Conception et développement d’un modèle pour étudier l’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome des voies respiratoires de la fibrose kystique

L’objectif de ce protocole est de développer un système modèle pour l’effet de l’hyperoxie sur les communautés microbiennes des voies respiratoires de la fibrose kystique. Le milieu d’expectorations artificielles émule la composition des expectorations, et les conditions de culture hyperoxique modélisent les effets de l’oxygène supplémentaire sur les communautés microbiennes pulmonaires.

On pense que les communautés microbiennes des voies respiratoires jouent un rôle important dans la progression de la fibrose kystique (FK) et d’autres maladies pulmonaires chroniques. Les microbes ont traditionnellement été classés en fonction de leur capacité à utiliser ou à tolérer l’oxygène. L’oxygène supplémentaire est un traitement médical courant administré aux personnes atteintes de fibrose kystique (PWF); cependant, les études existantes sur l’oxygène et le microbiome des voies respiratoires se sont concentrées sur la façon dont l’hypoxie (faible teneur en oxygène) plutôt que l’hyperoxie (oxygène élevé) affecte les communautés microbiennes pulmonaires anaérobies principalement aérobies et facultatives. Pour combler cette lacune critique en matière de connaissances, ce protocole a été élaboré à l’aide d’un milieu d’expectorations artificielles qui imite la composition des expectorations du PWCF. L’utilisation de la stérilisation par filtre, qui donne un milieu transparent, permet des méthodes optiques pour suivre la croissance de microbes unicellulaires dans des cultures en suspension. Pour créer des conditions hyperoxiques, ce système modèle tire parti des techniques de culture anaérobie établies pour étudier les conditions hyperoxiques; au lieu d’éliminer l’oxygène, l’oxygène est ajouté aux cultures par barbotage quotidien de bouteilles de sérum avec un mélange d’oxygène comprimé et d’air. Les expectorations de 50 pwCF ont subi un éparpillement quotidien pendant une période de 72 heures pour vérifier la capacité de ce modèle à maintenir des conditions d’oxygène différentielles. Le séquençage métagénomique shotgun a été effectué sur des échantillons d’expectorations cultivées et non cultivées de 11 pwCF afin de vérifier la capacité de ce milieu à soutenir la croissance des microbes commensaux et pathogènes couramment présents dans les expectorations de la fibrose kystique. Des courbes de croissance ont été obtenues à partir de 112 isolats obtenus à partir de pwCF pour vérifier la capacité de ce milieu d’expectorations artificielles à soutenir la croissance d’agents pathogènes courants de la fibrose kystique. Nous constatons que ce modèle peut cultiver une grande variété d’agents pathogènes et de commensaux dans les expectorations de FK, récupère une communauté très similaire aux expectorations non cultivées dans des conditions normoxiques et crée différents phénotypes de culture dans des conditions d’oxygène variables. Cette nouvelle approche pourrait permettre de mieux comprendre les effets imprévus induits par l’utilisation de l’oxygène dans le PWCF sur les communautés microbiennes des voies respiratoires et les agents pathogènes respiratoires courants.

La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique caractérisée par une incapacité à éliminer le mucus épais des poumons, entraînant des infections répétées et un déclin progressif de la fonction pulmonaire qui entraîne souvent la nécessité d’une transplantation pulmonaire ou de la mort. Le microbiome des voies respiratoires des personnes atteintes de mucoviscidose (FCP) semble suivre l’activité de la maladie¹, avec une réduction de la diversité microbienne associée à des résultats indésirables à long terme^2,3. Dans les études cliniques de la PWF, l’oxygénothérapie supplémentaire a été associée à une maladie plus avancée^4,5, bien que traditionnellement, l’utilisation de l’oxygénothérapie ait été considérée comme un simple marqueur de la gravité de la maladie⁶. Des études récentes issues d’un essai clinique sur des patients atteints d’insuffisance respiratoire ont montré que des niveaux d’oxygène plus élevés sont paradoxalement associés à une augmentation des infections bactériennes graves et à une mortalité plus élevée^7,ce qui suggère que l’oxygène supplémentaire peut contribuer à la pathogenèse de la maladie. L’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome pulmonaire de la fibrose kystique et les communautés microbiennes pulmonaires et des voies respiratoires associées n’a pas été bien étudié.

Les études mécanistes ne peuvent souvent pas être effectuées directement sur des sujets humains en raison de difficultés logistiques et de problèmes éthiques potentiels associés à des interventions d’avantages ou de préjudices médicaux inconnus. Les approches translationnelles qui intègrent des échantillons biologiques humains dans des systèmes modèles peuvent offrir des informations biologiques importantes dans ces cas. Bien que la capacité d’utiliser ou de tolérer l’oxygène ait traditionnellement été un élément important de la classification microbienne, on sait peu de choses sur la façon dont l’introduction thérapeutique d’oxygène supplémentaire dans l’environnement pourrait perturber les communautés microbiennes des voies respiratoires. Pour faire la lumière sur les effets inconnus de l’oxygène supplémentaire sur les microbiomes des voies respiratoires du PWCF, nous devions relever deux défis majeurs; premièrement, la création d’un milieu de culture qui se rapproche physiologiquement de la composition des expectorations de la FK; deuxièmement, la création d’un système modèle qui permet le maintien de concentrations élevées d’oxygène en culture sur de longues périodes de temps.

Les milieux d’expectorations artificielles (ASM) sont largement utilisés pour émuler les expectorations pulmonaires ex vivo^8,9,10, mais il n’y a pas de consensus clair sur une recette spécifique. Ce protocole décrit une recette et une stratégie de préparation de milieu d’expectorations artificielles soigneusement conçues pour se rapprocher physiologiquement des expectorations de pwCF. Le tableau 1 présente les valeurs de recette choisies en fonction de la littérature publiée. Les composants chimiques de base et le pH ont été appariés aux valeurs identifiées par les études sur les expectorations humaines de FK^11,12,13. Des nutriments physiologiques à faible concentration ont été ajoutés à l’aide de jaune d’œuf, qui a été inclus comme 0,25% du volume final¹⁰, ainsi que des mélanges de vitamines et de métaux traces^14,15. La mucine, le composant clé des expectorations^16,a été incluse à 1% p/v^14. Bien que nécessitant plus de main-d’œuvre, la stérilisation par filtre a été choisie par rapport à la pratique plus conventionnelle de la stérilisation thermique pour réduire les problèmes potentiels liés à la dénaturation induite par la chaleur des composants essentiels des milieux¹⁰. Un avantage supplémentaire de la stérilisation par filtre est qu’elle génère des milieux transparents (la stérilisation thermique peut créer des milieux troubles en raison de la précipitation et de la coagulation des sels et des protéines), ce qui permet d’utiliser ces milieux d’expectorations artificiels pour suivre la croissance microbienne en fonction de l’augmentation de la turbidité.

Ce système modèle pour la culture hyperoxique est basé sur des techniques de culture anaérobie où l’oxygène est ajouté plutôt que retiré, créant un modèle pour l’effet de l’utilisation supplémentaire d’oxygène pour pwCF. La figure 1 et le protocole d’épargnance en oxygène qui y est associé décrivent les composants d’un système de lutte contre l’oxygène, qui peut être obtenu à faible coût auprès des fournisseurs généraux de laboratoires et d’hôpitaux. Ce système permet de mélanger de l’oxygène comprimé et de l’air à des concentrations fixes allant de 21% à 100% d’oxygène. L’intégration d’un capteur d’oxygène permet de vérifier la concentration du mélange de gaz de sortie, ainsi que de vérifier la composition du gaz sortant des bouteilles de sérum préalablement épargnées pour vérifier que les conditions d’oxygène ont été maintenues dans la plage souhaitée.

Ce protocole décrit les procédures pour créer un milieu d’expectorations artificielles, la construction et l’utilisation d’un système de stockage d’oxygène et l’application des deux pour cultiver des expectorations de FIBRO dans des conditions d’oxygène différentiel.

Cette étude a reçu l’approbation du Comité d’examen des établissements partenaires (Protocole no 2018P002934). Le critère d’inclusion comprenait les patients adultes atteints de fibrose kystique qui ont fourni un consentement éclairé écrit pour l’étude. Il n’y avait pas de critère d’exclusion. Selon les lignes directrices du protocole, tous les échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des patients atteints de fibrose kystique lors d’une visite ambulatoire programmée chez leur fournisseur de soins cliniques.

1. Préparation du milieu des expectorations artificielles

REMARQUE: Les quantités énumérées ici sont pour la production de 1 L de milieu final d’expectorations artificielles et supposent les réactifs spécifiques énumérés dans le tableau des matériaux. Les chiffres doivent être ajustés pour d’autres volumes ou pour l’utilisation de différents réactifs afin d’assurer le même produit final. Voir le tableau 1 pour les concentrations cibles.

1. Mélange chimique d’expectorations artificielles (ASCM)
   REMARQUE: ASCM représente 25% du volume moyen final. Il est stable à la conservation et peut être préparé en vrac ou à l’avance. S’il est préparé pour une utilisation ultérieure, autoclavez le mélange chimique et conservez-le en toute sécurité à température ambiante.
   1. Mélanger les solutions mères chimiques constitutives.
      1. Préparer 1 M de NaCl : Ajouter 58,44 g de NaCl par litre d’eau stérile.
      2. Préparer un bouillon de 1 M KCl : Ajouter 74,55 g de KCl par litre d’eau stérile.
      3. Préparer 1 M MgSO₄ bouillon: Ajouter 246,47 g de MgSO₄·7H₂O par litre d’eau stérile, ou 120,37 g de MgSO4 anhydre par litre d’eau stérile.
      4. Préparer 1 M de glucose : Ajouter 180,16 g de glucose par litre d’eau stérile.
   2. Stérilisez en autoclave les solutions mères chimiques, ainsi qu’une bouteille vide de 250 ml. Effectuez les étapes d’autoclavage à des valeurs standard d’au moins 121 °C et 15 PSI pendant 30 min.
   3. Ajouter 80,59 mL d’eau stérile à la bouteille vide de 250 ml.
   4. Ajouter 152,30 mL de 1 M de naCl au mélange.
   5. Ajouter 15,8 mL de 1 M de KCl au mélange.
   6. Ajouter 610 μL de 1 M MgSO₄ au mélange.
   7. Ajouter 700 μL de 1 M de glucose au mélange.
2. Mélange artificiel de mucine d’expectorations (ASMM)
   REMARQUE: ASMM représente 50% du volume moyen final. Assurez-vous qu’il est préparé le même jour que le lot moyen final.
   1. Ajouter 450 mL d’eau stérile dans une bouteille vide de 1 L.
   2. Ajouter 50 mL de 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) au flacon.
   3. Ajoutez une barre d’agitation magnétique jetable à la bouteille.
   4. Autoclavez la bouteille contenant du PBS et la barre de remuage.
   5. Mesurez 10 g de poudre de mucine et ajoutez-la au PBS.
   6. Agiter vigoureusement la bouteille pour le mélange préliminaire.
   7. Placez la bouteille sur une plaque chauffante avec un agitateur magnétique. Réglez la chaleur à moyen-haut en ciblant 50 °C et la vitesse d’agitation à 1100 tr/min. Augmentez progressivement la vitesse afin que la barre ne s’envole pas de l’aimant.
      1. Laisser chauffer et remuer pendant 15 min.
      2. Ramassez la bouteille avec des gants résistants à la chaleur. Observez pour vérifier si la poudre de mucine se dépose hors de la solution.
      3. Si la poudre de mucine n’est pas complètement dissoute, remettre la bouteille à chauffer/agiter pendant des intervalles de 5 minutes jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
   8. Laissez le mélange de mucine refroidir à la température ambiante.
3. Mélange biologique d’expectorations artificielles (ASBM)
   REMARQUE: ASBM représente 25% du volume moyen final. Préparez-le le même jour que le lot moyen final et, contrairement aux autres mélanges, n’exposez pas ses composants à la chaleur.
   1. Décongeler le stock de vitamines 100x dans un réfrigérateur à 4 °C ou sur de la glace.
      REMARQUE: Pré-portionnez le stock de vitamines dans des aliquotes de 10 mL pour minimiser le nombre de cycles de congélation / dégel.
   2. Ajouter 124,24 mL d’eau stérile à la bouteille de 250 mL autoclavée vide.
   3. Ajouter 25,76 mL de 50x stock d’acides aminés essentiels au mélange.
   4. Ajouter 80,14 mL de 100x stock d’acides aminés non essentiels au mélange.
   5. Ajouter 10 mL de 100x de vitamines (décongelées) au mélange.
   6. Ajouter 1 mL de stock de métaux traces 1000x au mélange.
   7. Ajouter 8,33 mL d’émulsion de jaune d’œuf à 30 % au mélange.
   8. Ajouter 400 μL de 10 g/L de ferritine au mélange.
   9. Mélangez bien la solution en agitant manuellement.
4. Milieu d’expectorations artificielles (ASM)
   1. Ajouter 250 mL d’ASCM à la bouteille de 1 L contenant de l’ASMM.
   2. Ajouter 250 mL d’ASBM à la bouteille moyenne.
   3. Titrer le support avec un tampon MOPS de base (1 M) pour atteindre un pH de 6,3 sur un papier à pH à plage étroite. Avant le titrage, le mélange moyen sera trop acide.
   4. Réfrigérer les expectorations artificielles résultantes à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être filtrées.
   5. Pour démarrer le processus de filtration, transférez 200 mL de milieu d’expectorations artificielles non filtrées à un système de filtration sous vide avec un filtre de taille de pores de 0,22 μm.
   6. Connectez le système de filtration à la pompe à vide, allumez la pompe à vide, réglez-la à 70 mbar, puis placez la chambre sur un agitateur orbital qui secoue à 90 tr/min dans une chambre froide à 4 °C.
      1. Complétez avec 150 mL supplémentaires du milieu car une quantité appréciable est filtrée. Il faut 1-2 jours pour filtrer complètement 1 L de milieu.
      2. Répétez l’opération avec des chambres supplémentaires jusqu’à ce que tous les supports soient filtrés.
         REMARQUE: Essayez de ne pas filtrer plus de 350 mL du milieu à travers le même filtre de 0,22 μm, car la mucine bouchera le filtre au fil du temps.
   7. Réfrigérer les expectorations artificielles filtrées à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Utilisez ASM dans le mois suivant la préparation pour de meilleurs résultats.

2. Épargne d’oxygène

1. Configuration de la station de combat
   REMARQUE: Ce protocole ne devrait avoir besoin d’être effectué en entier qu’une seule fois, après quoi la configuration peut être maintenue par une simple maintenance si nécessaire. Voir la figure 1 pour un schéma visuel du système de stockage d’oxygène.
   1. Obtenez et sécurisez correctement les réservoirs d’air comprimé et d’oxygène.
      ATTENTION: La haute pression rend les réservoirs extrêmement dangereux lorsqu’ils sont mal manipulés. Assurez-vous que les réservoirs sont complètement scellés et sécurisés, qu’il n’y a pas de fuites lorsque le réservoir est fermé et que tout le personnel de manutention est entièrement formé à leur utilisation.
   2. Fixez un régulateur d’air au réservoir d’air comprimé à l’aide d’une clé. Pour une lecture optimale du débit sur le régulateur, fixez le régulateur aussi près que possible d’une position verticale.
   3. Fixez un régulateur d’oxygène au réservoir d’oxygène comprimé, en le fixant le plus près possible d’une position verticale. Selon le réservoir d’oxygène, il peut être nécessaire d’inverser la direction pour serrer.
   4. Connectez le tube des régulateurs à un connecteur en Y pour combiner le flux de gaz des deux réservoirs.
   5. Connectez la sortie du connecteur en Y à la vanne centrale de jonction en T.
   6. Connectez un côté de la vanne centrale à jonction en T à un manomètre à gaz.
   7. Connectez l’autre côté du manomètre à gaz à un filtre à seringue stérile de 25 mm de diamètre avec une taille de pore de 0,22 μm.
   8. Fixez un deuxième filtre à seringue de 25 mm de diamètre à une seringue sans piston à utiliser comme dégagement de gaz pendant le combat.
   9. Connectez le dernier côté de la vanne centrale à jonction en T à une deuxième vanne à jonction en T pour le moniteur d’oxygène.
   10. Connectez un filtre à seringue de 25 mm de diamètre à un côté de cette deuxième valve à jonction en T, ainsi qu’un tube pour fixer des aiguilles de 18 G.
   11. Connectez le dernier côté de la deuxième vanne de jonction en T à l’appareil de surveillance de l’oxygène.
   12. Connectez un tube de coupure de l’autre côté de l’appareil de surveillance de l’oxygène à utiliser comme libération de gaz pendant la surveillance.
       ATTENTION : Lorsque vous testez ou utilisez le système d’échantillonnage de l’oxygène, prenez bonne note de la position des jonctions en T et assurez-vous qu’elle correspond au chemin prévu dans le système. Si vous ne le faites pas, la pression s’accumulera à l’intérieur du système et entraînera la défaillance et le démontage des composants.
   13. Pour la maintenance du système et pour qu’il continue à fonctionner à des performances optimales, les pratiques suivantes sont bénéfiques.
       1. Renforcez les connexions avec des quantités généreuses de ruban de téflon pour améliorer considérablement leur étanchéité et réduire le risque que les composants se détachent de la pression interne.
       2. Maintenir le débit combiné sous 10 L/min pour atténuer la pression maximale et éviter les défaillances.
       3. Si une fuite est suspectée, utilisez une solution détergente telle que des détecteurs de fuite de liquide disponibles dans le commerce pour identifier facilement son emplacement, car il bouillonnera au-dessus de toute fuite de gaz. Colmatez les fuites à l’aide d’un ruban de polytétrafluoroéthylène (p. ex. téflon).
       4. Remplacez les filtres à seringue de 25 mm de diamètre dans le système d’épandage d’oxygène toutes les deux semaines, mais cela varie en fonction de la fréquence d’utilisation. Au fil du temps, les particules coincées dans le filtre réduisent le débit de gaz et provoquent des accumulations de pression.
       5. Étalonnez le moniteur d’oxygène à 21% d’oxygène d’air comprimé avant d’effectuer des mesures.
       6. Une fois l’utilisation du système terminée, éteignez les réservoirs et purgez l’excès de gaz des régulateurs jusqu’à ce que le débit s’arrête complètement.
2. Sécrétisme de culture en flacon
   1. Étiqueter les flacons de sérum autoclavés de 500 mL avec les identificateurs d’échantillon, la date et l’heure de l’inoculation et le pourcentage d’oxygène cible.
   2. Dans une hotte biologique, ajouter 24 mL de milieu d’expectorations artificielles à chaque flacon de sérum mis en place.
   3. Ajouter 1 mL d’expectorations du patient homogénéisées avec une aiguille de 18 G (diluée avec une solution saline stérile si nécessaire pour obtenir un volume suffisant d’échantillon pour chaque condition de culture) à chaque flacon de sérum.
   4. À l’aide d’une pince à épiler stérile, placez les bouchons en caoutchouc autoclavés sur le dessus de chaque flacon de sérum.
   5. Appuyez sur les bouchons en caoutchouc, veillez à ne pas toucher le dessous du bouchon avec les mains.
   6. Retirez les bouteilles de la hotte, appliquez et sertissez les joints en aluminium. Retirez la pièce maîtresse des joints.
   7. Essuyez le dessus des bouteilles avec une lingette à l’alcool et passez-les à travers une flamme de brûleur Bunsen.
   8. Fixez une aiguille stérile de 18 G à une seringue sans piston avec un filtre. Insérez d’abord ce dégagement de gaz dans la bouteille.
   9. Fixez une aiguille stérile de 18 G à la sortie de gaz du système et insérez également l’aiguille de sortie de gaz dans la bouteille.
   10. Acheminez les jonctions en T des réservoirs à travers le moniteur d’oxygène. Vérifiez que la concentration cible d’oxygène circule dans le système. Ciblez environ 5 L/min de débit de gaz.
   11. Redirigez les jonctions en T des réservoirs jusqu’à la sortie de gaz. Le gaz commence à circuler à travers le flacon de sérum.
       ATTENTION : Portez une attention particulière au manomètre pendant le stockage de l’oxygène. Si la pression augmente de manière inattendue, éteignez immédiatement le système.
   12. Faites couler l’oxygène dans le flacon de sérum pendant 1 min. À 5 L/min, cela permet 10 échanges d’air et garantit que l’atmosphère interne atteint la pression partielle souhaitée.
   13. Retirez l’aiguille de dégagement de gaz 18-G.
   14. Laissez la pression dans le flacon de sérum s’accumuler jusqu’à +1 atmosphère (2 atmosphères au niveau de la mer), puis retirez immédiatement l’aiguille de sortie de gaz.
       REMARQUE: Le maintien de la pression favorise la rétention des conditions hyperoxiques au fil du temps.
   15. Placez le flacon de sérum dans un agitateur d’incubateur à 37 °C à 150 tr/min. Incuber les échantillons pendant trois intervalles de 24 heures. À chaque intervalle de 24 heures, prélever une aliquote pour l’analyse en aval, rééposer les échantillons et les remettre en incubation pendant une durée totale d’incubation de 72 h.
3. Mesure de l’oxygène sortant
   1. Étalonnez le compteur d’oxygène à 21 % d’air comprimé, puis éteignez le réservoir.
   2. Acheminez la prise de sérum à travers le moniteur d’oxygène et fixez une aiguille stérile à la fin.
   3. Insérez l’aiguille à travers le bouchon en caoutchouc dans le flacon de sérum.
   4. Attendez que la lecture du débit sortant se stabilise. Un faible débit hors des bouteilles de sérum signifie que cela peut prendre jusqu’à 2 minutes. Signalez la différence maximale par rapport à l’air ambiant (nombre le plus éloigné de 21 %).
   5. Si vous effectuez plusieurs lectures, rincez le système avec de l’air comprimé entre les lectures.

Ces protocoles ont été appliqués à 50 échantillons d’expectorations expectorées provenant de pwCF présentant des soins de routine à une clinique ambulatoire de fibrose kystique au Massachusetts General Hospital à Boston, Massachusetts. Les expectorations de chaque patient ont été cultivées dans des conditions d’oxygène de 21%, 50% et 100% en utilisant le milieu d’expectorations artificielles, avec des aliquotes de 0,5 mL prélevées sur chaque culture à 24 h, 48 h et 72 h de temps de culture pour les tests. Les cultures ont été photographiées lorsque des extractions ont été effectuées pour suivre les changements visuels. De plus, une aliquote de 0,5 mL de chaque échantillon primaire d’expectorations a été prélevée avant la culture. Il en a résulté 10 échantillons discrets par patient et un N final de 500 échantillons. Parmi ceux-ci, les expectorations de 11 patients (11 sputa non cultivées, 11 sputa cultivées à partir de 21% d’oxygène à 48 h d’incubation) ont subi une extraction d’acide nucléique¹⁷, des bibliothèques de séquençage ont été générées à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque d’ADN commercial, et le séquençage métagénomique a été effectué sur une plate-forme de séquençage du génome entier ciblant ~ 5 Go de séquence par échantillon avec 150 paires de bases, lectures à extrémité appariée. Les lectures brutes ont été traitées à l’aide de la suite d’outils bioBakery¹⁸, qui comprend le contrôle de la qualité et l’élimination des séquences de « contaminants » humains et le profilage taxonomique avec le profileur MetaPhlAn3¹⁹. Au moment de l’extraction des acides nucléiques, 10 millions de cellules d’Imtechella halotolerans,une espèce halotolérante que l’on trouve normalement dans les écosystèmes estuaires et non dans les communautés microbiennes humaines, ont été piquées dans chaque échantillon, permettant la quantification de la charge microbienne absolue pour chaque échantillon^20.

La figure 2 montre les mesures individuelles et moyennes de l’écoulement de l’oxygène et les niveaux de pH au cours du processus de culture pour 50 échantillons d’expectorations cultivés dans chaque condition d’oxygène et un exemple de phénotype de culture différentielle visuelle. Les cultures ont été maintenues à 37 °C, sauf pendant de brèves périodes où le rabattement et le retrait des aliquotes d’échantillon ont été effectués. Avec des intervalles de 12 h et 24 h, des concentrations élevées d’oxygène ont été maintenues, bien qu’une baisse au fil du temps ait été observée pour les trois conditions d’oxygène, avec 100% d’oxygène tombant à environ 85%, 50% d’oxygène tombant à 40% et 21% d’oxygène tombant à 18%. Les conditions d’oxygène sont restées distinctes et, surtout, des concentrations élevées d’oxygène ont été maintenues tout au long du processus pour les échantillons hyperoxiques. Les mesures de pH ont montré un plus grand degré de variabilité, mais sont restées bien dans une plage physiologiquement normale sans changements statistiquement significatifs au fil du temps. Ces mesures indiquent que ces méthodes maintiennent des conditions d’oxygène différentielles discrètes tout au long du processus de culture. Enfin, un exemple de l’un des nombreux phénotypes de culture visuelle qui se différencient en fonction de la concentration en oxygène est montré. Cet échantillon présentait des différences de turbidité marquées après 72 heures de culture, avec un oxygène plus élevé associé à une turbidité visuelle plus faible. Les phénotypes de culture différentielle soutiennent la présence d’effets induits par l’hyperoxie sur les communautés de culture.

La figure 3 compare la charge microbienne, la diversité microbienne et la composition de la communauté microbienne entre les expectorations non cultivées et les expectorations cultivées (21 % d’oxygène pendant une période de 48 h). Les mesures révèlent que la seule différence majeure introduite par l’acte de culture est une augmentation d’environ 20 fois de la charge microbienne par rapport aux expectorations non cultivées. Le système immunitaire et les mécanismes mécaniques typiques de clairance des expectorations tels que la toux servent normalement de processus de régulation limitant la charge microbienne dans les poumons, même en cas de dysfonctionnement et d’infection comme ceux observés dans pwCF. La culture ex vivo n’a pas de tels mécanismes de régulation, et les communautés microbiennes sont plutôt libres de procéder à la saturation cellulaire. Les mesures de la diversité alpha et bêta indiquent que malgré cette différence de charge microbienne, la composition de la communauté sous-jacente reste bien préservée, avec des différences globales minimales introduites par le processus de culture.

La figure 4 développe la comparaison entre les échantillons d’expectorations non cultivées et cultivées, en examinant la présence / absence binaire des 120 espèces microbiennes identifiées de manière concluante par séquençage métagénomique au fusil de chasse à partir d’expectorations cultivées et non cultivées obtenues chez 11 patients. Les microbes sont regroupés en fonction des similitudes phylogénétiques. 46 (38,3 %) de ces espèces ont été identifiées dans des échantillons non cultivés et cultivés (couleur cyan), tandis que 35 (29,2 %) ont été identifiées exclusivement dans des échantillons non cultivés (jaune) et 39 (32,5 %) ont été exclusivement identifiées dans des échantillons cultivés (bleu). Il est probable qu’il y ait une plus grande parité que ce que nous avons identifié en utilisant le séquençage en termes de ce qui est présent et de ce qui est absent, mais certains taxons tombent en dessous du seuil de détection du séquençage dans certains cas. Les différences indiquent que le processus de culture introduit un certain biais dans les expectorations cultivées par rapport aux expectorations non cultivées. Plus particulièrement, la culture augmente la présence de champignons tels que Candida et Aspergillus, ainsi que de membres d’Enterobacterales, notamment escherichia, Serratiaet Streptococcus. Inversement, des membres de Bacteroidetes tels que Prevotella et Clostridiales, qui sont des anaérobies, étaient présents dans des échantillons non cultivés mais pas présents dans des échantillons cultivés. Cela peut être attribué à l’absence d’une condition anaérobie dans notre modèle expérimental.

La figure 5 montre les courbes de croissance basées sur l’absorbance des agents pathogènes pulmonaires courants de la FK isolés à partir d’expectorations obtenues à partir de 50 PWCF différents. Ces isolats représentent des isolats cliniques phénotypiquement différents obtenus à l’aide de procédures de culture d’enrichissement du laboratoire de microbiologie clinique du Massachusetts General Hospital, et comprennent Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) et Achromobacter sp (N = 7). Les courbes de croissance ont été obtenues en cultivant chaque isolat dans des milieux d’expectorations artificielles à 37 °C dans l’obscurité, l’ASM sans inoculation bactérienne servant de témoin négatif. La qualité transparente de l’ASM (qui est due au filtre plutôt qu’à la stérilisation thermique) permet de réaliser des mesures optiques pour estimer les courbes de croissance. Des lectures optiques à 600 nm (OD600) ont été prises toutes les 10 minutes et les 24 premières heures de chaque courbe sont affichées. L’absence de changements dans les lectures optiques dans le témoin négatif ASM uniquement indique que les cultures sont exemptes de contamination. Les courbes démonstratives présentées ici suivent des modèles typiques de courbes de croissance indiquant la viabilité de cette recette ASM en tant que support pour la génération de courbes de croissance basée sur l’absorbance.

Tableau 1 : Recette de milieu d’expectorations artificielles tirée d’une revue de la littérature. (Colonne 1) Réactifs et valeurs clés dans la formulation d’expectorations artificielles. (Colonnes 2-7) Comparaison des recettes de la littérature existante^{8,9,10,12,14,15}. (Colonnes 8-9) Recette de milieu d’expectorations artificielles détaillées dans ce protocole et les sources correspondantes qui ont éclairé chaque valeur sélectionnée^10,11,12^,13,14,15.

Tableau 2 : Concentrations d’acides aminés précédemment décrites dans les expectorations de la fibrose kystique et dans la recette des expectorations artificielles détaillées dans le présent protocole. (Colonne 1) Acides aminés clés. (Colonne 2) Concentrations d’acides aminés d’expectorations de personnes atteintes de mucoviscidose¹². (Colonne 3) Concentrations d’acides aminés dans les expectorations artificielles détaillées dans ce protocole

Figure 1: Schéma de connexion des composants du système de stockage d’oxygène. Organigramme des connexions entre les composants du système utilisé pour éparpiller les bouteilles de sérum aux concentrations d’oxygène souhaitées entre 21% et 100%. Le système dispose de 3 modes d’utilisation déterminés par la position des deux vannes de jonction en T. Le système peut acheminer le gaz des réservoirs à travers la sortie de gaz ou à travers le moniteur de pourcentage d’oxygène, ainsi que le gaz sortant des bouteilles de sérum précédemment épargnées à travers le moniteur pour vérifier la concentration après le temps écoulé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Les concentrations cibles d’oxygène sont approximativement maintenues avec des intervalles de 12 h et 24 h, et le pH reste dans la plage physiologique pendant la culture. (A) Lectures d’oxygène sortant à partir d’intervalles de stockage d’oxygène de 12 h et 24 h sur une période de 72 h. (B) Lectures de pH pour les échantillons mesurés toutes les 24 h. (C) Exemple d’image de l’échantillon cultivé CFB010 après 72 h, montrant une turbidité différentielle entre les concentrations d’oxygène. La couleur indique le pourcentage d’oxygène cible; les barres d’erreur indiquent des intervalles de confiance de 95 %. Les seuils critiques sont soulignés par des lignes pointillées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: La culture augmente la charge microbienne, mais la composition sous-jacente de la communauté est préservée. Expectorations non cultivées (jaunes) et expectorations cultivées (bleues) utilisant un milieu d’expectorations artificielles à 21% d’oxygène pendant 48 h. Les aliquotes ont subi une extraction d’acide nucléique et un séquençage métagénomique au fusil de chasse pour détecter les biais possibles introduits par les conditions de culture. (A) Charge microbienne absolue (déterminée par des contrôles de pointe) et mesures de la diversité alpha. En utilisant des modèles linéaires à effets mixtes, les expectorations non cultivées par rapport aux expectorations cultivées prédisaient la charge microbienne, mais pas la diversité alpha. (B) Ordination des deux premières composantes des mesures de la diversité bêta, en contrôlant la différence de charge microbienne. Aucune différence significative dans l’une ou l’autre métrique après PERMANOVA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: La majorité des taxons identifiés sont présents à la fois dans les expectorations sources et dans la culture, tandis que d’autres n’apparaissent que dans les expectorations ou la culture sources. Séquençage de la métagénomique au fusil de chasse utilisé pour comparer les différences de composition de la communauté microbienne entre les échantillons d’expectorations non cultivés et cultivés. Arbre phylogénétique de toutes les espèces microbiennes identifiées dans des échantillons séquencés (N = 120). Les espèces marquées de jaune (N = 35, 29,2 %) n’ont été observées que dans des échantillons d’expectorations non cultivés. Les espèces marquées en bleu (N = 39, 32,5 %) n’ont été observées que dans des échantillons de culture de milieu d’expectorations artificielles. Des espèces marquées au cyan (N = 46, 38,3 %) ont été observées dans des échantillons non cultivés et cultivés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Le milieu d’expectorations artificielles est suffisamment transparent pour être utilisé comme milieu de courbe de croissance pour la culture d’isolats cliniques. Des lectures de densité optimales à 600 nm ont été prises toutes les 10 minutes et les 24 premières heures de chaque courbe sont affichées. Les lignes grises représentent les lectures individuelles et les lignes orange représentent l’absorbance moyenne pour chaque taxon. Blanc de milieu d’expectorations artificielles inclus comme témoin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans cette étude, un modèle in vitro a été développé pour étudier l’effet de l’hyperoxie sur les communautés microbiennes pulmonaires. Ce modèle, basé sur des expectorations artificielles et le stockage quotidien de flacons de sérum, maintient des concentrations élevées d’oxygène et favorise la croissance des microbes identifiés dans les expectorations du PWCF.

Cette approche comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est le choix d’utiliser la stérilisation par filtre plutôt que la stérilisation thermique du milieu d’expectorations artificielles. La stérilisation par filtre empêche la dénaturation de la mucine et d’autres composants sensibles à la chaleur du milieu et donne un milieu clair qui peut être utilisé pour les mesures optiques de la croissance microbienne. Bien que la stérilisation par filtre ait été proposée dans d’autres protocoles¹⁰, nous avons constaté que l’ajout d’agitation orbitale pendant le processus de filtration était essentiel pour éviter le colmatage du filtre qui se produisait autrement lorsqu’une quantité minimale du milieu préparé avait été filtrée. Alors que le milieu d’expectorations artificielles filtrées peut avoir une concentration finale de mucine inférieure à celle prévue en raison de l’impaction de la mucine dans le filtre, il a été démontré que les expectorations du PWCF ont des concentrations de mucine plus faibles que les expectorations des personnes sans fibrose kystique²¹. La concentration initiale de mucine de 1 % utilisée dans ce protocole est plus élevée que dans d’autres approches qui ont utilisé la stérilisation par filtre, avec un groupe utilisant une concentration initiale de mucine de 0,5 %¹⁰, tandis que les recettes typiques utilisent des concentrations de mucine allant de 0,5 % à 2 % (tableau 1). Ainsi, même avec une perte de mucine dans le processus de stérilisation par filtre, le milieu final préparé à l’aide de ce protocole est susceptible d’avoir des concentrations de mucine dans la gamme physiologique²².

La seconde est la composition du milieu d’expectorations artificielles. La recette du milieu d’expectorations artificielles a été choisie sur la base d’études physiologiques existantes sur les expectorations de pwCF (Tableau 1). En utilisant le séquençage de la métagénomique au fusil de chasse, nous avons pu vérifier que les expectorations cultivées avec ce milieu d’expectorations artificielles récapitulent largement la composition de la communauté microbienne des expectorations non cultivées(Figure 3). Dans des conditions normoxiques, ce milieu a également soutenu la croissance de 112 isolats cliniques différents représentant des agents pathogènes courants isolés des expectorations des patients atteints de mucoviscidose. Ainsi, ces données démontrent que cette formulation de milieu d’expectorations artificielles soutient la croissance du microbiote des voies respiratoires à partir de pwCF. L’ADN des spermatozoïdes de saumon, un ajout courant aux recettes existantes(tableau 1),a été omis. Une application prévue de ce modèle est le séquençage métagénomique, et donc l’ADN des spermatozoïdes de saumon n’a pas été inclus afin de réduire l’ajout d’acides nucléiques non microbiens car ces lectures seraient filtrées après le séquençage, diminuant ainsi notre profondeur de séquençage efficace. Alors que les expectorations de pwCF ont des concentrations élevées d’ADN extracellulaire²³, une proportion importante de celui-ci est d’origine microbienne²⁴, et il n’est pas clair si l’ajout d’ADN de spermatozoïde de saumon au milieu d’expectorations artificielles le rend plus physiologique ou si l’approche de culture décrite dans ce protocole conduit à des niveaux élevés d’ADN extracellulaire dérivé de microbes; nous n’avons pas fait de distinction entre les concentrations d’ADN extra- et intra-cellulaire dans nos études. De futures études pourraient vouloir vérifier la concentration d’ADN extracellulaire générée par cette méthode de culture.

Troisièmement, à notre connaissance, aucune étude publiée sur les communautés microbiennes pulmonaires de la fibrose kystique n’a abordé les conditions hyperoxiques. Ce modèle utilise de l’équipement peu coûteux et couramment disponible auprès de fournisseurs de laboratoires généraux ou d’hôpitaux pour construire un système d’épargne en oxygène. Les considérations importantes pour le maintien des conditions hyperoxiques comprennent le volume du milieu de culture par rapport à l’espace de tête disponible dans les flacons de sérum. Lors des premières tentatives d’élaboration du protocole, des flacons de sérum de 125 mL ont été utilisés. Cependant, l’utilisation de flacons de sérum de 500 mL (permettant un rapport de culture de 475 mL d’espace de tête à 25 mL) a permis de maintenir la concentration souhaitée jusqu’à 24 h, réduisant ainsi la fréquence de l’épandage d’oxygène. Cette approche génère des conditions d’oxygène discrètes, permettant ainsi la culture simultanée de différents échantillons de patients dans plusieurs conditions d’oxygène. D’autres outils issus de la culture anaérobie peuvent être utilisés pour la culture hyperoxique, y compris l’utilisation de pots anaérobies ou de tubes de type Balch économes en oxygène. Les analyses des communautés microbiennes pulmonaires utilisant le séquençage métagénomique indiquent que la diversité alpha et bêta globale est comparable entre les expectorations cultivées et non cultivées. Lors de l’évaluation de l’abondance différentielle au niveau de l’espèce, la culture à 21% d’oxygène, enrichi pour la croissance des aérobies et des anaérobies facultatifs, y compris Enterobacterale, Streptococcus et les champignons. Cela est probablement dû à l’exclusion d’une condition anaérobie qui a été observée dans les voies respiratoires de pwCF^25,26. Des études futures pourraient envisager l’inclusion de l’azote gazeux dans ce modèle pour étudier une gamme de conditions anoxiques et oxiques et le microbiote aérobie et anaérobie correspondant trouvé dans les communautés microbiennes des voies respiratoires.

Les principes clés énoncés dans ces protocoles peuvent être instructifs pour la conduite d’études similaires liées à l’influence de l’oxygène sur les communautés microbiennes complexes ou les agents pathogènes pulmonaires courants. L’oxygène est le traitement le plus couramment utilisé dans le traitement de toutes les maladies pulmonaires avancées, et une meilleure compréhension de la façon dont il pourrait entraîner des effets collatéraux imprévus sur les communautés microbiennes des voies respiratoires et les agents pathogènes respiratoires courants sera importante pour le traitement de la FPW et d’autres maladies pulmonaires chroniques.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Une partie de ce travail a été réalisée au Laboratoire de biologie marine avec le soutien du Laboratoire de biologie marine, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (numéro de subvention 5600373), et un don de la Fondation Simons.