Method Article
Bu protokolde, konjenital kalp defektleri ile ilişkili farelerde gelişimsel fenotipleri nitel ve nicel olarak analiz etme prosedürlerini açıklıyoruz.
Konjenital kalp defektleri (KDE) insanlarda en sık görülen doğum kusuru türüdür ve tüm canlı doğumların %1'ini etkilemez. Ancak, CHD için altta yatan nedenler hala kötü anlaşılmaktadır. Gelişmekte olan fare CHD çalışması için değerli bir model oluşturmaktadır, fareler ve insanlar arasında kardiyak gelişim programları son derece korunur çünkü. Protokol, istenilen gebelik evresinde fare embriyolarının nasıl üretilebildiğini, kalbi aşağı işleme için izole etme ve koruma yöntemlerini, histoloji ile yaygın chd türlerini belirlemek için nicel yöntemlerin (örn. ventriküler septal) nasıl üretilmelerini ayrıntılı olarak açıklar. defektleri, atriyal septal defektler, patent ductus arteriosus) ve ortak kas sıkıştırma fenotiplerini ölçmek için kantitatif histomorfometri yöntemleri. Bu yöntemler, bilim adamlarının CHD'yi doğru ve tekrarlı bir şekilde ölçmelerine olanak tanıyan numune hazırlama, toplama ve analiz ile ilgili tüm adımları ifade edeyim.
KDE'ler insanlarda en sık görülen doğum kusuru türüdür ve doğum kusuruna bağlı ölümlerin önde gelennedenidir 1,2,3,4,5,6. Yenidoğan çocukların yaklaşık% 90 ChD hayatta olmasına rağmen, sık sık hastalarınyaşamları ve sağlık sistemi7,8,9,10ağır bir yük empoze, yıllar içinde önemli morbidite ve tıbbi müdahaleler ile ilişkilidir. Tamamen genetik faktörlerin dışında, KCHD nedenleri kötü anlaşılmaktadır4. Tanımlanamayan nedenler Amerikan Kalp Derneği ve diğer kaynaklara göre tüm CHD olgularının ~ 56-66% için hesap2,3,4,11. Bilinen faktörler genetik mutasyonlar, CNVs, de novo tek nükleotid varyantları ve aneuploidi içerir. Bu çevresel ve diyet faktörleri de CHD katkıda önemli kaynaklar olduğundan şüphelenilmektedir, anne yaşam tarzı bağlayan epidemiyolojik çalışmalar tarafından önerilen2,12, ekonomik yoksunluk, ve ırk13, ve folik asit gibi diyet faktörleri içine araştırma tarafından11,14 ve biyoaktif lipid retinoik asit15,16. KCHD ve diğer kardiyovasküler defektlerin mekanizmaları ve nedenlerini araştırmak önleyici stratejiler ve yeni tedavi seçenekleri1,4,17,18,19geliştirmek için önemlidir.
Gelişmekte olan fare memelilerde CHD eğitimi için bir mihenk taşıdır modelidir. Ancak, kalp morfolojisini koruyan diseksiyonlar, gelişimevrelerinin analizi ve ChD ile ilişkili kusurların belirlenmesi gibi bazı yöntem ve analizler, murine kalpanalizinde yeni olan bilim adamları için yıldırıcı olabilir. Bu protokolde açıklanan yöntemlerin amacı, bu süreçler için nitel ve nicel yönergeler sunmaktır. Böylece, bu protokolde istenilen gebelik evresinde embriyo üretmek için zamanlanmış mikatların nasıl yapılacağını, sağlam kalp iyileşmesi için gebe leri nasıl inceleyeceğimizi (çıkış yolu gibi ilişkili dokular dahil), kalp fiksasyonu ve kriyostat kesit, temel histoloji yöntemleri, ortak kalp defektlerinin nicel analizleri ve kalp kası sıkıştırmasının nitel analizi, bazı KH türlerinin ortak öncüfenoti.
Bu makalede atıfta bulunulan deneylerde kullanılan tüm hayvanlar Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) hayvan bakım yönergeleri kullanılarak tedavi edildi.
1. Embriyo üretimi için C57BL6/J farelerinin zamanlı kenetlemesi
2. Kalp iyileşmesi için kadın ve embriyoların diseksiyonu
3. Doku hazırlama
NOT: Dokular OCT (optimum kesme sıcaklığı) katıştırma veya parafin katıştırma kullanılarak hazırlanabilir. Her iki yöntemin de avantajları ve dezavantajları vardır ve hangi katıştırma yönteminin kullanılacağına karar verirken analizin amacı göz önünde bulundurulmalıdır.
4. OCT gömülü dokular için cryostat kesit
5. Parafin gömülü dokular için mikrotom kesit
6. Dokuların deparafinizasyonu
7. Hematoksilin ve eozin boyama
8. Ortak kalp defektlerinin nitel analizi
9. Hematoksilin ve eozin lekeli dokular kullanılarak kardiyak kas komponentititesinin kantitatif analizi
Kas sıkıştırma indeksi iki farklı ortam, bir kontrol ve deneysel bir grup altında gelişen kalpler arasında karşılaştırıldı. Bu protokoller, istatistiksel analize izin veren kas dokusunun sıkıştırmasını kantitatif olarak analiz etmek için kullanılmıştır. Kas sıkıştırma deneysel olmayan koşullarda geliştirilen embriyolara göre deneysel kalplerde önemli ölçüde azalmış olduğu gösterilmiştir.
Gözlem zamanlaması yanlış görünüyorsa embriyolar atılırdı. Embriyoların bodur büyüme denemenin tedavisinin bir sonucu olabilir rağmen, ve gelişimsel ilerleme bir dizi var, üreme yeterli embriyo gelişiminin zamanlaması sağlamak için aralıklı oldu. Embriyoların evreleme Theiler Evreleme21kullanılarak yapıldı. Örnekler, dilimler tutarlılığı yansıtmıyorsa veya belirgin yırtıkları veya kıvrımları varsa kötü dilimlenmiş olarak kabul edilir. Boyama doku kenarları yapmak için yeterli kontrast sağlanan, ancak hücre özellikleri ayırt edilemez hale getirmek için çok karanlık değildi. Slaytlar daha sonra 40x hedefi ile ters bir mikroskop ile görüntülendi. MCI değerleri ImageJ yazılımı ve Microsoft Excel kullanılarak hesaplandı. Bu MCI değerleri T-testi kullanılarak analiz edildi.
Şekil 1: C57BL6/J farelerde fiş tahkikat sonuçları. (A) Kolayca tanımlanabilir çiftleşme fişi olan bir fare. (B) Çiftleşme fişi olmayan bir fare. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yaygın kalp kusurları. Konjenital kalp defektinin gerçek beklenen morfolojisinin şemaları. (A) Ventriküler septal defektin enine görünümü. (B) Atriyal septal defektin enine görünümü. (C) Patent ductus arteriosus. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hematoksilin ve eozin lekesi e15.5 kalpleri. (A) Normal şartlar altında gelişen lekeli bir kalp. Ölçek çubuğu = 750 μm. (B) Deneysel koşullar altında gelişen lekeli bir kalp. Ölçek çubuğu = 750 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Normal anne diyetleri altında gelişen kalpler ile esansiyel yağ asidi eksikliği anne diyetleri altında gelişen kalpler arasındaki kas sıkıştırmasının kantitatif analizi. (A) Hematoksilin ve eozin lekeli kalpler makroskopik (5x) görünümünde. Ölçek çubukları = 1.000 μm. (B) Hematoksilin ve eozin mikroskobik görünümde kalpler lekeli (40x). Ölçek çubukları = 75 μm. (C) Kas Sıkıştırma İndeksi ölçümlerinin ortaya çıkan verileri. Değerler bir T-testi (tedavi grubu başına n = 4) kullanılarak analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, embriyonik kalplerde kardiyak gelişimanalizinde yer alan teknikleri inceler. Bu yöntemin bazı sınırlamaları, pratik gerektirebilir hazırlık teknikleri için gerekli fiziksel el becerisi ve mikroskop görüntüleme ile beceri vardır. Kriyostatta elde edilen dilimler dağınıksa, hematoksilin ve eozin boyama net olmayacaktır veya mikroskopta çekilen görüntülerde kötü Aydınlatma varsa, ImageJ ile kullanılan yöntem çalışmaz. ImageJ yazılımının eşik özelliğinin bir sınırlaması, piksel değerine bağlı bir eşiğin bir ucunda bulunan pikselleri seçmesidir. Bu nedenle, eşiğin yanlış tarafında bulunan pikseller hesaplamaya yanlış dahil edilir veya dışlanır. Sonuç olarak, bir çalışmada kullanılmak üzere protokollerin benimsenmesi için sorun giderme gerekli olacaktır.
Kalp çıkarma nın çok zor olması durumunda, adım 2.8'e atlamayı düşünün. Ayrıca, göğüs boşluğundan sadece kalp ve akciğerler daha fazla çıkarmadan düşünün. Hedef daha sonra daha büyük ve işlemek daha kolay hale gelir ve kalp ve ince forseps arasında doğrudan temas en aza indirilir. Kriyostat kesitler, deneysel numuneler her zaman doğrudan kontrol örnekleri ile karşılaştırılacaktır. Bu, hata tüm örneklerde tutarlı olduğu sürece kullanıcı hatası için bazı oda sağlar. Kullanıcı hatasını en aza indirmek ve yanlış sonuçları önlemek için, her iki tedavi grubundan da karşılaştırılabilir bölümler elde edildiklerinden emin olun. Örneğin, birden fazla kişi bölüm üretiyorsa, tek bir kişinin yalnızca bir alt grup değil, kontroller ve tüm tedavi grupları için eşit sayıda bölüm ürettiğinden emin olun. Son olarak, ImageJ'de görüntüleri eşiğibelirlerken, eşik aracı, doku ve olmayan pikselleri temsil eden pikselleri seçerken maksimum özgürlüğe izin vermek için kullanılır. Gerekirse, dokunun piksel değerinden arka planın piksel değerini daha da yoğunlaştırmak için görüntülerin karşıtlığını ayarlayın. Sorun giderme seçenekleri olmasına rağmen, teknikler hala yüksek derecede beceri gerektirir. Ancak, bu protokolün gerçekleştirilmesi, diğer kardiyak gelişimsel araştırma çalışmalarında genellikle ölçülmeyen verilere erişim sağlar. Bu nedenle, bu protokolün özelliklerinden yararlanarak bilimsel bir araştırmaya önemli bir katkı sağlayabilir.
Kardiyoloji araştırmalarında deneysel tedavilerin etkilerinin belirlenmesi genellikle morfoloji değerlendirmesi ile araştırılmaktadır. Bu özellikle gelişim biyolojisinde plasentanın gelişmekte olan kalplerin fizyolojik özelliklerinin ölçülmesini zorlaştırdığı durumdur. Bu nedenle, kalbin işlevine ışık veren morfolojik analiz, gelişimbiyolojisi araştırmalarının yörüngesini önemli ölçüde değiştirir. Çoğu kağıt kalbin gücünü belirlemek için kalp kasının kalınlığını analiz rağmen, kas sıkıştırma doğrudan ölçüm gelişmekte olan memeli kalp fizyolojisi içine daha fazla fikir sağlayabilir25,26,27.
Yazarların bildirecek bir açıklamaları yok.
Aguirre Lab Ulusal Kalp tarafından desteklenir, Akciğer, ve Kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri ödül numarası K01HL135464 altında ve Amerikan Kalp Derneği tarafından ödül numarası 19IPLOI34660342 altında.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
ImageJ Software | ImageJ | ||
Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
Paint Brushes (at least 2) | |||
Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır