من كل ثقافة في 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من وقت الثقافة للاختبار. تم تصوير الثقافات عندما تم إجراء عمليات الاستخراج لتتبع التغيرات البصرية. بالإضافة إلى ذلك ، تم أخذ 0.5 مل من كل عينة البلغم الأولية قبل الاستزراع. وأسفر ذلك عن 10 عينات منفصلة لكل مريض وعينة نهائية من 500 عينة. من بين هؤلاء ، خضع البلغم من 11 مريضا (11 sputa غير مثقف ، و 11 sputa مثقف من الأكسجين بنسبة 21٪ عند 48 ساعة من الحضانة) لاستخراج الحمض النووي¹⁷، وتم إنشاء مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي التجارية ، وتم إجراء تسلسل metagenomic على منصة تسلسل الجينوم بأكملها التي تستهدف ~ 5 غيغابايت من التسلسل لكل عينة مع 150 زوجا أساسيا ، يقرأ نهاية مقترنة. تمت معالجة قراءات الخام باستخدام مجموعة من^{الأدوات 18 المخابز}الحيوية ، والتي تشمل مراقبة الجودة وإزالة تسلسل "الملوثات" البشرية والتنميط التصنيفي مع محلل ملفات التعريف MetaPhlAn3¹⁹. في وقت استخراج الحمض النووي ، تم إدخال 10 ملايين خلية من Imtechella halotolerans، وهي نوع غير متسامح موجود عادة في النظم الإيكولوجية لمصب النهر وليس في المجتمعات الميكروبية البشرية ، في كل عينة ، مما يسمح بالكم الكمي للحمولة الميكروبية المطلقة لكل عينة^20.

ويبين الشكل 2 قياسات الأكسجين الفردية والمتوسطة للتدفق إلى الخارج ومستويات الحموضة على مدار عملية زراعة 50 عينة من البلغم المستزرعة في ظل كل حالة أكسجين ومثال على النمط الظاهري لثقافة تفاضلية بصرية. تم الحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية إلا خلال فترات وجيزة عندما تم تنفيذ تجنيب وإزالة عينات من الاقتباسات. مع كل من فترات التجنيب من 12 ساعة و 24 ساعة، تم الحفاظ على تركيزات الأكسجين مرتفعة، على الرغم من أنه لوحظ انخفاض مع مرور الوقت لجميع ظروف الأكسجين الثلاثة، مع انخفاض الأكسجين 100٪ إلى ما يقرب من 85٪، 50٪ الأكسجين انخفض إلى 40٪، و 21٪ الأكسجين انخفض إلى 18٪. وظلت ظروف الأكسجين متميزة، والأهم من ذلك، تم الحفاظ على تركيزات الأكسجين المرتفعة طوال عملية عينات الإفراط في الأكسجين. وأظهرت قياسات درجة الحموضة درجة أكبر من التباين ولكنها ظلت ضمن نطاق طبيعي من الناحية الفسيولوجية دون أي تغييرات ذات دلالة إحصائية مع مرور الوقت. وتشير هذه القياسات إلى أن هذه الأساليب تحافظ على ظروف الأكسجين التفاضلية المنفصلة طوال عملية الثقافة. وأخيرا، يظهر مثال واحد من العديد من الأنماط الظاهرية للثقافة البصرية التي تفرقت عبر تركيز الأكسجين. وقد وضعت هذه العينة علامة على اختلافات العكر بعد 72 ساعة من الثقافة، مع ارتفاع الأكسجين المرتبطة انخفاض العكر البصري. تدعم الأنماط الظاهرية الثقافية التفاضلية وجود آثار ناجمة عن فرط الأكسيا على المجتمعات الثقافية.

يقارن الشكل 3 الحمل الميكروبي والتنوع الميكروبي وتكوين المجتمع الميكروبي بين البلغم غير المستزرع والبلغم المستزرع (حالة أكسجين بنسبة 21٪ لمدة 48 ساعة). وتكشف القياسات عن الفرق الرئيسي الوحيد الذي أدخله فعل الزرع وهو زيادة الحمل الميكروبي بنحو 20 ضعفا مقارنة بالنغم غير المستزرع. الجهاز المناعي وآليات إزالة البلغم الميكانيكية النموذجية مثل السعال عادة ما تكون بمثابة عملية تنظيمية تحد من الحمل الميكروبي في الرئة ، حتى في حالات الخلل الوظيفي والعدوى مثل تلك التي شوهدت في pwCF. لا تملك ثقافة الجسم الحي السابق مثل هذه الآليات التنظيمية ، والمجتمعات الميكروبية حرة بدلا من ذلك في المضي قدما نحو التشبع الخلوي. تشير مقاييس تنوع ألفا وبيتا إلى أنه على الرغم من هذا الاختلاف في الحمل الميكروبي، فإن التكوين المجتمعي الأساسي لا يزال محفوظا بشكل جيد، مع الحد الأدنى من الاختلافات العالمية التي أدخلتها عملية الثقافة.

