Method Article
Sinyal seviyelerinin hücre kaderini düzenlediği bilinmektedir, bu da Wnt sinyalinin düzenlenmesinin ilginç bir terapötik hedef oluşturduğunu göstermektedir. Burada, farklı Wnt sinyal seviyelerini ölçen sağlam bir murin kanonik Wnt sinyalleme raportör modeli için akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi analiz yöntemlerini açıklıyoruz.
Yeni Wnt terapötik hedeflerini belirlemeye veya test etmeye çalışırken Wnt ekspresyon seviyelerinin ölçülmesi çok önemlidir. Önceki çalışmalar, kanonik Wnt sinyallemesinin dozaj güdümlü bir mekanizma aracılığıyla çalıştığını ve çeşitli hücre tiplerinde Wnt sinyalini inceleme ve ölçme ihtiyacını motive ettiğini göstermiştir. Fizyolojik Wnt ekspresyonunu temsil etmek için birkaç raportör model önerilmiş olsa da, ya genetik bağlam ya da raportör protein, bu araçların geçerliliğini, doğruluğunu ve esnekliğini büyük ölçüde etkilemiştir. Bu makale, mutasyona uğramış bir Axin2em1Fstl aleli içeren Axin2-mTurquoise2 fare Wnt raportör modeli ile elde edilen verilerin elde edilmesi ve analiz edilmesi için yöntemleri açıklamaktadır. Bu model, geniş bir Wnt aktivitesi aralığı boyunca tek tek hücrelerde endojen kanonik Wnt sinyallemesinin incelenmesini kolaylaştırır.
Bu protokol, hücre yüzeyi belirteçleri veya β-katenin hücre içi boyama ile birlikte hematopoietik sistemin hücre popülasyon analizini kullanarak Axin2-mTurkuaz2 raportör aktivitesinin nasıl tam olarak takdir edileceğini açıklar. Bu prosedürler, ilgilenilen diğer dokularda veya hücrelerde uygulama ve üreme için bir temel görevi görür. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması ve konfokal görüntülemeyi birleştirerek, farklı kanonik Wnt ekspresyon seviyeleri görselleştirilebilir. Önerilen ölçüm ve analiz stratejileri, kanonik Wnt sinyalizasyonunun hassas bir şekilde değerlendirilmesi için floresan ekspresyon seviyeleri hakkında nicel veriler sağlar. Bu yöntemler, kanonik Wnt ekspresyon örüntüleri için Axin2-mTurquise2 modelini kullanmak isteyen araştırmacılar için faydalı olacaktır.
Kanonik Wnt sinyali, sağlıklı doku homeostazında ve hastalıkta rol oynayan korunmuş bir sinyal yoludur. Wnt sinyal seviyelerinin hassas bir şekilde düzenlenmesinin embriyonik gelişimde önemli olduğu gösterilmiştir, ancak yetişkin dokularda da büyük önem taşımaktadır. Kanonik Wnt sinyalinin bağırsak, deri ve hematopoetik sistem gibi çeşitli organların doku rejenerasyonunda önemli bir rol oynadığı bulunmuştur. Bu nedenle, Wnt sinyali deregüle edildiğinde ciddi patolojiler ortaya çıkar. Kolorektal, karaciğer ve cilt kanseri, nörolojik hastalık ve bazı hematolojik maligniteler, düzensiz Wnt sinyalizasyonunun nedensel faktör veya katkıda bulunduğu örnek patolojilerdir1. Bu nedenle, farklı Wnt hedefleri için çeşitli inhibitörler şu anda Wnt ile ilişkili kanser terapötikleri2 olarak klinik çalışmalarda test edilmektedir.
Ek olarak, nörolojik iyileşme, yaşa bağlı nörolojik bozukluklar ve konjenital otizm spektrum bozuklukları için Wnt terapötik potansiyelinde ilginç ilerlemeler meydana gelmektedir 3,4,5. Wnt sinyalleri, sonraki transplantasyon için kök hücrelerin ex vivo genişlemesi için araştırılmıştır6. Bununla birlikte, kanonik Wnt sinyalinin terapötik hedeflemesi, birçok temel hücre fonksiyonundaki önemi ve diğer yolaklarla çapraz konuşmasınedeniyle zor bir çabadır 7,8,9, bu Wnt terapötik ajanlarının etkilerini yorumlaması kolay bir modelde hassas bir şekilde ölçme ihtiyacına neden olur. Kanonik Wnt sinyali, komşu hücreler tarafından salgılanan veya çeşitli Wnt'ye duyarlı kök hücre tiplerinde bildirildiği gibi otokrin atılımı olarak salgılanan kısa menzilli, çözünür Wnt ligandları tarafından yönlendirilir.
Wnt Frizzled reseptörü ve lipoprotein reseptörü ile ilişkili protein (LRP) ko-reseptörleri, hücre içi bir sinyal kaskadını tetikleyen bu ligandlara yanıt verir. Wnt sinyali kapalı olduğunda, Eksen İnhibitörü (Aksin), tümör baskılayıcı gen ürünü, Adenomatöz Polipozis Coli (APC), Kazein Kinaz1 (CK1α) ve Glikojen Sentaz Kinaz'dan (GSK-3β) oluşan bir yıkım kompleksi, proteazomal bozunma ile β-katenin (CTNNB1) birikimini önler. Wnt ligand-reseptör bağlanması üzerine, yıkım kompleksi inaktive edilir, bu da sitoplazmada β-kateninin birikmesine ve stabilizasyonuna yol açar. Aktif β-katenin, Wnt hedef genlerinin transkripsiyonunu başlatmak için Transkripsiyon Faktörü / Lenfoid Arttırıcı Bağlayıcı Faktör (TCF / LEF) transkripsiyon faktörlerine bağlandığı çekirdeğe göç edebilir. Axin2, Wnt yolu10'un doğrudan hedefi olduğu için bir hedef gen olarak kabul edilir. Ek olarak, Axin2, aktif kanonik Wnt sinyali11,12 için bir raportör genin yanı sıra negatif bir düzenleyici olarak hizmet eder.
Literatürde birkaç kanonik Wnt sinyal muhabiri tanımlanmıştır ve Wnt sinyalinin embriyonik gelişimdeki rolünü anlamada büyük fayda sağlamıştır. Bu raportörlerin çoğu, endojen bir hedef gen 13,14,15,16,17,18,19 kullanmayan sentetik olarak yerleştirilmiş TCF/LEF bağlanma bölgelerini kullanır. Ek olarak, 11,20,21,22,23 geninin doğal konumuna saygı duyan Axin2 knock-in stratejileri kullanılmıştır ve bunların Axin2-LacZ'si genellikle en sağlam kanonik Wnt raportörü olarak kabul edilir11. Bununla birlikte, raportör protein LacZ, çoğu dokuda kullanımı kolay olsa da, canlı hücreler için sert olduğu kabul edilen bir β-galaktosidaz substratı gerektirir24. Özellikle kök hücreler ve timositler için, sert LacZ tespit koşulları, hücre süspansiyonlarını ele alırken hücresel ölümü (kendi bildirilmemiş verileri) artırır.
LacZ boyamanın neden olduğu sinyal amplifikasyonu, düşük sinyalleri tespit etmek için uygun olsa da, nicelemeyi daha az doğrudan ve dolayısıyla tartışmalı bir şekilde daha az güvenilir hale getirir. Bu nedenle, bir murin raportör modeli, Axin2-LacZ genetik stratejisini taklit etmek için tasarlanmıştır, ancak bir mTurquoise2 raportör proteini21 ile, daha doğrudan ve fizyolojik ifade seviyelerine daha yakın bir okuma sağlamak için tasarlanmıştır. mTurquoise2 floresan proteini, yüksek parlaklığı (kuantum verimi (QY) = 0.93), geniş hücre yüzeyi karakterizasyonu için diğer floresan proteinlerle kombinasyon halinde esnekliği ve eksojen bir substrata ihtiyaç duymaması nedeniyle LacZ için mükemmel bir alternatiftir. Ayrıca, yeşil floresan proteini (GFP) ile yakın genetik ilişkisi, gerekirse Wnt'ye son derece duyarlı hücrelerde daha güçlü sinyal tespiti için GFP'yi tanıyan floresan antikorların çoğunu kullanma imkanı sunar25.
Axin2-mTurquoise2 modeli sadece kanonik bir Wnt raportörü değil, aynı zamanda Axin2 heterozigot ve homozigot (Axin2 nakavt) fenotiplerini inceleme imkanı da sunar. Axin2'nin başlangıç bölgesine mTurquoise2'nin hedeflenen yerleştirilmesi, bozulmuş bir Axin2 proteini21 ile sonuçlanır. İletken olarak da bilinen Axin2, Wnt yıkım kompleksinin bir parçası olduğundan ve yıkım kompleksi β-katenin aracılı transkripsiyonu sıkı bir şekilde düzenlediğinden, kısmi veya tam yokluğu çeşitli patolojileri incelemek için ilgi çekici olabilir. Örneğin, kolorektal kanserde, Wnt hiperaktivasyonu11 nedeniyle Axin2 seviyeleri nispeten yüksektir; Bununla birlikte, diğer patolojilerdeki rolü hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Axin2'nin β-kateninin bozunmasında sınırlı bir rol oynadığı düşünülse de, Wnt regülasyonundaki rolü, Wnt aracılı kolorektal kanser büyümesini bloke eden küçük bir peptitin eklenmesiyle arttırılabilir26.
Toplamda, Wnt terapötik hedefleri aracılığıyla dikkatli Wnt regülasyonu, ciddi patolojilerin başlangıcını veya gelişimini değiştirmek için fırsatlar yaratabilir ve raportör kapasitesine sahip modellerde daha fazla araştırılmalıdır. Bu raporda, akış sitometrisi ve konfokal görüntüleme için Axin2-mTurkuaz2 fare modelinin en iyi uygulama analiz yöntemimizi açıklıyoruz. Wnt dozaj seviyeleri bağlamında, çok düşük kanonik Wnt sinyalizasyon seviyelerinin tespit edilmesi zordur, bu nedenle gelişmiş algılama ve analiz yetenekleri, bu modelin faydalarından tam olarak yararlanmak için bir avantaj sağlar. Timositler, kırılgan hücre canlılıkları, düşük kanonik Wnt sinyal ekspresyonu ve Axin2-mTurkuaz2 modelinin algılama hassasiyetini temsil etmek için yoğunlaştırılmış sitoplazma alanı nedeniyle bir model sistem olarak kullanılır. Ek olarak, sitoplazmik β-katenin seviyelerini ölçmek ve raportör ile kombinasyon halinde nükleer aktif kanonik Wnt sinyalini doğrulamak için timosit hücre süspansiyonları için histolojik bir toplam β-katenin boyama prosedürü açıklanmaktadır.
NOT: Tüm fare prosedürleri, Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi (LUMC) Hayvan Deneyleri Etik Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir. Erkek ve dişi, 6-12 haftalık, vahşi tip (wt), Axin2-mTurquoise2 raportör yapısının bir eklenmesi ile ve dolayısıyla bir Axin2-murquoise2 raportör yapısının eklenmesi ile heterozigot (Tg/0) ve her iki alelde Axin2-mTurkuaz2 raportör yapısının eklenmesi ile homozigot (Tg/Tg) ve böylece iki bozulmuş Axin2 geni; Axin2-mTurkuaz2 fareler (B6; Deneylerde CBA-Axin2em1Fstl/J fareleri) kullanılmıştır. Hayvanlar, organ izolasyonundan önce CO2 ötenazi ile sakrifiye edildi. Prosedür boyunca, numunelerin ışığa maruz kalmasını en aza indirin ve aksi belirtilmedikçe her zaman buz veya 4 °C üzerinde tutun. Numuneleri alüminyum folyo ile kaplayın. Tüm adımlar biyogüvenlik kabini olan standart bir laboratuvarda gerçekleştirilmelidir.
1. Timosit hücre süspansiyonunun hazırlanması
2. Timosit akış sitometrisi hazırlığı
3. Akış sitometresi ölçümü
NOT: mTurquoise2 sinyalinin diğer birkaç florokromla kombinasyon halinde ölçülmesi, deneyin deneyim ve bilgili bir şekilde planlanmasını gerektirdiğinden, deneyimsiz kullanıcılar önce akış sitometresi eğitimi almalıdır. Akış sitometresi hakkında bilgi için Malzeme Tablosuna bakın.
4. Akış sitometrik analizi
NOT: Akış sitometrik analizi, Malzeme Tablosunda belirtilen özel yazılım kullanılarak gerçekleştirilmiştir; Bununla birlikte, başka akış sitometrik analiz programları da mevcuttur.
5. Konfokal görüntüleme için timosit sitospinlerinin hazırlanması
NOT: Timosit sitospinleri, yapışmayan hücrelerin hücre süspansiyonları ile çalışırken önerilir. Timositlerde Axin2-mTurkuaz2 ekspresyonu timus epitel hücrelerine göre daha düşük olduğu için görüntüleme için filtrelenmiş timosit hücre süspansiyonları kullanıldı.
6. Toplam β-katenin ile sitospin immün boyama
7. Konfokal mikroskobik ölçüm
NOT: Konfokal mikroskop hakkında bilgi için Malzeme Tablosuna bakın.
8. Konfokal mikroskopi analizi
Kanonik Wnt sinyalizasyonunun rolünü araştırmak için, bir Axin2-mTurquoise2 kanonik Wnt raportör modeli, β-katenin protein ekspresyonu ile kombinasyon halinde test edilmiştir. Timositlerin kırılgan olduğu, timosit olgunlaşma sürecinin çeşitli aşamalarında düşük kanonik Wnt sinyali gösterdiği ve düşük sitoplazmik/nükleer orana sahip olduğu bilinmektedir; tüm bu faktörler sitoplazmik mTurkuaz2 veya β-kateninin saptanmasını engeller. Protokolü takip ederek, murin Axin2-mTurkuaz2 timositleri timustan hasat edildi ve hem Axin2-mTurkuaz2 hem de toplam β-kateninin akış sitometrik ve sitospin konfokal analizi (Şekil 1) için tek hücreli süspansiyonlara işlendi.
Akış sitometrik analizi, aktif kanonik Wnt sinyali için raportör protein olarak hücre alt kümesi başına mTurquoise2 florokromun varlığını ölçmek için farklı timosit olgunlaşma aşamalarının karakterizasyonunu kolaylaştırır. Axin2-mTurquoise2 genotiplerinde-wildtype (wt), heterozigot (Tg/0) ve homozigot (Tg/Tg)-mTurquoise2 sinyali, çift pozitif (DP) timositler içindeki kanonik Wnt sinyalinin aktivasyon seviyesini temsil eden artan seviyelerde mevcuttu (Şekil 2). Eklenmiş bir mTurquoise2 proteini olmadığından, wt mTurquoise2 seviyeleri arka plan gürültüsünü gösterir; bununla birlikte, kanonik Wnt sinyali bu hücrelerde hala meydana gelebilir, ancak bir raportör aracılığıyla basitçe görselleştirilmez. Bununla birlikte, Axin2 genlerinden birinin (Tg/0) veya ikisinin (Tg/Tg) olmaması, kanonik Wnt sinyalleme aktivitesini etkileyebilir, çünkü Axin2, aktif kanonik Wnt sinyalini negatif olarak düzenlemek için yıkım kompleksinde önemli bir rol oynar.
Axin2-mTurkuaz2 raportör modelinin ekspresyon seviyelerini araştırmak için ortalama veya medyan floresan yoğunluğu incelenebilir. Medyan floresan yoğunluğu ve geometrik ortalama (Şekil 2C), floresan histogramları için en çok tercih edilen birinci ve ikinci grafiksel gösterimlerdir. Tg/0'a kıyasla Tg/Tg'deki Axin2 ekspresyonundaki artış, fonksiyonel Axin2'nin olmaması ve dolayısıyla işlevsiz yıkım kompleksi nedeniyle kanonik Wnt sinyalinin artan aktivasyonuna işaret eder. Kanonik Wnt sinyal yolunun aktivasyon seviyelerini daha fazla doğrulamak için, Axin2-mTurkuaz2 timositleri içinde toplam β-katenin ile bir sitospin immün boyama gerçekleştirildi. β-kateninin hücresel konumu, kanonik Wnt sinyalinin aktive olup olmadığını gösterdiğinden, nükleer veya sitoplazmik β-kateninin varlığını ölçtük.
mTurkuaz2 sitozolde eksprese edilir ve esas olarak çekirdeklerin çevresinde görülebilir (Şekil 3A'da TO-PRO-3 kırmızısı ile gösterilmiştir). Timositler çok az sitoplazmaya sahip olduğundan, tüm sinyali ölçmek için alan seçimi dikkatli bir şekilde yapılmalıdır (Ek Şekil 3). Beyaz oklarla gösterildiği gibi yanlış pozitif boyama veya otofloresan sinyaline özel dikkat gösterilmelidir. Bu floresan sinyalleri normalde hücre kalıntıları tarafından üretilir ve her ikisi de mTurquoise2 ve AF568 görüntülerinde görülebilirdi (Şekil 3B,C ve Şekil 3D,E). Boyanmamış wt kontrol görüntüleri, Axin2-mTurquoise2 raportör yapısını içermemelerine rağmen, mTurquoise2'nin bu timositlerde de görülebildiğini göstermektedir. Bu arka plan gürültüsü muhtemelen otofloresan ve timositlerdeki kompakt sitoplazmadankaynaklanmaktadır 29. Bununla birlikte, dikkatli alan seçimi ve CTCF formülü kullanılarak doğru arka plan düzeltmesi ile Şekil 3B, DP timositlerinde akış sitometrik analizinde görüldüğü gibi pan-timositlerde artan bir Axin2-mTurkuaz2 ekspresyonunu göstermektedir.
Axin2-mTurkuaz2 raportör yapısı nedeniyle hasar görmüş Axin2 geninin yıkım kompleksi üzerindeki etkisini ve dolayısıyla β-kateninin varlığını daha iyi anlamak için, timositlerde nükleer veya sitoplazmik β-katenin AF568'in ekspresyonunu ölçtük. Aktif kanonik Wnt sinyali, TCF/LEF transkripsiyon faktörleri ile etkileşime gireceği ve ardından yol aktivasyonunu azaltmak için hedef gen olarak Axin2'yi aktive edeceği çekirdeğe β-katenin göçü ile yönlendirilir. Axin2, sitoplazmik β-katenini proteazomal bozunmaya hedeflemede önemli bir rol oynayan yıkım kompleksinin bir parçasını oluşturduğundan, Axin2 proteininin yokluğu veya bozulması, nükleer ve/veya sitoplazmik β-katenin birikimine neden olabilir.
Heterozigot (Tg/0) Axin2-mTurkuaz pan-timositlerin, vahşi tipe (wt) kıyasla daha az nükleer ve sitoplazmik β-katenin ekspresyonuna sahip olduğunu gösteriyoruz, bu da β-kateninin kendisinin regülasyonunun değiştiğini gösteriyor. Bununla birlikte, homozigot (Tg/Tg) Axin2-mTurkuaz pan-timositlerde, sitoplazmik β-katenin her iki genotip arasında benzer olmasına rağmen, nükleer β-katenin wt'den daha yüksektir (Şekil 3C). Bu, toplam β-katenin seviyelerinin ölçülmesinin, proteazomal bozunmaya yönelik olmayan β-katenini spesifik olarak tespit eden fosforillenmemiş β-katenini doğrudan ölçmenin aksine, kanonik Wnt yolu hakkında ek bilgi verebileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, β-kateninin Axin2 gibi kanonik Wnt güdümlü gen ekspresyonuna doğru düzenlenmesinin, bu protokolde test edilmemiş diğer birkaç protein tarafından düzenlendiği akılda tutulmalıdır.
Şekil 1: Protokolün şematik ve basitleştirilmiş genel bakışı. (A) Hücre süspansiyonuna timus işleme, (B) akış sitometrisi protokolü, (C) sitospin düzeneği, (D) hücre içi boyama protokolü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yabani tip (wt), heterozigot (Tg/0) ve homozigot (Tg/Tg) Axin2-mTurquoise2 farelerinin akış sitometrisi analizi. (A) Axin2-mTurkuaz2 genotipine göre mTurquoise2 DP timosit geçiti ve popülasyon yer değiştirmesi ile nokta grafiğinin temsili. (B) DP timositlerinin fare genotipleri arasındaki floresan yoğunluk aralıklarını gösteren bir mTurkuaz2 histogramının temsili. (C) DP timositlerindeki Axin2-mTurkuaz2 genotiplerinin standart sapma hata çubukları ile ortalama ve medyan floresan yoğunluğunun çubuk grafik gösterimi (toplam 5 wt; 5 Tg / 0 ve 4 Tg / Tg fare). Kısaltmalar: DP = çift pozitif. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Total timosit sitospin prosedürünün konfokal görüntü gösterimi ve 1.5 yakınlaştırma faktörü ile 40x'te görüntülenen kontroller. (A) Tg/Tg (homozigot) Axin2-mTurkuaz2 timositleri, nükleer TO-PRO-3 ve toplam β-katenin AF568 ile boyanmış ve ayrıca endojen sitoplazmik mTurkuaz2 ekspresyonu. I, her üç rengin de yer paylaşımlı bir konfokal görüntüsüdür; II bir parlak alan görüntüsüdür; iii Axin2-mTurkuaz2 ve toplam β-katenin AF568 kaplamasıdır; iv bir mTurquoise2 yakın çekimdir; v, toplam β-katenin AF568 yakın çekimidir; vi, nükleer bir TO-PRO-3 yakın çekimidir. Alt panel, görüntülenen her kanal için wt boyanmamış kontrol görüntüleri içerir. Beyaz oklar, tüm görüntülerde aynı konumu temsil eder ve döküntü nedeniyle yanlış pozitif sinyali gösterir. Ölçek çubukları = 50 μm. (B) Tüm Axin2-mTurkuaz2 genotipleri için CTCF mTurkuaz2 yoğunluk değerlerinin kutu grafiği gösterimi (genotip başına 50-70 hücre). (C) Tüm Axin2-mTurkuaz2 genotipleri için (genotip başına 50-70 hücre) sırasıyla nükleer aktif β-katenin ve inaktif sitozolik β-katenin için toplam β-katenin AF568 CTNF ve CTCF-CTNF yoğunluk değerlerinin kutu grafiği temsili. Kısaltmalar: CTCF = Düzeltilmiş Toplam Hücre Floresansı; CTNF = Düzeltilmiş Toplam Nükleer Floresan; RFU = Bağıl Floresan Birimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
DN boyama paneli | Florokrom | Antikor |
FITC (Finans Finans Kurumu) | CD127 Serisi | |
PE | CD25 Serisi | |
PE-CY7 Serisi | Streptavidin (SAV) | |
APC | CD117 Serisi | |
APC-CY7 Serisi | CD44 Serisi | |
CP Başına | CD135 Serisi | |
V450 Serisi | x | |
V500 Serisi | x | |
Lin- | ||
Biotin | Ter119 Serisi | |
GR1 Serisi | ||
CD11b | ||
B220 Serisi | ||
NK1.1 | ||
CD3 (İngilizce) | ||
CD4 (İngilizce) | ||
CD8 Serisi | ||
ISP/DP/SP boyama paneli | ||
FITC (Finans Finans Kurumu) | TCRb | |
PE | TCRgd | |
PE-CY7 Serisi | CD4 (İngilizce) | |
APC | CD3 (İngilizce) | |
APC-CY7 Serisi | Streptavidin (SAV) | |
CP Başına | CD8 Serisi | |
V450 Serisi | x | |
V500 Serisi | x | |
Lin- | ||
Biotin | Ter119 Serisi | |
GR1 Serisi | ||
CD11b | ||
B220 Serisi | ||
NK1.1 | ||
1. Timositleri Biotin soy negatif (Lin-) panel ile boyayın. | ||
2. Timositleri timosit hücre işaretleyici paneli ile boyayın. |
Tablo 1: Akış sitometrisi için hücre yüzeyi karakterizasyonu antikor panelleri. İki aşamalı DN timosit boyama, iki aşamalı ISP, DP ve SP timosit boyama. Kısaltmalar: DN = çift negatif; DP = çift pozitif; SP = tek pozitif; ISP = olgunlaşmamış tek pozitif; PE = fikoeritrin; APC = allofikosiyanin; FITC = floresein izotiyosiyanat.
Ek Şekil 1: mTurquoise2 ve FITC florokrom uyumluluğu (A) Minimum spektral örtüşmeyi temsil eden mTurquoise2 (mavi) ve FITC'nin (yeşil) floresan uyarma ve emisyon spektrumları. İnce çizgiler, mTurquoise2 (405 nm) ve FITC'yi (488 nm) uyarmak için lazer çizgilerini temsil eder. Doldurulmamış eğriler, belirtilen florokromların emisyon spektrumlarını temsil ederken, doldurulmuş eğriler uyarma spektrumlarını temsil eder. Mavi, mTurkuaz2'ye karşılık gelir ve yeşil, FITC'ye karşılık gelir. Akış sitometrisi sırasında mTurquoise2 ve FITC için sırasıyla 470/20 ve 530/30 bant geçiren filtreler (emisyon spektrumlarını kaplayan gri alan) kullanıldı. (B) Axin2-mTurkuaz2 DP timositlerinin akış sitometrik analiz programı içinde, mTurkuaz2 (y ekseni) ve DP timosit karakterizasyonu için kullanılan diğer florokromlar (x ekseni) arasındaki florokrom spektral sızıntısını gösteren yazılım florokrom emisyon kompanzasyon matrisi. mTurkuaz2 ve FITC (yeşil kutu) arasında spektral kanama tespit edilmezken, mTurquoise2 ve AmCyan camgöbeği benzeri florokrom (kırmızı kutu) arasında spektral kanama problemleri tespit edildi. V450 akış sitometresi kanalı, y ekseninde comp-mTurquoise2 olarak temsil edilen mTurquoise2 florokromunu ölçmek için kullanıldı. Kısaltmalar: FITC = floresein izotiyosiyanat; DP = çift pozitif; V450 = Menekşe 450. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: mTurquoise2 pozitif hücreler geçit stratejisi için akış sitometrisi yazılım analizi iş akışı şeması. Daha iyi mTurquoise2 geçit stratejisi için dönüştürme ayarlarının ayarlanmasının adım adım açıklaması. Axin2-mTurkuaz2 Tg/Tg (homozigot) çift pozitif timosit popülasyonunun bir temsili. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Floresan yoğunluk ölçümü için görüntü analiz yazılımı iş akışı şeması. mTurkuaz2'nin CTCF hesaplaması veya aktif β-katenin-AF568'in CTNF hesaplaması için floresan yoğunluk verilerinin seçilmesi ve ölçülmesinin kademeli açıklaması. (A) Parlak alan görüntüsü; (B) bir mTurquoise2 görüntüsü; (C) nükleer TO-PRO-3 boyama; (D) toplam β-katenin AF568 görüntü. Kare kutular, CTCF ve CTNF hesaplamalarında kullanılacak arka plan sinyal alanlarıdır. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: CTCF = Düzeltilmiş Toplam Hücre Floresansı; CTNF = Düzeltilmiş Toplam Nükleer Floresan. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Farklı raportör duyarlılığına ve gerçek raportör proteinlerine sahip birkaç kanonik Wnt raportörü mevcuttur. Sentetik olarak tanıtılan multimerize TCF/LEF bağlanma bölgelerini kullanan raportör modelleri, floresan raportör proteinleri ile mevcuttur; bununla birlikte, transgenlerin bu tür tekrarları, üreme veya uzun in vivo deneyler sırasında kaybolabilir ve raportör ekspresyonunu etkileyen çevredeki genomik dizilerden gelen Wnt olmayan sinyallere duyarlı olabilir. Bu nedenle, en çok kullanılan raportör, canlı hücrelerde kullanmanın zorluğuna rağmen, eski varyant Axin2-LacZ olmaya devam etmektedir.
Axin2-mTurquoise2 kanonik Wnt raportör modeli, parlak ve nispeten kararlı bir floresan raportör proteininin basitliğine rağmen, Axin2-LacZ ile aynı raportör güvenilirliğini sunar. Bu camgöbeği varyantı floresan proteini, uzun süreli görüntüleme için yararlıdır ve en sık kullanılan antikor florokromları25 ile kolayca birleştirilebilir. Bununla birlikte, bu model29 kullanılırken 3D penetrasyon ve otofloresan ile ilgili olası sınırlamalar dikkate alınmalıdır. β-katenin nükleer stabilizasyonu kanonik bir Wnt raportör sürücüsü olduğundan, çoğu moleküler deney, aktif Wnt sinyalini doğrulamak için artan toplam veya aktif β-kateninin tespit edilmesini gerektirir. Bununla birlikte, β-katenin ekspresyonu herkesin bildiği gibi düşüktür ve tespit edilmesi zordur, bu da Axin2'nin aslında daha iyi bir belirteç olabileceği anlamına gelir. Bu protokolde, düşük floresan sinyalizasyonuna rağmen Axin2-mTurquoise2 raportör modelinin, nükleer total β-katenin-AF568'in tek hücreli timosit sitolojik boyaması ile nasıl birleştirileceğini açıklıyoruz.
Bu modelle ilgili kritik adımlar, esas olarak düşük Axin2-mTurkuaz2 ve β-katenin-AF568 ekspresyonunun uygun şekilde tespit edilmesiyle ilgilidir. Bu nedenle, bu protokol, düşük hücre canlılığına sahip olduğu bilinen ve otofloresansın artmasına neden olan timositlerde mümkün olan maksimum sinyal tespitini tanımlar. Bu, timusta fizyolojik ortam altında timosit seçimi sırasında doğal apoptoza uğrayan timositler için geçerlidir. Bu nedenle, bu hücrelerde hem Axin2-mTurkuaz2 hem de β-katenin-AF568'in düşük ekspresyonunun tespitinin gösterilmesinin, Axin2-mTurkuaz2 modelinin uygulanabilirliğini artıracağına inanıyoruz.
Güvenilir sonuçlar elde etmek için, ekipmanın uygun şekilde ince ayarına özel dikkat gösterilmelidir. Gerçek sinyal ile arka plan sinyali arasındaki ayrımı sağlamak için, akış sitometrisini ve konfokal görüntüleme ekipmanını doğru şekilde kalibre etmek için birkaç pozitif ve negatif kontrolün dahil edilmesi gerekir. Transfeksiyon kolaylığı, geniş bir yoğunluk spektrumu üzerinde kararlı durum kanonik Wnt ekspresyonu ve lityum klorür (LiCl), 6-bromoindirubin-3'-oksim veyaCHIR99021 31,32,33 gibi Wnt yolu aktive edici bileşiklere duyarlılıkları nedeniyle pozitif kontrol olarak 293T hücreleri gibi kararlı mTurkuaz2 eksprese eden hücre hatlarının kullanılmasını öneriyoruz . Uyarma, emisyon spektrumları ve floresan yoğunluğu, akış sitometrisindeki diğer florokromların spektral yayılmasına karşı telafi değerlerini veya konfokal mikroskopide algılama filtresi aralıklarının tanımını belirlediğinden, tam olarak aynı mTurquoise2 raportör proteini ile kontrollerin kullanılması son derece önemlidir.
Ek olarak, Axin2-mTurquoise2 raportör yapısının 2 katını içeren ilgili hücrelerin ikinci bir Axin2-mTurkuaz2 homozigot pozitif kontrolünün, özellikle düşük eksprese eden hücreler söz konusu olduğunda, fizyolojik olarak ifade edilen mTurkuaz2 floresan yoğunluk aralıklarına ayarlanması önerilir. Kanonik Wnt sinyallemesinin dozaja bağlı olduğu ve bunun da dalgalı raportör ifadesine yol açtığı göz önüne alındığında, lazer gücünün aşırı maruz kalmasını dışlamak, makul bir sinyal/gürültü oranı tanımlamak ve gerçek pozitif mTurquoise2 ekspresyon eşiğini tanımlamak için negatif bir kontrol gereklidir.
Akış sitometrisinde olduğu gibi, çoklu karakterizasyon belirteçlerinin eklenmesi geleneksel uygulamadır; Eşleşen florokromlar, minimum spektral yayılma ile seçilmelidir. FITC veya Alexa Fluor 488'in (AF488) mTurqoise2 raportör proteini ile kombinasyonu, bu protokolde sunulan akış sitometresi ayarında minimum spektral girişim sağlamalıdır. Her iki florokromun floresan spektrumları karşılaştırıldığında, mTurquoise2, özellikle düşük eksprese eden mTurquoise2 raportör hücrelerinde ihmal edilebilen 488 lazer (%1 verimlilik) tarafından minimum düzeyde uyarılır. Bu nedenle, timositlerde herhangi bir önemli yanlış pozitif FITC sinyali beklenmeyen bir durumdur. Konfokal mikroskopi durumunda ve özellikle önerilen konfokal ayarlarda, FITC veya AF488 florokromların kullanılması tavsiye edilmez, çünkü bir görüntü işleme yazılımında önemli sinyal karışımının çözülmesi dışında kompanzasyon olasılığı yoktur. Bunun yerine, herhangi bir spektral örtüşme sorunu olmadan düşük mTurkuaz2 ekspresyonunu tam olarak tespit etmek için AF568 gibi diğer florokromlar seçilmelidir.
Yüksek mTurkuaz2 eksprese eden hücrelerle çalışırken veya konfokal mikroskopta 440 nm'lik bir lazerin mevcudiyetine ve emisyon filtre aralığının daraltılmasına sahip olduğunda, FITC veya AF488'in kullanılması mümkün olabilir, ancak Axin2 ekspresyonunun çoğu yetişkin dokusunda düşük olduğu bilinmektedir. Protokolümüzde, β-katenin gibi düşük konjuge stabiliteye sahip proteinlerin etkili bir şekilde immün boyanmasını sağlayan, önceden etiketlenmiş iki aşamalı yüksek performanslı bir AF568 etiketleme prosedürü ile toplam β-katenin ekspresyonunu ölçtük. İmmün boyama protokolündeki adımlar, yüksek arka plan sinyali olmadan sitoplazmada veya çekirdekte gerçek pozitif β-katenini ölçmek için optimize edilmiştir. Benzer bir boyama protokolü birincil kültürlerde ve kriyokesitlerde kullanılabilir, ancak farklı hücre tipleriyle çalışırken fiksasyon adımları test edilmelidir. Axin2-mTurquoise2 modeli yalnızca bir raportör işlevine sahiptir ve bu nedenle, diğer Axin2 knock-in modelleri22 gibi hücre izleme deneyleri için yararlı olmayacaktır. Aslında, bu zarif Cre-rejoint Wnt modelleri, çevresel bağlamlarını kaybeden hücre süspansiyonları için değil, çoğunlukla doku görüntüleme deneyleri için kullanışlıdır. Axin2-mTurquoise2 modeli, genetik eklenmesi nedeniyle Axin2 gen işlevselliğini bozsa da, bu özellik Wnt terapötik hedefleri için Axin2 nakavt modellerini incelemek için kullanışlıdır.
Bir homozigot fare, yıkım kompleksinde34 β-kateninin fosforilasyonu için protein etkileşimini engelleyen Axin2 işlevselliğinden yoksundur; bununla birlikte, mTurquoise2 raportör ifadesi, kanonik Wnt sinyalinin alternatif bir yol aracılığıyla aktif kalıp kalmadığını göstermeye yardımcı olur. Dikkat çekici bir şekilde, Axin2 ayrıca Wnt ligandının bağlanması üzerine Wnt kıvırcık/LRP reseptör kompleksinde önemli bir rol oynar ve sinyal kaskad35'te başka bir ilginç Wnt düzenleme noktası sunar. Axin2-mTurquoise2 murin modelinden ayrı olarak, benzer bir raportör yapısı geçici transgenez için kullanışlıdır ve CRISPR-Cas9 teknolojisi21 aracılığıyla endojen Axin2 lokusuna özel olarak hedeflenebilir. Özetle, bu rapor, düşük Aksin2 eksprese eden timositler için Axin2-mTurkuaz2 raportör modelini analiz etmenin kolay ve sağlam bir yolunu açıklamaktadır. Bu protokol, ilaç taramaları ve fonksiyonel Wnt terapötik hedef tanımı için diğer kanonik Wnt eksprese eden hücre tiplerine uygulanabilir.
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Bu çalışma kısmen, yeni fare modelleri geliştirmek için Alan Rejeneratif Tıbbın profilini çıkarmak için Leiden Üniversitesi'nden bir hibe ile desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BD FACScantoII flow cytometer | BD Biosciences | not aplicable | Serial number V96300710. The flow cytometer setup in this protocol contains a 405 nm laser line with 505 longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 470/20 nm bandpass filter; a 488 nm laser with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 670 nm longpass filter and 655 nm longpass filter, 610 nm longpass filter, 550 nm longpass filter and 575/26 nm bandpass filter, 505 nm longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 488/10 nm bandpass filter; and a 633 nm laser line with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 685 nm longpass filter, and 660/20 nm bandpass filter. |
BSA | Sigma | A9647 | |
Corning 70 μm cell strainer | Falcon/Corning | 352350 | |
Cytospin 4 Type A78300101 | Thermo Scientific | not aplicable | |
DMSO | Sigma Aldrich | D5879-1L | |
DNAse I | Sigma | A9647 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
Falcon round-bottom Polystyrene Test tubes with cell strainer snap cap | Fisher Scientific | 352235 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Greiner Bio-One B.V. | not aplicable | Depends on origin |
Fiji software | ImageJ | not aplicable | Version 1.53 |
Filter card white (for cytospin) | VWR | SHAN5991022 | |
FlowJo 10 software | Treestar | not aplicable | Version 10.5.3 |
Frost slides | Klinipath | ||
Gibco IMDM medium | Fisher Scientific | 12440053 | |
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL lens | Leica microsystems | not aplicable | |
Hydrophobic pen: Omm Edge pen | Vector | not aplicable | |
Leica TCS SP5 DMI6000 | Leica microsystems | not aplicable | The microscope setup in this protocol consisted of an HCX PL APO 40x/1.2 oil-immersion objective with 8-bit resolution, 1024 pixels x 1024 pixels, 400 Hz speed, pinhole 68 µm, and zoom factor of 1.5 at room temperature. This system contains a 405 diode laser, argon laser, DPSS 561 laser, HeNe 594 laser and HeNe 633 laser with 4 hybrid detectors (HyDs) and 5 photomultiplier tubes (PMTs). |
Methanol | VWR | 1060091000 | |
NaN3/sodium azide | Hospital farmacy | not aplicable | |
Normal mouse serum | Own mice | not aplicable | |
PBS | Lonza | BE17-517Q | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36965 | |
Purified mouse anti-β-catenin (CTNNB1) | BD Biosciences | 610154 | |
TO-PRO-3 Iodide | Thermofisher | T3605 | |
Transparent nailpolish | at any drugstore | not aplicable | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ml | |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 labeling kit | Thermofisher | Z25006 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır