Preklinik Bir Baş Ağrısı Modeli Olarak Farelerde Dural Stimülasyon ve Periorbital von Frey Testi

Migrenin en önemli belirtisi şiddetli baş ağrısıdır ve bunun meninksleri innerve eden duyusal nöronlar tarafından aracılık ettiği varsayılmaktadır. Burada, yüz aşırı duyarlılığını bir çıktı olarak kullanırken, maddeleri duraya minimal invaziv bir şekilde lokal olarak uygulamak için bir yöntem sunuyoruz.

Dura mater, araknoid ve pia mater'den oluşan kraniyal meninkslerin öncelikle sinir sistemi için yapısal fonksiyonlara hizmet ettiği düşünülmektedir. Örneğin, beyni kafatasından korurlar ve korteksin vasküler ve nöronal beslemesini demirlerler / düzenlerler. Bununla birlikte, meninksler, migren sırasında yaşanan ağrının lokal steril inflamasyona ve ardından lokal nosiseptif afferentlerin aktivasyonuna atfedildiği migren gibi sinir sistemi bozukluklarında da rol oynar. Meninkslerdeki tabakalardan dura mater, migrenlerin patofizyolojisinde özellikle ilgi çekicidir. Yüksek oranda vaskülarize olur, lokal nosiseptif nöronları barındırır ve bağışıklık hücreleri gibi çeşitli yerleşik hücrelere ev sahipliği yapar. Lokal meningeal mikroortamdaki ince değişiklikler, dural perivasküler nosiseptörlerin aktivasyonuna ve sensitizasyonuna yol açarak migren ağrısına yol açabilir. Çalışmalar, dural afferentlerin in vivo elektrofizyoloji, görüntüleme teknikleri veya davranışsal modeller kullanılarak nasıl aktive edildiğini / hassaslaştığını ele almaya çalışmıştır, ancak bunlar genellikle çok invaziv ameliyatlar gerektirir. Bu protokol, farelerde dura mater üzerindeki bileşiklerin nispeten invaziv olmayan bir şekilde uygulanması için bir yöntem ve dural stimülasyonu takiben periorbital von Frey testini kullanarak baş ağrısı benzeri dokunsal duyarlılığı ölçmek için uygun bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, dura ve kafatasının bütünlüğünü korur ve kaynaşmamış sagital ve lambdoid sütürlerin birleşme noktasında 0.65 mm'lik modifiye edilmiş bir kanül yoluyla maddeler enjekte ederek invaziv tekniklerden kaynaklanan kafa karıştırıcı etkileri azaltır. Bu klinik öncesi model, araştırmacıların çok çeşitli dural uyaranları ve nosiseptör aktivasyonu, bağışıklık hücresi aktivasyonu, vasküler değişiklikler ve ağrı davranışları gibi migrenin patolojik ilerlemesindeki rollerini araştırmalarına izin verirken, kafatası ve meninkslere yaralanmayan koşulları koruyarak izin verecektir.

Migren ağrısı dünya çapında önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. Dünya Sağlık Örgütü, onu dünyadaki en yaygın altıncı hastalık olarak sıralamakta, Dünya nüfusunun% 15'inden biraz daha azını etkilemektedir¹ ve toplum üzerinde önemli bir sosyoekonomik yüke neden olmaktadır ^2,3. Tedavi seçenekleri ve etkinlikleri yetersiz kalmıştır ve sadece semptomatik rahatlama sağlar ve migren oluşumunun altında yatan patofizyolojik olayları önemli ölçüde değiştirmez ^4,5. Tedavi başarısının olmaması, migrenin patolojisi tam olarak anlaşılamayan ve sınırlı sayıda terapötik hedefe yol açan çok faktörlü bir bozukluk olmasından kaynaklanmaktadır. Migren, hayvan modellerinde tam olarak yakalanması da zordur, özellikle migren tanısının, aura, baş ağrısı, fotofobi ve allodinya gibi migren ayırt edici özellikleri ile deneyimlerini tanımlayan hastalarla sözlü iletişime dayanarak yapıldığı göz önüne alındığında. Bununla birlikte, migren tedavilerindeki son gelişmelerin şu anda klinik öncesi modeller tarafından iyi doğrulanmış birçok nörolojik durum için tedavilerden daha iyi performans gösterdiğini belirtmek önemlidir. Örneğin, kalsitonin geni ile ilişkili peptidi veya reseptörünü hedef alan monoklonal antikorlar ve küçük moleküller, migren hastalarının yaşam kalitesini iyileştirmede çok başarılı olmuştur ve migrenin klinik yönetimini potansiyel olarak dönüştürebilir. Bu bozukluğu anlamada ilerleme kaydedilmiş olsa da, henüz açıklığa kavuşturulması gereken çok şey olmaya devam ediyor.

Preklinik hayvan modellerine ve insan çalışmalarına dayanarak, migren baş ağrılarının, trigeminal ve üst servikal dorsal kök ganglionları 6,7,8,9,10 yoluyla sinyal veren meninkslerdeki nosiseptif liflerin anormal aktivasyonu ile başlatıldığı yaygın olarak kabul edilmektedir. Bu teoriye rağmen, birçok çalışma hala migrende altta yatan katkıda bulunan mekanizmaları anlamak için sistemik ilaç uygulamasını kullanmaktadır. İlaçların sistemik dozlanması anlayışımızı önemli ölçüde güçlendirmiş olsa da, bu bulgular hedef doku içindeki lokal eylemlerin migrende rol oynayıp oynamadığını doğrudan değerlendirmemektedir. Tersine, birkaç çalışma durayı uyarmak için bir yaklaşım benimsemiştir; Bununla birlikte, bu deneyler invaziv bir kraniyotomi yoluyla kanül implantasyonu ve uzatılmış iyileşme süreleri^11,12 gerektirir. Bu sınırlamalar nedeniyle, kraniyotomi eksikliğinin cerrahi sonrası iyileşmeyi ortadan kaldırdığı ve uyanık hayvanlarda derhal test edilmesine izin verdiği durayı lokal olarak uyarmak için minimal invaziv bir yaklaşım geliştirdik^12,13,14. Bu enjeksiyonlar hafif izofluran anestezisi altında gerçekleştirilir ve farelerde sagital ve lambdoid sütürlerin birleşme noktasında uygulanır.

Kemirgenlerde nosiseptif davranışsal yanıtları değerlendirmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir¹⁵. Kutanöz allodinya, migren hastalarının yaklaşık% 80'inde^16,17 bildirilmiştir ve kemirgenlerde kullanım için potansiyel bir translasyonel son noktayı temsil etmektedir. Preklinik modellerde, von Frey filamentlerinin kemirgen pençesinin plantar bölgesine uygulanması, klinik öncesi migren modellerinde ağrı davranışlarını değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu yaklaşımın birincil sınırlaması, sefalik bölgeyi test etmemesidir. Yüz buruşma skorlaması, ağrı uyaranlarının indüklenmesinden sonra yüz ifadelerini analiz ederek kemirgenlerde ağrı davranışlarını yakalamak için kullanılmıştır^18,19. Bununla birlikte, sınırlamaları sadece akut uyaranlara verilen yanıtları yakalamayı ve kronik orofasiyal ağrı koşullarını içermez. Yüz bakımı ve azalmış yetiştirme de migrenin klinik öncesi modellerinde davranışsal yanıtların çıktıları olarak kabul edilir^20,21. İlkinin sınırlamaları, ağrı tepkilerini normal rutin tımar ve kaşıntı gibi diğer duyumlardan ayırt etmede zorluğu içerir. İkincisi durumunda, yetiştirme davranışları tipik olarak kemirgenlerin yeni ortamlara girmesinden sonra hızla azalır. Bu davranışsal sonlanım noktalarının her biri, ağrı koşullarına katkıda bulunan çeşitli mekanizmaların anlaşılmasında değerli olmasına rağmen, migren gibi ağrı bozukluklarının klinik öncesi modellerinin, özellikle sefalik aşırı duyarlılık yanıtlarını yakalayan son noktaları içermesi için kritik bir ihtiyaç vardır. Dural stimülasyonu takiben periorbital derinin dokunsal aşırı duyarlılığının değerlendirilmesi, duyusal semptomların ağırlıklı olarak sefalik olduğu migrenlere katkıda bulunan mekanizmalar hakkında daha iyi bir fikir verebilecek bir yöntemdir. Burada, klinik öncesi bir migren modeli olarak fare durasına madde uygulamak için bir yöntem açıklıyoruz. Dural uygulamayı takiben, Dixon yukarı-aşağı yönteminde uygulanan kalibre edilmiş von Frey filamentlerini kullanarak periorbital dokunsal aşırı duyarlılığı test etmek için ayrıntılı bir yöntem de sunuyoruz.

Tüm prosedürler, Dallas'taki Teksas Üniversitesi'ndeki kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin önceden onayı ile gerçekleştirildi. Bu çalışmada 6-8 haftalık ICR (CD-1) (30-35 g) ve C57/BL6 (25-30 g) fareler kullanıldı.

1. Dural demlik

1. Ticari olarak temin edilebilen bir iç kanülü değiştirerek fare infüzörlerini ve tek taraflı enjeksiyonlar için infüzer'ı, ayarlanabilir ve iç çapı (I.D.) 0,18 mm ve dış çapı (O.D.) 0,35 mm olan 28 G kılavuz kanülün içine yerleştirilen/altına yerleştirilen/uzatılan metalik olmayan kaynaşmış silika plastik kapakla değiştirin (Şekil 1A).
2. İnfüze üzerindeki kaynaşmış silika plastik kapağı 0,6 mm uzunluğa ayarlamak için bir kumpas veya başka bir ölçüm cihazı kullanın; demlik ucundan silika plastik kapağın kenarına kadar ölçülür.
   1. Plastik kapağı ayarlarken demliği bükmemeye veya donuklaştırmamaya dikkat edin.
   2. Daha önce dural enjeksiyonlar için kullanılmamış diğer fare suşları için, uzunluğu 0,6 mm'ye ayarlayarak ve mürekkep veya boya ile pilot enjeksiyonlar yaparak, demlik uzunluğunu, boyanın beyinde veya kafatasında değil, yalnızca dura materde olduğu gözlemlenene kadar ayarlayarak optimum demlik uzunluğunu belirleyin.
3. Ayarlanan demlik makinesinin uzun ucunu (veya 0,6 mm olarak ölçülmeyen ucunu) plastik boruya (pompa borusu, 2 stop, ID, 0,19 mm, uzunluk 406 mm) takın.
   1. 5 μL'lik bir hacmi tutmak için yeterli hat olduğundan emin olmak için boruyu minimum 8 inç uzunluğa kesin.
   2. Borunun metal kısmı ve demlik üzerinde bulunan plastik tıpanın üstünü kapladığından emin olun. Bu, hava kabarcıklarının hatta birikmesini önlemeye yardımcı olacaktır.
4. Borunun diğer ucunu 10 μL'lik bir cam mikroşırıngaya (gaz geçirmez; çimentolu iğne; 10 mm projeksiyonlu 21 G) takın, tekrar şırınganın metal kısmı üzerinde sıkı bir sızdırmazlık olduğundan emin olun (Şekil 1A).
5. Hat bağlandıktan sonra, şırıngayı 5 μL fosfat tamponlu salin (PBS), sentetik geçiş sıvısı (SIF) veya hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için tercih edilen diğer araçlarla doldurun.
   1. Çizgide hava kabarcıkları gözlenirse, kabarcıklar dağılana kadar hattı araçla doldurun.
      NOT: Şırıngayı hatta takmadan önce araçla doldurmak ve ardından bağlandıktan sonra sıvıyı hattan itmek yardımcı olabilir.
6. Hat aracın 5 μL'si ile doldurulduktan ve verimli bir şekilde çalıştıktan sonra, ilacın / çözeltinin 5 μL'sini Hamilton şırıngasına yükleyin (bu tekniği öğreniyor veya uyguluyorsanız ilaca / çözeltiye alternatif olarak mürekkep veya boya kullanılabilir).
   1. Dura üzerine uygulanan tüm araç çözeltilerinin pH 7.4'te tutulduğundan ve 310 ozmolaliteye kadar ölçüldüğünden emin olun. Bu, asit algılayan iyon kanallarının ve dura içindeki diğer ozmosentisit kanalların potansiyel aktivasyonunu azaltır.
7. Beyne sızmaya neden olmayan farelerde test edilen maksimum hacim kabaca 10 μL'dir. Bu hacimli enjeksiyonlardan sonraki davranışsal etkiler test edilmemiştir. Bu nedenle, çözeltinin sadece 5 μL'sini dura üzerine uygulayın.
   NOT: Bu gözlemler, 6-8 haftalık CD1/ICR farelerinin fare suşlarına/yaşlarına/ağırlıklarına dayanmaktadır.

2. Dural enjeksiyonları

1. Şırınga hazırlandıktan ve ilaç yüklendikten sonra, bir fareyi karnına düz bir şekilde yerleştirin ve burun konisi yoluyla 0.5-1 L / dak'lık bir oksijen akış hızına sahip% 3'lük kısa bir izofluran altında anestezi uygulayın.
   1. Fare artık bir tutam refleksi göstermedikten sonra, anesteziyi ayarlayın ve% 1.5'lik bir izofluranda sürdürün.
2. Anestezi uygulandıktan sonra, gözlere steril oftalmik merhem uygulayın ve hayvanın kafasını tıraş edin, ardından cildi povidon-iyot ve etanol ile dezenfekte edin. Bunu takiben, başarılı bir enjeksiyon için elverişli bir pozisyona geçin.
3. Hayvanın kafasını sabitlemek için bir elinizi kullanın ve demleyiciyi diğer elinizle tutun.
4. Sagital ve lambdoidal sütürlerin farenin kafatası üzerindeki birleşme noktasını dikkatlice araştırın ve bulun (Şekil 1B, C).
   1. Bu gizli kavşağı deriden bulmak için, kafatasının topografik özelliklerini kullanın ve demlik ile birleşmenin genel konumunu nazikçe araştırın.
   2. İnfüzörü kafatası boyunca yeniden konumlandırarak ve tam yeri hissederek kavşağın konumunu doğrulayın.
5. Dikiş yerleştirildikten ve demleyici yerine oturduğunda, demleyiciyi deriden delene ve plastik tıpaya kadar kavşağa düşene kadar çok yavaş ve nazikçe ileri geri sallayın.
   NOT: İnfüze makinesinin 0,6 mm'lik ucunun tamamını bağlantıya yerleştirdiğinizden emin olun.
6. Doğruluğu doğrulamak için, enjeksiyon çözeltisi olarak mürekkep veya boya kullanın ve fareyi ötenazi yapın ve kafasını açın.
   1. Dura mater içindeki boyayı görselleştirmek için kafatası kapağını çıkarın (Şekil 1C).
      NOT: Beyinde veya kafatasının dış kısmında boya gözlenmemelidir. Benzer şekilde, herhangi bir deneydeki fareler, enjeksiyonun doğruluğunu doğrulamak ve dura materin bütünlüğünün zarar görmediğinden emin olmak için ölüm sonrası kontrol edilmelidir.
7. Enjeksiyonu takiben, fareyi anesteziden çıkarın, bilincini yeniden kazanmasını bekleyin ve ardından kafesine geri dönün veya istenen tahlillere başlamak için bir test odasına yerleştirin.
   NOT: Herhangi bir davranış deneyi yapmadan önce farenin anesteziden en az 30 dakika iyileşmesine izin verin.

3. Periorbital von Frey

1. Çalışmaya yaklaşık 16-20 fareden oluşan bir kohort ile başlayın.
2. Alışkanlıktan bir gün önce, her fareyi en az 5 dakika boyunca tutun.
3. İşlemden yaklaşık 24 saat sonra, fareleri test odası koşullarına ve von Frey test cihazına alıştırın (Şekil 2A).
   NOT: Akrilik test cihazı, yaklaşık 3 inç x 3,5 inç x 5 inç (G x Y x D) olan kapaklı ayrı bölmelerden oluşur ve 19 G kare galvanizli çelik örgü telinde 0,25 ile bağlanmış alüminyum standlarla desteklenir.
   1. Fareleri, kokusuz ve polietilen veya parafin mumu içermeyen yatay olarak yerleştirilmiş 4 oz'luk beyaz bir kağıt kabın içine yerleştirin.
      NOT: Bu tip bardaklar tercih edilir, çünkü yutulduğunda farelerde gastrointestinal rahatsızlığı azaltır (Şekil 2B).
4. Hayvanlar kendi odalarındayken, hayvanları sakinleştirmek ve hayvanlara gereksiz stresi önlemek için her farenin ayrı odasına normal chow diyetinin bir peletini yerleştirin. Bunu herhangi bir von Frey davranış testinden önce 3 gün boyunca yapın.
   1. Farelerin odaya her girdiğinde yiyeceğe erişimin olduğundan emin olun.
   2. Her hayvanı numaralandırın ve test rafındaki aynı alana atayın. Her hayvanın test ortamına alışmasını sağlamak için fareyi test süresinin her günü aynı kaba yerleştirin.
      NOT: Fareler bardakları kemirecek ve daha sonra bardakları yok edecektir. Böyle bir durumda, bardağı değiştirin ve karşılık gelen fare numarasıyla etiketleyin.
5. İlk 3 günlük alışkanlığı takiben, fareleri bireysel odalarına yerleştirin.
   1. Farelerin sakinleşmesine izin vermek ve daha sonra test edilmesi daha kolay olması için hayvanların herhangi bir von Frey testinden önce test odasına ve odalara en az 1 saat alışmasına izin verin.
6. Test günü odaya alıştıktan sonra, bir fareyi fincanının içindeyken ilgili odasından çıkarın.
   1. Bardağı yatay konumda tutun, böylece ağırlıklarını eşit olarak dağıtmaya yardımcı olmak için fare hem ön pençelerde hem de arka pençelerde olur.
      NOT: Eşit olmayan ağırlık dağılımı hayvanların tepkilerini değiştirebilir ve hatta hayvanların yanıt vermesini engelleyebilir.
7. Bardağı farenin içindeyken, emici pedin üzerindeki test rafının altındaki masanın üzerine yerleştirin.
8. Periorbital von Frey testi için, 0.07 g von Frey filamentini doğrudan yüzün ortasına ve gözlerin arasına yerleştirin.
9. Von Frey saçının "C" şeklinde bir formasyona bükülmesine neden olmak için filament üzerine yeterli basınç uygulayın.
   1. Bölge ile teması en az 3 sn ancak en fazla 5 sn veya fare başını çekene ve pençesiyle filamente kaydırana kadar sürdürün.
      NOT: Eğer filament kayarsa veya filamentin ucundan daha fazlası test sırasında hayvana dokunursa, herhangi bir yanıt sayılmamalıdır. Bu tepkiler, farklı mekanoreseptörler tarafından aktive edilen fırçaya yanıt olarak olabilir ve bu nedenle doğru sonuçları yansıtmayabilir.
   2. Von Frey filamentlerini Dixon "yukarı-aşağı" yöntemi ^22,23'e göre uygulayın.
      1. Başlangıçta, 0.07 g ağırlığa sahip von Frey filamentini uygulayın. Bu çalışmada mümkün olan en düşük filament ve test edilen en yüksek filament, sırasıyla 0.008 g ve 0.6 g ağırlığa sahip filamentlerdir.
      2. Bu testi yapmak için 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g ve 0,6 g ağırlığındaki filamentleri kullanın.
      3. Bu yöntemde, bir hayvan filamente bir tepki göstermezse, bir sonraki yüksek gram ağırlığının filamentini uygulayın.
      4. Fare bir filamente yanıt veriyorsa, farenin o filamente yanıt verdiğini düşünün. Bu durumda, bir sonraki düşük gram ağırlığın filamentini uygulayın.
      5. İlk yanıttan sonra hayvan 4 kez test edilene veya hayvanın tahlilde test edilen herhangi bir filamente yanıt vermediği belirlenene kadar bu kalıbı tekrarlayın.
         NOT: Koldan veya bilekten kaynaklanan herhangi bir ek basınç uygulamaktan kaçının. Filamentin uygulanmasını uygulamak için bir ölçek kullanılabilir.

4. Temel para çekme eşiklerinin test edilmesi

1. Bir deneye dahil edilmeden önce, farelerin 0.5-0.6 g arasında bir temel çekilme eşiğine ulaştığından emin olun.
   1. Bir fare, adım 3.9.2.2'de belirtilen seride test edilen herhangi bir filamente (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g ve 0,6 g) yanıt vermezse taban çizgisine ulaşır.
2. Temel geri çekilme eşikleri oluştururken fareleri günlük olarak test edin.
   1. Test, hayvanların test koşullarına ve von Frey filamentlerinin basıncına alışmalarını sağlar.
   2. Testin üçüncü gününden sonra fareler hala aşırı derecede aşırı duyarlıysa, tekrar test etmeden önce 1 veya 2 gün beklemeyi deneyin.
      NOT: Test günleri arasında çok fazla zaman olması, hayvanın periorbital bölgedeki filamentin ağırlığına uyum sağlayamamasına ve böylece hedeflenen geri çekilme eşiğine ulaşmamasına neden olabilir.
3. Hangi hayvanların bir deney için dahil edilme kriterlerini karşılamadığını belirlemeden önce fareleri yaklaşık 7 gün boyunca test edin.
   NOT: Farelerin yaklaşık% 70'i hedeflenen temel seviyeye ulaşacaktır.
   1. Dural stimülasyondan önce, 0,5-0,6 gram veya daha yüksek bir temel değere ulaşmamış fareyi hariç tutmak için taban çizgisi verilerini analiz edin.
   2. Dışlamadan sonra, kalan her fareyi rastgele bir test grubuna atayın. Bunu, bir bardaktan çizim yaparak veya sayıları bir gruba rastgele sıralamak için bir elektronik tabloya bir komut dosyası yazarak elde edin.

5. Von Frey sonuçlarının analizi

1. Yanıtlar dizisi elde edildikten sonra, delta, k değeri, %50 eşiği ve daha önce yayınlanan yöntemlere göre gram cinsinden geri çekilme eşiğini belirleyin²⁴.
2. Bu formülü kullanarak para çekme eşiğini hesaplayın WT = 10 (x * F + B), burada WT = çekme eşiği, F = Chaplan yöntemiyle hesaplanan pençe çekme eşiği ve B = kütüğün doğrusal regresyonu (bükme kuvveti) = x * Filament sayısı ^{+ B}.
3. Verileri %50 geri çekilme eşiği veya gram cinsinden ortalama para çekme eşiği olarak çizin.

Bu enjeksiyon yöntemi, uyaranları farelerin durasına uygulamak için kullanılır, böylece daha sonra davranışsal testler yapılabilir. Bu modelle ölçülen en yaygın davranışsal çıktı, von Frey^12,13,14 ile değerlendirilen kutanöz yüz aşırı duyarlılığıdır. Burada, bu modelin migren patolojisine cinsiyete özgü potansiyel katkıları değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz (Şekil 3).

Bu prosedür, dural prolaktinin (PRL) mekanik olarak uyarılmış yüz aşırı duyarlılığı¹⁴ üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır (Şekil 3). Bu çalışmanın sonuçları, dişi ICR farelerinin 5 μg dural prolaktine yanıt olarak önemli ölçüde azalmış yüz yoksunluk eşikleri gösterdiğini göstermiştir (Şekil 3A). On kat daha düşük bir 0.5 μg prolaktin (PRL) dozu da yüksek doz PRL'ye benzer yanıtlar göstermiştir (Şekil 3B).

Bu enjeksiyonların ayrıca buruşma yoluyla değerlendirilen spontan ağrı ile ilgili davranışlar ürettiği gösterilmiştir. Dural 0.5 μg PRL, dişi farelerde önemli grimacing'e neden oldu (Şekil 3C), ayrıca kadın migren benzeri davranışlarda dural PRL'nin açık bir rol oynadığını gösterdi. Von Frey filamentleri ile yapılan tüm testlerden önce yüz buruşturma testleri yaptık.

Şekil 1: Dural demleyici ve enjeksiyon yerleşimi . (A) Enjektörler/infüzörler, ~0,5 mm- 0,65 mm uzunluğa ayarlanmış ve tygon borusu aracılığıyla 10 μL gaz geçirmez bir şırınga üzerine yapıştırılmış bir iğneye tutturulmuş modifiye edilmiş bir kanülden oluşur. (B) Farenin başındaki işaretli enjeksiyon yeri konumunun havadan görünümü. (C) (Sol panel) Dural enjeksiyonun yerinin diyagramı. Enjeksiyonun yerleştirilmesi, lambdoid ve sagital sütürlerin bregmaya yaklaşık 4.8 mm posteriorda birleşme noktasındadır. (Orta panel) 5 μL mavi enjeksiyon boyasının dural enjeksiyonunu takiben bir fare kafatasının ölüm sonrası havadan görünümü. (Sağ panel) Fare kafatası kapağının beyinden ayrılması. Beyinde gözlemlenebilir bir mavi enjeksiyon boyası sızıntısı yoktu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: von Frey Test odaları. (A) von Frey test odası, bir tel örgü raf üzerine yerleştirilmiş kapaklı bireysel akrilik odalarda 3,5 inç x 3,5'ten oluşur. Bunlar 2 sıra halinde düzenlenmiş 10 odalı sütunlarla birbirine bağlanır. (B) Von Frey test odalarının içinde bulunan bireysel bardaklarındaki farelere örnek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Prolaktinin dural uygulaması farelerde davranışsal tepkileri indükler. Mekanik yoksunluk eşikleri, dişi farelerde PRL'nin (5 μg veya 0.5 μg) dural uygulamasını takiben değerlendirildi. (A) 5 μg PRL (n = 7 PRL, n = 6 araç) kaynaklı yüz aşırı duyarlılığının araca kıyasla uygulanması. (B) 0.5 μg PRL (n = 5 PRL, n = 4 araç) uygulanması, uzun süreli yüz aşırı duyarlılığına neden oldu. (C) Grimace ayrıca her zaman noktasında 0.5 μg PRL ile tedavi edilen aynı farelerde değerlendirildi. Bu fareler, araçla tedavi edilen farelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek yüz buruşturma puanları sergiledi. İstatistikler: İki yönlü ANOVA'yı takip eden Bonferroni çoklu karşılaştırma post-hoc analizi. Veriler SEM ± araçlar olarak gösterilir. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Dura'daki lokal nosiseptif sistemdeki uyumsuz değişiklikler, doku hasarı olmamasına rağmen migren ataklarının baş ağrısı fazına önemli bir katkıda bulunur^25,26. Burada çalışma, duranın minimal invaziv stimülasyonunun yüz dokunsal aşırı duyarlılığını indükleyebileceği bir yöntem sunmaktadır. Dural nosiseptör aktivasyonunda rol oynayan mekanizmaların ve olayların kafatasına ve dokulara zarar vermeden aydınlatılması, migren mekanizmalarını klinik öncesi bir modelde daha doğru bir şekilde yansıtabilir.

Kraniotomi ve kanül implantasyonu, migren ağrısına katkıda bulunan fonksiyon ve mekanizmaları değerlendirmek için uzun zamandır kullanılmaktadır^11,12. Bununla birlikte, bir kraniyotominin dural mast hücrelerinin aktivasyonunu indükleyebileceği ve kemirgenlerde pial vasküler geçirgenliği artırabileceği bildirilmiştir²⁷. Duradaki mast hücresi aktivasyonunun migren 7,8,28,29'da yüksek oranda rol oynadığı göz önüne alındığında^, bu tekniğin yorumu çarpıtabilecek büyük uyarıları vardır. Sagital ve lambdoidal sütürlerin birleşme yoluyla maddelerin uygulanması, kraniyotomiye bağlı mast hücre aktivasyonunun aracılık ettiği nosiseptörlerin aktivasyonunu etkili bir şekilde azaltır. Ayrıca, non-invaziv dural stimülasyon, cerrahi sonrası iyileşme ve sonuçların yorumlanmasını değiştirebilecek analjeziklerin uygulanmasını gerektirmez. Maddelerin dura üzerine lokal olarak uygulanması, araştırmacıların, etki alanının kolayca belirlenemediği ilaçların sistemik uygulamasının aksine, bu spesifik hedef dokuya odaklanmalarını sağlar^12,13,14. Nitrogliserin ve kalsitonin geni ile ilişkili peptid gibi maddelerin sistemik olarak uygulanması, insanlarda migrene benzer deneysel atakları tetiklerken, kemirgen modellerinde etki yerinin değerlendirilmesine izin vermez; daha hedefli dokuya özgü modeller alternatif bir yaklaşım sunar.

Burada tarif edilen bu teknik, kafatasının sagital ve lambdoidal sütürlerinin buluştuğu kavşaktan doğrudan meninkslerin dura materine bir ilaç veya başka bir çözelti enjekte etmeyi içerir. En iyi sonuçlar için, bu deneyler için 6-8 haftalık ICR (CD-1) veya C57 / BL6 fareleri kullanılmalıdır. Daha genç fareler kullanılabilir; Bununla birlikte, 8 haftadan daha eski ICR (CD-1) farelerinin kullanılması tavsiye edilmez, çünkü kafatası plakası sütürleri tipik olarak bu yaşta tamamen kaynaşır, bu da kafatasına zarar vermeden enjekte etmeyi imkansız kılar. Bu prosedürden geçecek her farenin ağırlığını / boyutunu dikkate almak da çok önemlidir. Bu enjeksiyonların, kafatası tipik olarak daha düşük ağırlıklarda çok ince olduğundan ve enjeksiyon sırasında uygulanan basınca dayanamayabileceğinden, 19 g'dan daha büyük bir ağırlığa sahip hayvanlara yapılması önerilir. Önemli olarak, kafatası plakası füzyonunun meydana geldiği yaşa / ağırlığa katkıda bulunan olası faktörler de vardır (örneğin, hayvan tesislerinde kullanılan laboratuar chow'unun bileşimi). Bu nedenle, deneycilerin kendi koşulları altında uygun yaş / ağırlık aralığını belirlemeleri gerekebilir. Kafatası plakalarının bu hayvanlarda ne zaman kaynaştığına bağlı olarak diğer fare suşları veya genotipleri için farklı yaş aralıkları ve hayvan ağırlıkları gerekebilir ve ayrıca enjeksiyonun kendisinin optimizasyonunu gerektirebilir.

Bu tekniği öğrenirken veya uygularken, ötenazi farelerde dikiş bağlantısının bulunmasıyla bir rahatlık seviyesinin elde edilmesi şiddetle tavsiye edilir. İlk önce bu farelerde eksize edilmiş veya soyulmuş kafa derisi ile pratik yapmak ve bağlantıyı cilt yoluyla konumlandırmak için yavaşça ilerlemek en iyisi olabilir. Kesin konum belirlendikten sonra, enjeksiyonun konum doğruluğunu ve derinliğini doğrulamak için duraya mürekkepler ve boyalar enjekte edilebilir. Bu teknik, ICR (CD-1) fareleri (30-35 g) ve C57 / BL6 fareleri (25-30 g) kullanılarak geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. 0,5-0,6 mm'lik bir demleme uzunluğu, 25-35 g aralığında bir fare ağırlığı enjekte etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, bu tekniği optimize etmek için kullanılan farelerden önemli ölçüde farklı olan farelerin enjekte edilmesi durumunda, infüzörün uzunluğunun kalibre edilmesi gerekebilir. Örneğin, 25 g'dan küçük bir fare muhtemelen uzunluğu 0,5 mm'den az olan bir demlik makinesinin kullanılmasına neden olur. Bu tekniğe hakim olduktan sonra ve yaşa uygun farelerde uygulandığında, bu enjeksiyonun başarı oranı% 100'e yakın olabilir; Bununla birlikte, enjeksiyonla ilgili komplikasyonlar, demleyiciyi yerleştirmek için çok fazla kuvvet uygulanması nedeniyle kafatasının kırılması ve meningeal kan damarlarının zarar görmesinin neden olduğu anormal kanama gibi sorunlardan kaynaklanabilir.

Dokunsal duyarlılıktaki değişiklikler, kemirgenlerde ağrı davranışlarını değerlendirirken önemli bir ölçümdür. Burada, bu davranışları klinik öncesi migren modelinde değerlendirmek için periorbital von Frey testinin kullanımını gösteriyoruz. Bu tekniği migren modellerinde kullanmanın en büyük avantajı, pençeler gibi diğer kraniyal olmayan yerlerden daha fazla ilgisi olan başın aşırı duyarlılığını değerlendirebilmemizdir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik adım, farelerin tamamen temel alındığından emin olmaktır. Bu, von Frey filamentlerini tam olarak uygulayabilen iyi eğitimli bir deneyci gerektirecektir. Bir hayvanın taban çizgisine ulaşması yaklaşık 7 gün sürecektir. Bununla birlikte, her hayvanın hedeflenen taban çizgisine ulaşmaması mümkündür. Deneyimlerimize göre, farelerle yaklaşık 7 gün çalıştıktan sonra, hayvanların sadece% 60-70'i periorbital bölgede 0.6 g'lık bir taban çizgisine ulaşacaktır, ancak bu hayvanların kohortuna bağlıdır. Bu zamanlama, bir deneye başlamadan önce, bırakmayı hesaba katmak için yeterli sayıların kullanıldığından ve hayvanların durayı uyarmak için bu invaziv olmayan yöntemi kullanmak için uygun yaş sonrası başlangıç çizgisi olduğundan emin olmak için dikkate alınmalıdır. Bir anahat belirleme adımları protokol bölüm 4'te özetlenmiştir.

Von Frey testinin bir sınırlaması, ağrı tepkileri ile rutin tımar / kaşıntı arasında ayrım yapmanın zor olabileceğidir. Ağrıyı tımardan ayırt etmeye yardımcı olmak için, bu davranışın meydana geldiği sürenin uzunluğunu fark etmek önemlidir. Genellikle, bir ağrı tepkisi filament uygulamasını takiben bir kaydırmadır, tımar davranışları ise uzama eğilimindedir ve birkaç saniye ila dakika sürebilir. Tımar / kaşıntı davranışı aşırı duyarlı bir tepkiden ayırt edilemezse, bunu bir yanıt olarak kaydetmemek en iyisidir. Ek olarak, yanlış filament yerleşimi (örneğin, filament kayması), hayvanın uzun süre tımar edilmesine neden olabilir ve bu da düzgün bir şekilde test edilmesini zorlaştırabilir. Bu durumda, deneyci tımar durana ve fare test etmek için yeterince sakin olana kadar beklemelidir. Tımar davranışının başlamasından önce kullanılan aynı filamentten devam edin. Fare çok uzun süre devam ederse, fareyi yaklaşık 5 dakika boyunca test odasına geri yerleştirin. 5 dakika geçtikten sonra, fareyi tekrar test etmeyi deneyin. Bu davranış çözülmeden devam ederse, farelerin çalışmadan çıkarılması gerekir. Önemli olarak, saç alındıktan sonra fare derisinin aynı hassasiyeti koruyup korumadığı belli olmadığından yüzdeki kürkün tıraş edilmesi önerilmez ve epilasyon işlemi (tıraş, tüy dökücü kremler) de cilt hassasiyetini etkileyebilir.

Çoğu durumda, fare taban çizgisine ulaştıktan sonra en fazla 24 saat içinde dura üzerine madde uygulamak için idealdir. Farelerin saatte bir kez von Frey filament testine tabi tutulması önerilir. Mümkünse, her iki saatte bir test etmek, hayvanların testten sonra sakinleşmesi için yeterli zaman verir. Ek olarak, deneyler sirkadiyen kalıplarına müdahale etmeyecek şekilde zamanlanmalıdır. Farelerde sirkadiyen ritimdeki değişiklikler davranışsal fenotipleri değiştirebilir ve sonuçta tekrarlanamaz sonuçlara neden olabilir.

Periorbital von Frey testi, deneysel sonuçları güçlendirmek için diğer davranışsal testlerle birlikte kullanılabilir. Yüz buruşturma ölçeği, uyandırılmış yanıtlardan ziyade kemirgenlerdeki spontan yüz^{ifadelerine dayanır 18,19}. Bu yöntem, akut ağrı davranışlarını değerlendirirken ve ölçerken yüksek doğruluk ve güvenilirliğe sahiptir ve migrenin birçok preklinik modelinde kullanılmıştır^12,30. Hem buruşma hem de periorbital von Frey tahlillerini kullanırken, deneyci, von Frey filamentlerinin farenin periorbital bölgesine uygulanmasından önce buruşma için puanlamayı düşünmelidir. Bu, grimacing davranışının kendiliğinden olmasını ve filament uygulaması ile uyarılmamasını sağlar. Hindpaw mekanik aşırı duyarlılığı, periorbital von Frey testi ile birlikte de kullanılabilir. Yüz buruşturma skorlamasının aksine, arka pençe aşırı duyarlılığını değerlendirmeden önce yüz aşırı duyarlılığını test etmek en iyisidir. Hindpaw testi, periorbital von Frey testi tamamlandıktan sonra farenin fincan olmadan odaya geri yerleştirilmesini gerektirir.

Sonuç olarak, periorbital von Frey testi ve farelerde non-invaziv dural stimülasyon, migrenin mevcut preklinik modellerine değerli seçenekler eklemektedir. Doğru yapıldığında, bu teknik, bir kanülün cerrahi implantasyonunu gerektirmediğinden, kemirgenlerde baş ağrısı benzeri bir fenotip oluşturmak için rafine bir yaklaşım sunar. Sıçanlarda, kanüller bakteriyel enfeksiyona eğilimlidir, tıkanabilir, düşebilir ve her hayvanın tek evli olmasını gerektirir, bu da hayvan üzerinde gereksiz stres yaratır. Ayrıca, dural stimülasyon protokolü çeşitli ilaç uygulamalarıyla kullanılmak üzere kolayca değiştirilebilir. Periorbital von Frey test paradigmaları da deneysel spesifikasyonlara en iyi uyacak şekilde değiştirilebilir. Ek olarak, periorbital von Frey testi diğer orofasiyal ağrı bozukluklarında kullanılabilir. Bu teknikler, migren ağrısının altında yatan karmaşık mekanizmaları daha iyi anlamaya yardımcı olmak için önemli bir araçtır.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NS104200 ve NS072204 to GD) tarafından desteklenmiştir.