ويتوسع الشكل 4 في المقارنة بين عينات البلغم غير المستزرعة والمثقفة، ويبحث في الوجود الثنائي/غياب الأنواع الميكروبية ال 120 التي تم تحديدها بشكل قاطع عن طريق تسلسل الميتاجينوميك بندقية من البلغم المستزرع وغير المستزرع التي تم الحصول عليها من 11 مريضا. تتجمع الميكروبات على أساس أوجه التشابه النباتية. وتم تحديد 46 (38.3 في المائة) من هذه الأنواع في عينات غير مثقفة ومزرعة (لون سماوي)، في حين تم تحديد 35 (29.2 في المائة) حصريا في عينات غير مثقفة (صفراء) و39 (32.5 في المائة) في عينات مثقفة (زرقاء). ومن المرجح أن يكون هناك تكافؤ أكبر مما حددناه باستخدام التسلسل من حيث ما هو موجود وما هو غائب، ولكن بعض التصنيفات تقع تحت عتبة الكشف عن التسلسل في بعض الحالات. تشير الاختلافات إلى أن عملية الثقافة تقدم بعض التحيز في المستزرعة مقارنة بالنغم غير المثقف. أبرزها، زراعة يزيد من وجود الفطريات مثل المبيضات و Aspergillus، فضلا عن أعضاء Enterobacterales بما في ذلك Escherichia، سيراتيا،وأعضاء العقدية. وعلى العكس من ذلك، كان أعضاء البكتيريا مثل بريفوتيلا وكلوستريداليس، وهي anaerobes، موجودين في عينات غير مثقفة ولكنهم لم يكونوا موجودين في عينات مثقفة. وقد يعزى ذلك إلى عدم وجود حالة لاهوائية في نموذجنا التجريبي.

ويبين الشكل 5 منحنيات النمو القائمة على الامتصاص لمسببات الأمراض الرئوية الشائعة من نوع CF المعزولة عن البلغم التي تم الحصول عليها من 50 pwCF مختلفة. تمثل هذه العزلات عزلات سريرية مختلفة بشكل الظاهري تم الحصول عليها باستخدام إجراءات ثقافة الإثراء من مختبر الميكروبيولوجيا السريرية في مستشفى ماساتشوستس العام ، وتشمل Pseudomonas aeruginosa (N = 53) ، المكورات العنقودية أوريوس (N = 37) ، Stenotrophomonas maltophilia (N = 12) ، كليبسيلا الالتهاب الرئوي (N = 3) ، و Achromobacter sp sp (ن = 7). تم الحصول على منحنيات النمو عن طريق زراعة كل عزل في وسائط البلغم الاصطناعي عند 37 درجة مئوية في الظلام ، مع تلقيح بكتيري ASM sans بمثابة تحكم سلبي. تسمح الجودة الشفافة ل ASM (التي يرجع سببها إلى التصفية بدلا من التعقيم الحراري) بإجراء تدابير بصرية لتقدير منحنيات النمو. تم أخذ قراءات بصرية على 600 نانومتر (OD600) كل 10 دقائق ، وتظهر أول 24 ساعة من كل منحنى. عدم وجود تغييرات في القراءات البصرية في التحكم السلبي ASM فقط يشير إلى الثقافات خالية من التلوث. تتبع المنحنيات الواضحة الموضحة هنا أنماط منحنى النمو النموذجية التي تشير إلى جدوى وصفة ASM هذه كوسيلة لتوليد منحنيات النمو القائمة على الامتصاص.

العمود 1	العمود الثاني	العمود الثالث	العمود الرابع	العمود الخامس	العمود السادس	العمود السابع	العمود الثامن	العمود 9
قيمة	كومستوك	كيرتشنير	سريرامولو	بالمير	فلين	غالاغير	لاي	مصدر
موسين	2٪ ث/v	0.5٪ ث/v	0.5٪ ث/v	-	1٪ ث/v	2٪ ث/v	1٪ ث/v	فلين
كلوريد الصوديوم	85.5 مليون متر	85.5 مليون متر	85.5 مليون متر	66.6 مليون متر	89.8 مليون متر	85.5 مليون متر	152.3 متر في اليوم	لابيير
كلوريد البوتاسيوم	29.5 مليون متر	29.5 مليون متر	29.5 مليون متر	15.8 مليون متر	-	2.95 متر في اليوم	15.8 مليون متر	بالمير
سلفات المغنيسيوم	-	-	-	0.6 مليون متر	1 مليون متر	1 مليون متر	0.61 مليون متر	بالمير
كبريتات الحديد	-	-	-	0.0036 مليون متر	-	-	-	-
كلوريد الأمونيوم	-	-	-	2.3 مليون متر	60 مليون متر	-	-	-
فوسفات مونوبوتاسيوم	-	-	-	2.5 مليون متر	60 مليون متر	-	-	-
الجلوكوز	-	-	-	3.2 مليون متر	13 مليون متر	40 مليون متر	0.7 مليون متر	سامبيك
لاكتات	-	-	-	9 مليون متر	-	-	-	-
الأحماض الأمينية الأساسية	14.45x	0.25 غرام/لتر	0.25 غرام/لتر	لكل حمض	0.5x	0.375x	1.29x	بالمير
الأحماض الأمينية غير الأساسية	28.9x	0.25 غرام/لتر	0.25 غرام/لتر	لكل حمض	0.25x	0.5x	8.01x	بالمير
فيتامينات	-	-	-	-	-	1x	1x	غالاغير
تتبع المعادن	-	-	-	-	1x	1x	1x	فلين
صفار البيض	0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	كيرتشنير
فيريتين	0.0003 غرام/لتر	-	-	-	-	0.0004 غرام/لتر	0.0004 غرام/لتر	غالاغير
سلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي	1.4 غرام/لتر	4 جم/لتر	4 جم/لتر	-	-	1.4 غرام/لتر	-	-
DPTA	-	-	0.0059 جم/لتر	-	-	-	-	-
الرقم الهيدروجيني	-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	لابيير
خزن	0	4°	-	-	4°	4°	4°	كيرتشنير
تعقيم	الأوتوكلاف	راووق	الأوتوكلاف	-	الأوتوكلاف	الأوتوكلاف	راووق	كيرتشنير

الجدول 1: وصفة متوسطة البلغم الاصطناعي المستمدة من استعراض الأدبيات. (عمود 1) الكواشف والقيم الرئيسية في صياغة المتوسط البلغم الاصطناعي. (أعمدة 2-7) مقارنة وصفات من الأدب موجود⁸^،⁹^،¹⁰^،¹²^،¹⁴^،¹⁵. (الأعمدة 8-9) وصفة متوسطة البلغم الاصطناعي مفصلة في هذا البروتوكول والمصادر المقابلة التي أبلغت كل قيمة مختارة¹⁰^،¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴^،¹⁵.

العمود 1	العمود الثاني	العمود الثالث
	CF البلغم	ASM
مجموع الأحماض الأمينية	10.25 مليون متر	10.76 مليون متر
ألانين	0.96 مليون متر	0.80 مليون متر
أرجينين	0.17 مليون متر	0.94 مليون متر
أسباراجين		0.91 مليون متر
حمض الأسبارتيك	0.45 مليون متر	0.80 مليون متر
سيستين	0.09 مليون متر	0.33 مليون متر
حمض الغلوتاميك	0.84 مليون متر	0.80 مليون متر
غليسين	0.65 متر في اليوم	0.80 مليون متر
هيستيدين	0.28 مليون متر	0.35 مليون متر
أيزولوسين	0.60 متر في اليوم	0.52 مليون متر
لوسين	0.87 مليون متر	0.52 مليون متر
ليسين	1.15 مليون متر	0.64 مليون متر
ميثيونين	0.34 مليون متر	0.13 مليون متر
أورنيثين	0.36 مليون متر
فينيلالاناين	0.29 مليون متر	0.26 مليون متر
برولين	0.90 مليون متر	0.80 مليون متر
سيرين	0.78 مليون متر	0.80 مليون متر
ثريونين	0.58 مليون متر	0.52 مليون متر
تريبتوفان	0.07 مليون متر	0.06 متر في اليوم
تيروزين	0.43 مليون متر	0.26 مليون متر
فالين	0.60 متر في اليوم	0.52 مليون متر

الجدول 2: تركيزات الأحماض الأمينية الموصوفة سابقا في البلغم التليف الكيسي وفي وصفة متوسطة البلغم الاصطناعي مفصلة في هذا البروتوكول. (عمود 1) الأحماض الأمينية الرئيسية. (عمود 2) تركيزات الأحماض الأمينية من البلغم من الأشخاص الذين يعانون من التليف الكيسي¹². (عمود 3) تركيزات الأحماض الأمينية في المتوسط البلغم الاصطناعي مفصلة في هذا البروتوكول

figure-results-14167
الشكل 1: تخطيطي اتصال من مكونات نظام الاوكسجين تجنيب. رسم بياني تدفق الاتصالات بين مكونات النظام المستخدمة ل sparge زجاجات المصل لتركيزات الأكسجين المطلوب بين 21٪ و 100٪. يحتوي النظام على 3 طرق استخدام يحددها موضع صمامي تقاطع T. ويمكن للنظام توجيه الغاز من الخزانات من خلال إنتاج الغاز أو من خلال رصد نسبة الأكسجين، فضلا عن تدفق الغاز من زجاجات المصل التي سبق أن نجت من خلال جهاز العرض للتحقق من التركيز بعد مرور الوقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-14918
الشكل 2:يتم الحفاظ على تركيزات الأكسجين المستهدفة تقريبا مع كل من فترات تجنيب 12 ساعة و 24 ساعة، ويظل الرقم الحموضة في النطاق الفسيولوجي أثناء الثقافة. (أ)تدفق قراءات الأكسجين من 12 ساعة و 24 ساعة فواصل الاوكسجين تجنيب على مدى فترة 72 ساعة. (ب) قراءات درجة الحموضة لعينات تقاس كل 24 ساعة (C) صورة مثال لعينة مثقفة CFB010 بعد 72 ساعة، وعرض العكر التفاضلي عبر تركيزات الأكسجين. اللون يشير إلى نسبة الأكسجين المستهدفة; تشير أشرطة الخطأ إلى فواصل الثقة بنسبة 95٪. يتم التأكيد على العتبات الحرجة مع خطوط متقطعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-15808
الشكل 3:زراعة الجراثيم يزيد من الحمل الميكروبي، ولكن يتم الحفاظ على تكوين المجتمع الأساسي. البلغم غير المستزرع (الأصفر) والبلغم المستزرع (الأزرق) باستخدام متوسط البلغم الاصطناعي بنسبة 21٪ من الأكسجين لمدة 48 ساعة. خضعت Aliquots لاستخراج الحمض النووي وتسلسل metagenomics بندقية للكشف عن التحيز المحتملة التي أدخلت من ظروف الثقافة. (أ)تحميل الميكروبية المطلقة (التي تحددها ارتفاع في الضوابط) ومقاييس التنوع ألفا. باستخدام نماذج الآثار المختلطة الخطية ، توقع البلغم غير المثقف مقابل البلغم المستزرع الحمل الميكروبي ولكن ليس تنوع ألفا. (ب) تنسيق المكونين الأولين من مقاييس التنوع بيتا، والسيطرة على الفرق في الحمل الميكروبي. لا فرق كبير في أي متري بعد PERMANOVA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-16832
الشكل 4:غالبية التصنيف المحدد موجودة في كل من البلغم المصدر والثقافة، في حين أن الآخرين تظهر فقط في البلغم المصدر أو الثقافة. تسلسل metagenomics بندقية تستخدم لمقارنة الاختلافات في تكوين المجتمع الميكروبية بين عينات البلغم غير المستزرعة والمثقفة. شجرة فيلوجينية لجميع الأنواع الميكروبية المحددة في عينات متسلسلة (N = 120). ولم تشاهد الأنواع المعلمة باللون الأصفر (N = 35، 29.2٪) ولم تشاهد الأنواع المعلمة باللون الأزرق (N = 39، 32.5٪) وشوهدت الأنواع المعلمة بالسياني (N = 46، 38.3٪) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-17646
الشكل 5:المتوسط البلغم الاصطناعي شفاف بما فيه الكفاية لاستخدامه كوسيلة منحنى النمو لزراعة العزلات السريرية. تم أخذ قراءات الكثافة المثلى في 600 نانومتر كل 10 دقائق ، ويتم عرض أول 24 ساعة من كل منحنى. تمثل الخطوط الرمادية قراءات فردية، وتمثل الخطوط البرتقالية متوسط الامتصاص لكل تصنيف. الاصطناعي البلغم متوسطة فارغة المدرجة كعنصر تحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه الدراسة، تم تطوير نموذج في المختبر لدراسة تأثير فرط الأكسجين على المجتمعات الميكروبية الرئة. هذا النموذج، استنادا إلى البلغم الاصطناعي المتوسطة ويومية تجنيب زجاجات المصل، ويحافظ على تركيزات الأكسجين مرتفعة ويدعم نمو الميكروبات المحددة في البلغم من pwCF.

وهناك عدة خطوات حاسمة في هذا النهج. الأول هو اختيار استخدام مرشح التعقيم بدلا من التعقيم الحراري للوسط البلغم الاصطناعي. يمنع تعقيم المرشحات تدحر الموسين والمكونات الأخرى الحساسة للحرارة في الوسط وينتج عنه وسيط واضح يمكن استخدامه للمقاييس البصرية للنمو الميكروبي. في حين تم اقتراح تعقيم المرشحات في البروتوكولات^{الأخرى 10}، وجدنا أن إضافة الاهتزاز المداري أثناء عملية الترشيح كان ضروريا لمنع انسداد الفلتر الذي حدث بخلاف ذلك عندما تم تصفية الحد الأدنى من المتوسط المعد. في حين أن المتوسط البلغم الاصطناعي المصفاة قد يكون تركيز الموسين النهائي أقل من المقصود بسبب ارتطام الموسين في المرشح ، فقد ثبت أن البلغم من pwCF يحتوي على تركيزات موسين أقل من البلغم من الأشخاص الذين لا يعانون من التليف الكيسي^21. تركيز الموسين بدءا من 1٪ المستخدمة في هذا البروتوكول هو أعلى مما كانت عليه في النهج الأخرى التي استخدمت تصفية التعقيم، مع مجموعة واحدة باستخدام تركيز الموسين بدءا من 0.5٪^10،في حين أن وصفات نموذجية استخدام تركيزات الموسين تتراوح بين 0.5٪ -2٪(الجدول 1). وهكذا، حتى مع فقدان الموسين في عملية تصفية التعقيم، والمتوسطة النهائية التي أعدت باستخدام هذا البروتوكول من المرجح أن يكون تركيزات الموسين ضمن النطاق الفسيولوجي²².

والثاني هو تكوين المتوسط البلغم الاصطناعي. تم اختيار وصفة للوسط البلغم الاصطناعي على أساس الدراسات الفسيولوجية القائمة من البلغم من pwCF (الجدول 1). باستخدام تسلسل metagenomics بندقية، كنا قادرين على التحقق من أن البلغم المستزرعة مع هذا المتوسط البلغم الاصطناعي يلخص على نطاق واسع تكوين المجتمع الميكروبي من البلغم غير المستزرعة(الشكل 3). في الظروف normoxic ، دعمت هذه الوسيلة أيضا نمو 112 عزلة سريرية مختلفة تمثل مسببات الأمراض الشائعة المعزولة عن البلغم لمرضى التليف الكيسي. وهكذا، فإن هذه البيانات تثبت أن هذه الصيغة من المتوسط البلغم الاصطناعي يدعم نمو ميكروبيوتا مجرى الهواء من pwCF. تم حذف الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون، إضافة شائعة إلى الوصفات الموجودة(الجدول 1). أحد التطبيقات المقصودة لهذا النموذج هو تسلسل metagenomics ، وبالتالي لم يتم تضمين الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون من أجل تقليل إضافة الأحماض النووية غير الميكروبية حيث سيتم تصفية هذه القراءات بعد التسلسل ، وبالتالي تقليل عمق التسلسل الفعال لدينا. في حين أن البلغم من pwCF يحتوي على تركيزات عالية من الحمض النووي خارج الخلية²³، فإن نسبة كبيرة منه ميكروبية في الأصل²⁴، ومن غير الواضح ما إذا كان إضافة الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون إلى متوسط البلغم الاصطناعي يجعله أكثر فسيولوجيا أو ما إذا كان نهج الثقافة الموصوف في هذا البروتوكول يؤدي إلى مستويات عالية من الحمض النووي خارج الخلية المشتقة من الميكروبات ؛ لم نميز بين تركيزات الحمض النووي خارج الخلية وداخلها في دراساتنا. قد ترغب الدراسات المستقبلية في التحقق من تركيز الحمض النووي خارج الخلية الناتج عن طريقة الاستزراع هذه.

ثالثا، على حد علمنا، لم تعالج أي دراسات منشورة حول المجتمعات الميكروبية الرئوية التليف الكيسي الحالات فرط الأكسجين. يستخدم هذا النموذج معدات غير مكلفة ومتوفرة بشكل شائع من موردي المختبرات العامة أو المستشفيات لبناء نظام لتجنيب الأكسجين. اعتبارات هامة للحفاظ على ظروف hyperoxic تشمل حجم المتوسطة الثقافة بالنسبة لمساحة الرأس المتاحة في زجاجات المصل. وفي المحاولات الأولية أثناء وضع البروتوكول، استخدمت 125 زجاجة مصل مل. ومع ذلك، فإن استخدام زجاجات مصل 500 مل (مما يسمح لمساحة رأس 475 مل إلى 25 مل نسبة الثقافة) سمح بالحفاظ على التركيز المطلوب لمدة تصل إلى 24 ساعة، وبالتالي تقليل وتيرة تجنيب الأكسجين. هذا النهج يولد ظروف الأكسجين منفصلة، مما يسمح للثقافة المتزامنة لعينات المريض المختلفة عبر ظروف الأكسجين متعددة. يمكن الاستفادة من أدوات أخرى من الثقافة اللاهوائية لثقافة فرط الأكسجين ، بما في ذلك استخدام الجرار اللاهوائية أو أنابيب من نوع Balch بمنأى عن الأكسجين. وتشير تحليلات المجتمعات الميكروبية الرئوية التي تستخدم تسلسل الميتاجينوميك إلى أن التنوع العام في ألفا وبيتا قابل للمقارنة بين البلغم المستزرع وغير المستزرع. عند تقييم وفرة الفرق على مستوى الأنواع، وزراعة في الأكسجين 21٪، المخصب لنمو الايروبيس وanaerobes أعضاء هيئة التدريس، بما في ذلك Enterobacterale، المكورات العقدية، والفطريات. هذا هو المرجح بسبب استبعاد حالة اللاهوائية التي لوحظت في الشعب الهوائية من pwCF²⁵^،²⁶. ويمكن للدراسات المستقبلية أن تنظر في إدراج غاز النيتروجين في هذا النموذج لدراسة مجموعة من الحالات الأنوكسية والأكسدية والميكروبات الهوائية والهوائية المقابلة الموجودة في المجتمعات الميكروبية مجرى الهواء.

قد تكون المبادئ الرئيسية المبينة في هذه البروتوكولات مفيدة لإجراء دراسات مماثلة تتعلق بتأثير الأكسجين على المجتمعات الميكروبية المعقدة أو مسببات الأمراض الرئوية الشائعة. الأكسجين هو العلاج الأكثر شيوعا المستخدمة في علاج جميع أمراض الرئة المتقدمة، وفهم أفضل لكيفية أنه قد يؤدي إلى آثار جانبية غير متوقعة على المجتمعات الميكروبية مجرى الهواء ومسببات الأمراض التنفسية الشائعة ستكون مهمة لرعاية pwCF وأمراض الرئة المزمنة الأخرى.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgements

وقد تم تنفيذ جزء من هذا العمل في المختبر البيولوجي البحري بدعم من المختبر البيولوجي البحري، وزارة البيئة (DE-SC0016127)، NSF (MCB1822263)، HHMI (رقم المنحة 5600373)، وهدية من مؤسسة سيمونز.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME Vitamins (100x) Solution	MilliporeSigma	B6891	Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021	Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion	HiMedia	FD045	Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen	MilliporeSigma	F7879	Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner	Integra Biosciences	144000	Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge	MilliporeSigma	20469	Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle	Becton Dickinson	309580	Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment	World Precision Instruments	14011	Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-346-15FM	Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution	MilliporeSigma	M5550	Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution	MilliporeSigma	M7145	Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor	MSA	814365	Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach	MilliporeSigma	M2378	Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit	Harvard Apparatus	72-1413	Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System	Illumina	770-2016-025-N	Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-540-15FM	Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors	SunMed	2001-01	Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer	Marshall Scientific	CO-PC420	Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride	MilliporeSigma	P9541	Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape	VWR	470042-938	Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge	MilliporeSigma	QGARD00D2	Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles	ThermoFisher Scientific	06-423A	Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set	Braun Medical	471960	Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride	MilliporeSigma	S3014	Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load)	ZymoBIOMICS	D6320	Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes	Professional Disposables International	H04082	Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank	Airgas	AI USP200	Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank	Airgas	OX USP200	Compressed oxygen tank for input to sparging system.

References

Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , (2010).
Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), 8423 (2017).
Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 pwCF

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: