ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית

בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליכים באיכות ובכמת לנתח פנוטיפים התפתחותיים בעכברים הקשורים למומים מולדים לב.

מומים לב מולדים (CHD) הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם מולד בבני אדם, המשפיעים על 1% של כל לידות חי. עם זאת, הסיבות הבסיסיות ל-CHD עדיין מובנות בצורה עלובה. העכבר המתפתח מהווה מודל חשוב למחקר של CHD, מכיוון תוכניות התפתחותיות לב בין עכברים ובני אדם הם שמרו במידה רבה. הפרוטוקול מתאר בפרוטרוט כיצד לייצר עוברי העכבר של שלב ההיריון הרצוי, שיטות לבידוד ולשמר את הלב עבור עיבוד במורד הזרם, שיטות כמותיים כדי לזהות סוגים נפוצים של CHD על ידי היסטולוגיה (g., במחיצה הבין-חדרית פגמים, פרפור מומים בעלי גביע, כמותי מסוג דוטוס, ושיטות כמותית למדידת הפנוטיפים השכיחים של השרירים. שיטות אלה לבטא את כל השלבים המעורבים הכנה לדוגמה, איסוף, וניתוח, המאפשר למדענים למדוד בצורה נכונה מחקר CHD.

Chds הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם הלידה בבני אדם הם הגורם המוביל של לידה מוות פגמים הקשורים^1,2,3,4,5,6. למרות כ 90% של הילדים היילוד לשרוד CHD, הוא משויך לעתים קרובות עם תחלואה משמעותית התערבויות רפואיות במהלך השנים, הטלת נטל כבד על חיי החולים ומערכת הבריאות^7,8,9,10. מחוץ לגורמים גנטיים גרידא, הגורמים ל-CHD מובנים בצורה עלובה⁴. לא מזוהה גורם לחשבון של ~ 56-66% של כל המקרים CHD על פי איגוד הלב האמריקני ומקורות אחרים^2,3,4,11. גורמים ידועים כוללים מוטציות גנטיות, CNVs, דה נובו נוקלאוטיד יחיד משתנים, ו aneuploidy. הוא חשד כי גורמים סביבתיים ותזונתיים הם גם מקורות חשובים לתרום CHD, כפי שהוצע על ידי מחקרים אפידמיולוגיים קישור אורח חיים אימהי^2,12, מחסור כלכלי, ומרוץ¹³, ועל ידי מחקר לתוך גורמים תזונתיים כגון חומצה פולית^11,14 ואת חומצה retinoic השומנים הביואקטיבית^15,16. חקירת מנגנונים וגורמים של מומים וכלי דם אחרים חשוב לפתח אסטרטגיות מניעה ואפשרויות הטיפול הרומן^1,4,17,18,19.

העכבר המתפתח הוא דגם אבן פינה ללימוד CHD ביונקים. עם זאת, חלק מהשיטות והניתוחים המועסקים, כגון ניתוח שמירה על מורפולוגיה של הלב, אנליזה של שלבים התפתחותיים וזיהוי של פגמים משויכים ב-CHD, יכולים להרתיע מדענים החדשים לניתוח לבבות מורתיים. מטרת השיטות המתוארות בפרוטוקול זה היא להציע קווים מנחים איכותיים וכמותיים לתהליכים אלה. כך, בפרוטוקול זה אנו מסבירים כיצד לבצע מצות מתוזמן כדי לייצר עוברים בשלב ההריון הרצוי, לנתח נשים הרות להתאוששות לב שלמה (כולל רקמות הקשורות כגון מערכת הזרימה), קיבעון לב והכנה ל קריוסטט התגובה, בסיסי שיטות היסטולוגיה, ניתוחים כמותיים של מומים לב נפוצות, ניתוח איכותני של compaction שריר הלב, הקודמן משותף פנוטיפים לסוגים מסוימים של CHD.

כל בעלי החיים המשמשים את הניסויים המוזכרים במאמר זה טופלו באמצעות הנחיות לטיפול בעלי חיים של המדינה מישיגן טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השימוש (IACUC).

1. מתוזמן ההזדווגות של עכברים C57BL6/J לייצור העובר

1. ברגע שעכברים הגיעו לגיל הרבייה (6-8 שבועות), לשים אותם יחד ב הרמון בפורמט הרבייה (כלומר, שתי נקבות לכל גבר אחד). הגדר אותם להתרבות. מתישהו בשעות אחר הצהריים או הערב
   הערה: עכברים לעתים קרובות להתרבות בתוך 1 h אחרי האורות כבויים בתוך מתקן הדיור שלהם. יש לפרש את הנקבות מהתרבות בערך 6-8 חודשים ולזכרים יש להשתמש לא יאוחר מגיל 12 חודשים.
2. אם נעשה שימוש בשיטת השקילה כדי לקבוע הפריה, עכברים מתרבים בקבוצות גדולות, מכיוון ששיטת השיקול גורמת להזדווגות מתוזמנת להמשיך בקצב איטי יותר מאשר שיטות שבהן רק אטמי הזדווגות מנוטרים.
3. למחרת בבוקר, בדוק אם יש אטמי הזדווגות מתישהו בין השעות 08:00 ל-12:00. ודא שפעולה זו מתבצעת במועדים הנכונים. אם שיטת החיבור מבוצעת מוקדם יותר מ-8 בבוקר, יש סיכון שהתקע יהיה עמוק מדי בתעלת הנרתיק כדי שניתן יהיה לצפות בה. אם שיטת החיבור מבוצעת מאוחר יותר מ-12 בבוקר, קיים סיכון של התקע שנפל.
   1. תפוס את הנקבה על ידי בסיס הזנב ולחקור את הפתח לתעלת הנרתיק עם שימוש של טיפ מיקרופיפטה. תקע הזדווגות ייראה כמו מחסום רירית (איור 1א), אשר עשוי להיות קצת קשה לראות במקרים מסוימים. הסרטנים גם מעיד על כך שתקע הזדווגות הוא או היה נוכח. אם לא קיים מחסום מוסכי (איור 1ב) אז כנראה שהנקבה לא הזדווג. או שתקע הזדווגות כבר היה יכול ליפול
   2. לפנות בוקר של הזדווגות כמו e 0.5.
      הערה: עם C57BL6/J עכברים, אטמי הזדווגות יכול להיות קשה לזהות. לכן, לעיתים העכברים הזדווג אף על פי ששום חיבור לא נצפה. הזדווגות לא תמיד. מובילה להתעברות זה סביר יותר לעתים קרובות C57BL6/J עכברים. לכן, הצג התקדמות במשקל כדי לאשר הריון (ראה שלב 1.4). המשקל יכול לעזור לזהות נקבות בהריון ולאשר כי התקעים הובילו ההתעברות. היזהרו כאשר ההזדווגות נקבות ללילות רצופים. אם זכר מסוים נחשב לטוב בהפקת תקע של הזדווגות, ניתן לסמוך על זכר זה להזדווג בלילות רצופים עם אותה נקבה.
   3. זכור כי הסיכויים של ההריון הם גבוהים יותר עם עכברים כי הם הוכיחו מגדלים, כפי שהם התרבו בהצלחה לפני. כדי להגדיל את הסיכויים של הוכחת מגדלים, הזכרים בשימוש לא צריך להיות זקן מדי.
4. בעקבות שיטת החיבור, שוקלים את הנקבות. במשקל זה יש לעקוב 7-10 ימים לאחר מכן. אם העלייה במשקל עולה 1.73 g, אז העכבר כנראה בהריון²⁰. אם העלייה במשקל היא מתחת 1.73 g, סביר להניח שלא קשור ההריון ואת העכבר צריך להיות מחדש הציג את אוכלוסיית הרבייה.
   הערה: C57BL6/J עכברים לייצר ליטות קטנות (חמישה עד שישה עוברים בממוצע). שוקלים בשיטות כדי לקבוע הריון הם מדויקים עבור רוב. שימוש בשיטה זו מספק 12.8% שיעור חיובי שווא ולא יכלול 3% של נקבות כי הם בעצם בהריון²⁰. אם החוקר הוא מודאג כי זמן ההיריון הרצוי הוא מאוחר יותר, המשך לשלב 1.5
5. אופציונלי: ביום שבו הניתוח יתקיים, ודא כי ההריון התקדם על ידי בדיקה גופנית. תפוס את הנקבה על ידי בסיס הזנב ולמתוח את הגוף החוצה. זה הקלה ביותר לעשות על ידי הצבת העכבר על פרק כף היד ומושך בעדינות את בסיס הזנב. אם הנקבה בהריון, אז סביר להניח יהיה לעלות במשקל במיוחד בגוף התחתון, וזה יופיע כמו גושים קטנים.
   הערה: הריון יכול להיות מוחשי מוקדם כמו e 12.5 ויהיה מוחשי על ידי e 14.5 ברוב המקרים. C57BL6/J עכברים יש גדלים קטנים, ולכן הנקבה עשויה להיות בהריון גם אם אין סימנים פיזיים.

2. חיתוך נקבות ועוברים להתאוששות הלב

1. לפני תחילת הניתוח, הכינו את הפתרונות הבאים בטמפרטורת החדר.
   1. התמוססות את החומצה האטילבית (EDTA) לתמיסת מלח באגירה ב0.5 מ"מ.
      הערה: לאחר ההכנה, עדיף לשמור על הפתרון בקרח ולהשתמש בו רק ב -4 ° c. אם זיהום הוא חשש, זה צריך להיות מידי לפני השימוש.
   2. התמוססות פאראפורמלדהיד (בכיוון ההפוך) לערוץ הPBS בריכוז של 4%.
      הערה: לאחר ההכנה, עדיף לשמור על הפתרון בקרח ולהשתמש בו רק ב -4 ° c. אחסן ב-4 ° צ' או קר לאחסון לטווח ארוך. ריכוז הפתרון הבספיאלי יכול להשתנות בהתאם לאפליקציות המטה של דגימות הרקמה. אחוז זה משמש עבור המטאוקסילין ואאוזין כתמים, אימונוהיסטוכימיה, וכתמים מאימונולאומורסטילי.
2. לאחר הנקבה הגיע לשלב הריונית הרצויה, העכבר צריך להיות מורדמים בשעה הנכונה של היום על פי הנחיות מאושרות של השימוש בעלי חיים. אם התזמונים הם בחצי היום (לדוגמה, e 15.5) יש להקריב אותם קרוב ל-12:00. אם התזמונים נמצאים בימים שלמים (לדוגמה, e 24.2) יש להקריב אותם קרוב ל-12 בבוקר.
   הערה: המערכת מניחה שההריון מתרחש במהלך הלילה בזמן שהעכברים משויכים. עם זאת, קשה לקבוע את הזמן המדויק של ההתעברות. עקב כך, העיתוי מוערך, לא מדויק.
3. לאחר הצמדת ארבע הגפיים, בזהירות לעשות חתך בצורת I לאורך הגוף, החל מסביב השופכה למעלה לעבר עצם החזה.
4. סביר להניח שהרחם יהיה ממוקם ממש מעל אזור האגן. רחם העכבר הוא בצורת Y; לכן, סביר להניח שיהיה ארוך מאוד ועטוף סביב הגוף. הסר אותו על-ידי הסרתו העדינה. לעשות את זה באמצעות הצדדים של מלקחיים עדינים בתנועה סקופינג. רקמות שטחיות של הרחם ניתן לתפוס בזהירות רבה על ידי קצות מלקחיים עדינים כאשר בתחילה מושך את הרחם החוצה. השימוש במספריים כדי לחתוך את הרחם מהגוף.
   הערה: שמירה על בצורת Y יוצא דופן של הרחם, לוודא את הרחם כולו מוסר.
5. משרים את הרחם ב-PBS קר הקרח. הצמד קצה אחד של הרחם למטה ומתח אותו לשורה אחת.
6. חותכים את הרחם למקטעים, כל מקטע המכיל עובר נפרד. לקלף בעדינות את העובר עם מלקחיים עדינים. זה הכי קל לעשות עם זוג מלקחיים בכל יד. לאחר שהוסר, הנח את העובר מיד לתוך צלחת פטרי חדשה מלאה בתמיסת PBS-EDTA ב -4 ° c.
   הערה: ניתן להשתמש גם בפתרון ה-PBS הרגיל, אך ה-EDTA מונע קרישה בדגימות.
7. לשלב את העוברים באמצעות התלר אחסון מזמני²¹. בגלל שהיערכות יכולה להשתנות בין עוברים בתוך המלטה האחת, לשלב כל עובר בודד.
   הערה: זה יכול גם לספק ראיית החזון ליקויים מולדים הלב האפשרי של העוברים. בדרך כלל, סימפטומים של מום לב מולד ניתן לצפות במבנה העובריים. פגמים גדולים אחרים הקשורים לעיתים קרובות עם מצבים לב מסוימים יכול להיות נוכח.
8. ניתן להסיר את הלב במגוון דרכים, תלוי בגיל העובר.
   הערה: אם לא ברור אם מערכת הזרימה היוצאת ללא פגע במהלך ההסרה, יש להסיר יותר רקמות מאשר הלב הבלעדי (שמירה על מערכת הזרימה בשלמותה ומזעור המגע הישיר בין הלב לבין הלקחיים) או לנתח את כל העובר.
   1. באמצעות טווח הניתוח ושני זוגות של מלקחיים עדינים, למקם את העובר על גבו ולייצב את הגישה לחזה. זה יכול להיעשות על ידי הצמדת הזרועות למטה עם מלקחיים או הסרת הזרועות והחזקת הגוף בעמדה.
   2. השתמש בנקודה חדה של זוג שני של מלקחיים עדינים כדי לבצע חתך לאורך עצם החזה של העובר ולהאריך בין הבריח אל הטבור. להתחיל על ידי הפיכת חתכים בסדר מאוד שטחי בהדרגה לעבוד לכיוון הפנימי של חלל החזה. הלב פשוט צריך להיות. בקושי נראה לעין אל תיצור קשר עם הלקחיים. במהלך החתכים השטשנים האלה
   3. לקלף את כלוב הצלעות לפתוח באמצעות זוג הראשון של מלקחיים כדי לסחוט בעדינות על הגוף של העובר, מעט caudal אל כלוב הצלעות. הלב צריך לצוץ או להיות מתברר. ייתכן שהלב ידרוש. משהו עדין לצאת ממנו השתמש בצד של מלקחיים, וודא כי הנקודה של הלקחיים לעולם לא בא במגע עם הלב. כדי לשמור על מרחב העבודה ואת הלקחיים נקי, לשמור על מנגב נטול סיבים בקרבת מקום.
   4. בעדינות לתפוס את כלי הדם הריאתי עם הצדדים של מלקחיים, מוודאים לא לנתק את הרקמה, ולמשוך את הלב מתוך חלל החזה. . אז תנקה את הלב
      הערה: עבור עוברים e 13.5 וצעיר יותר הלב מכוסה בקרום הלב. יש להסירו על מנת להגיע ללב.
9. באמצעות סטריאוסקופ, צלם את הלב להמשך התייחסות.
10. לשטוף את הלבבות בפתרון PBS-EDTA עבור 1-2 דקות, ולאחר מכן למקם אותם לתוך 4% הפתרון הכבלייתי עבור כ 45-60 דקות לתקן אותם. אם יש צורך בניתוח של העובר כולו, יש לטבול את הלילה. כמות הנפח של הפתרון ההכדורגלן צריכה להיות 5-6x הנפח של הרקמה הקבועה.
    הערה: זמן הדגירה יכול להשתנות בהתאם למחקרים מאוחרים יותר. זמן הדגירה משמש למטאוקסילין ולאאוזין, אימונוהיסטוכימיה, וכתמים מוחיסורים.
11. רחץ 5-10 דקות עם 3x PBS-גליצין ומקום חזרה ב-PBS. נתרן אזיד או פניצילין/סטרפטומיצין ניתן גם להוסיף כדי למזער את הצמיחה חיידקים ולשמר רקמות שלמות. כעת ניתן לאחסן את הלבבות לטווח קצר ב-4 ° c.

3. הכנת רקמה

הערה: ניתן להכין רקמות באמצעות OCT (טמפרטורת חיתוך אופטימלית) או הטבעה של פרפין. יש יתרונות וחסרונות לכל אחת מהשיטות ומטרת הניתוח צריכה להיחשב בעת החלטה באיזו שיטת הטבעה יש להשתמש.

1. הטבעה של OCT
   הערה: שיטה זו עשויה להיות עדיפה על הטבעה של formalin/פרפין, מכיוון שהקריודורים שומרים על פעילות מחודשת אנטיגן, עדיין ניתן להשתמש בהם למטאוקסילין ולאאוזין, ולייצר פרוסות מהר יותר.
   1. הכינו פתרון של סוכרוז מומס ל-PBS בריכוז של 30% (w/v).
   2. להעביר את הרקמות לצינור חדש 15 mL או שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכיל PBS-30% סוכרוז. . בהתחלה, הרקמה תצוף
   3. מניחים אותו ב -4 ° c במקרר. הרקמה תהיה מוכנה להטבעת OCT כאשר הוא שוקע לתחתית הצינור, בדרך כלל 24-40 h.
      הערה: רקמות שרירים סובלות באופן משמעותי במהלך הקפאה/הפשרה של מחזורים ולאבד מורפולוגיה מקורית שלהם. סוכרוז נספג על ידי הרקמה ועובד כסוכן הקפאה המאפשר שימור משופר של המבנה. ודא כי יש מספיק פתרון בצינור עבור צף של רקמות להיות מנוטרים מספיק. ב-PBS-סוכרוז מזוהמים בקלות בחיידקים, ולכן יש לבדוק את הפתרון לעתים תכופות, המעיד על גידול פטרייתי או בקטריאלי. כדי למזער את הסיכון לזיהום או פניצילין/סטרפטומיצין או נתרן אזיד ניתן להוסיף לפתרון PBS-סוכות.
   4. הסירו את ליבם של הפיפטה הפסטר, ודאו שפתח הפיפטה רחב דיו כדי לא לקרוע את הרקמה. חותכים את הפיפטה עם מספריים במידת הצורך. אם לעבוד עם עוברים שלמים, להשתמש מלקחיים כדי לאחזר את הדגימה.
      הערה: עשה זאת בעדינות. גם אם פתיחת הפיפטה רחבה מספיק כדי להחזיר את הלבבות, הקצוות של הפיפטה עדיין יכולים לקרוע את הרקמות. מלקחיים יכולים להסיט את דגימות. הרקמה אם משתמשים באגרסיביות
   5. הניחו לרקמה להתייבש באוויר על מגבון נטול מוך. מניחים את המדגם בתבנית OCT במיקום הרצוי לחיתוך (כלומר, משונן, רוחבי, מקורילי). הוסף את מתחם OCT עד שהמדגם יהיה שקוע לחלוטין, וודא שאין בועות במגע עם הרקמה.
   6. הניחו את העובש ב-20 ° c ללילה או מספר ימים ולאחר מכן הזיזו את התבנית ל-80 ° c. לאחר 24 שעות העובש מוכן להקפאה. רקמות בפורמט זה ניתן לאחסן לטווח ארוך.
2. פרפין
   1. באמצעות אתנול, מייבשים את הרקמות ברצף זה: 50% אתנול עבור 10 דקות, 70% אתנול עבור 10 דקות, 80% אתנול עבור 10 דקות, 95% אתנול עבור 10 דקות, 100% אתנול עבור 10 דקות (לעשות את זה 3x).
   2. להשרות את הרקמות בסדרה של האתנול/מענה פתרונות ברצף זה: 2:1 אתנול/קסילן פתרון עבור 10-15 דקות, 1:1 אתנול/קסילן פתרון עבור 10-15 min, 1:2 אתנול/קסילן פתרון עבור 10-15 דקות, 100% קסילן עבור 10-15 דקות (לעשות את זה 3x).
   3. כדי להחליף את הקסילן עם פרפין, להשרות את הרקמות בתנור ואקום (להגדיר בין 54-58 ° c) ברצף זה: 2:1 קסילן/פרפין פתרון עבור 30 דקות, 1:1 קסילן/פרפין פתרון עבור 30 דקות, 1:2 הפתרון קסילן/פרפין עבור 30 דקות, 100% פרפין עבור 1-2 h, 100% פרפין עבור 1-2 h או לילה.
      הערה: חימום הרקמות מעבר 60 ° צ' לפרקי זמן ארוכים יגרמו לפולימרים של הפרפין לבזות ולהפוך את הרקמה לפריכות.
   4. באמצעות פרפין טרי, להטביע את הרקמות במיקום הרצוי.

4. קריוסטט הקפאה עבור רקמות מוטבעות OCT

1. בקריוסטט, מניחים את כל הדגימות בתוך מינימום של 1 h אם הדגימות אוחסנו בעבר במקפיא-80 ° c. עליהם להישאר שם עד שכל המקטעים ייאספו.
2. ודא שה-קריוסטט מוגדר בהגדרות הטמפרטורה המתאימות. הטמפרטורה הסביבתית בתוך תא קריוסטט צריכה להיות כ-20 ° c והזרוע של הקריוסטט אמורה להגיע בסביבות ה-24 ° c.
   הערה: טמפרטורה זו עשויה להשתנות בהתאם לאופן שבו הבלוק מגיב לחיתוך. אם פריסה לא עקבית היא בעיה, הטמפרטורה של הסביבה יכולה להיות מונמכת.
3. הסר את בלוק OCT מהעובש שלו על ידי משיכת בקצות הצד הפתוח של העובש כדי לשחרר אותו ולאחר מכן צובט את הבלוק בסוף סגור, שם העובש מצמצמת.
4. כדי לטעון את בלוק ה-OCT, הצב את טמפרטורת החדר ב-OCT על הצ, החל מהאמצע ופועל עד הקצה. . כל צ'אק לא צריך להיות מכוסה
5. מניחים את בלוק OCT (ראו שלב 3.1) על העובש. הקצה של הבלוק שהיה נגד הצד הסגור של העובש צריך להיות מול הצ. אפשר הטה א על צ'אק להקפיא עד שהוא אטום לבן, כ 5-10 דקות.
6. מניחים את צ ' אק על הזרוע עבור עוד 5-10 דקות לחסום לבוא לטמפרטורת הזרוע. כדי לקבל פרוסה מקבילה, התאימו את הזרוע עד שקצה הבלוק מקביל לשלב וקיים מרחק רב בין השלב והקצה התחתון של הבלוק הוא זהה לשלב ולקצה העליון של הבלוק.
7. הכנס את הלהב וכוונן את מרחק הבלוק מהלהב כדי לקחת מקטעים.
8. לקחת פרוסות בעובי של 10 μm. המשך לחתוך עד שנקודת העניין תגיע באופן ידני או באמצעות פונקציית החיתוך.
9. לאיסוף פרוסות, השתמשו במכחול שטוח קטן ובמברשת מפורטת. כשהעובש מתחיל להיות חתוך, השתמש במברשת השטוחה כדי למשוך בעדינות את הפרוסה למעמד. כאשר חותכים את המדגם, התנועה חייבת להיות רציפה ללא הפסקה, למרות המהירות יכול להיות תלוי מוצקות של המדגם.
10. במהלך החיתוך, השתמש במברשת השטוחה כדי להנחות בעדינות את הפרוסה כפי שהיא מורכבת. הפרוסה לא צריכה להיות סומק עם השלב בשלב זה, כך לאפשר את זה בילי לא לגרום דמעות או מושך ומשפיעים על היסטולוגיה.
    הערה: בעת חיתוך עוברים שלמים, חלק זה יכול להיות קשה במיוחד, במיוחד בעת שינוי סוגי הרקמה. ודא שפרוסות עשויות ללא השהיות והמברשת אינה מושכת את הפרוסות בצורה אגרסיבית מדי. כאשר סוגי הרקמה משתנים, הפרוסה יכולה להישבר, כך ששמירת הטמפרטורה הקרה היא המפתח. אם השבירה היא בעיה, הנמך את הטמפרטורה או הגדל את עובי המדגם.
11. להשהות את התנועה של הבלוק לאחר המדגם הוא חתך לחלוטין דרך, אבל הפרוסה אינה בחינם מהרחוב עדיין. מבלי להזיז את המברשת השטוחה מהפרוסה, השתמש במברשת הפירוט כדי ללטף את הפרוסה למטה כדי להפוך אותו לשטוח ולהקפיא כנגד השלב.
12. החזק את הפרוסה שם ב-~ 10 לפני הסרת מברשת הפירוט וגימור הפרוסה. השתמש בשני מברשות הצבע כדי לשטח בעדינות את הפרוסה מול השלב, למנוע כל גלגול, ולהחזיק אותו מול הבמה עבור ~ 20-30 s.
13. הפוך את הפרוסה לשטח כנגד הבמה שוב. הזזת שקופית טעונה-סטטית מספיק קרוב כדי שפרוסה תהיה נמשכת ולדבוק בשקופית מבלי שתצטרך לגעת בשקופית לשלב. סמן את השקופיות באמצעות עיפרון.
14. אחסן את השקופיות בתיבת אטום כדי להגן על הרקמות מפני הצטברות קרח במהלך אחסון. לאחסון לטווח קצר, יש לאחסן שקופיות ב-20 ° c לפני הצביעת. לאחסון לטווח ארוך לשמור אותם ב--80 ° c.

5. הסטום בנייה לרקמות פרפין

1. מניחים את הבלוקים על הקרח לפני בנייה כדי לצנן את הדגימות. כאשר קריר, פרפין פרוסות ביתר קלות והוא יכול לייצר פרוסות דק יותר.
2. הכינו מרחץ מים ב40-45 מעלות צלזיוס באמצעות מים באולטרטהורים.
3. שים את הלהב במחזיק בתוך המיקרוטומה. ודא שהוא מאובטח ולאחר מכן קבע את זווית הסיווג. . תוודא שזווית הסיווג נכונה ניתן לבדוק זאת בעקבות הוראות היצרן.
4. מניחים את הפין לחסום את המיקרוטומה. ודא שהוא מכוון כראוי כך הלהב יהיה לחתוך ישר על פני הבלוק.
5. ודא שהלהב מכוון כראוי לבלוק על-ידי ביצוע שתי פרוסות. עשה זאת בזהירות כדי שהתאמות יוכלו להתבצע.
6. חתוך את הבלוק עד שנקודת העניין תגיע.
7. הפיכת פרוסות בעובי הרצוי. קח בחשבון כי הפרוסות הראשונות כנראה יימחקו.
8. להרים את הסעיפים ולהעביר אותם לתוך אמבט מים באמצעות מלקחיים. זה אמור להפוך את המקטעים לשטח. השתמש מלקחיים כדי להתאים אותם לפי הצורך.
9. הזזת שקופית שטעונה באופן סטטי בקרוב מספיק כדי שפורסים יימשכו ונצמדים לשקופית. סמן את השקופיות באמצעות עיפרון.
10. הצב את כל השקופיות שנאספו במדף שקופיות. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה ב-37 ° c.

6. העברות רקמות

1. לשטוף את השקופיות ברצף הבא: 3 דקות ב קסילן (2x), 3 דקות ב 1:1 קסילן/100% אתנול פתרון, 3 דקות ב 100% אתנול (2x), 3 דקות ב 95% אתנול, 3 דקות ב 70% אתנול, 3 דקות ב 50% אתנול.

7. המטאוקסילין ואאוזין צביעת

1. הכן את השקופיות לצביעת.
   1. אם משתמשים ברקמות OCT מוכנות, השתזפו במים מזוקקים במשך ~ 4 דקות עד שהאוק מומס ומאפשרים ייבוש.
   2. אם נעשה שימוש ברקמות מוטבעות בפרפין, עליהם להיות מתופיחות. ראה שלב 6.1.
2. מקם את השקופית בסינון 0.1% המטאוקסילין עבור 10 דקות. מקם את השקופית במים מזוקקים, שינוי המים 1x מיד ולאחר מכן שוב לאחר 3 דקות.
3. מניחים את השקופית ב 0.5% אאוזין עבור 10 s או לטבול 12x. טובלים את השקופית במים מזוקקים עד אאוזין כבר לא פסים, על 2-3 מטבלים.
4. מייבשים את השקופית על ידי הטבילה ב 50% אתנול עבור 10 s, 75% אתנול עבור 10 s, 95% אתנול עבור 30 s, ו 100% אתנול עבור 1 דקות. לטבול ב קסילן עד קסילן יוצא חלק, 5-7 ~ מטבלים מטבילה.
5. אפשר קסילן להתאדות ולטעון עם מדיום הרכבה מהירה לייבוש כי יש מדד השבירה קרוב לזכוכית.

8. ניתוח איכותני של מומים לב נפוצים

1. קח תמונות של כל הדגימות באמצעות מיקרוסקופ הפוך או סטריאו המצלמה המתאימה. קחו תמונות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיים, בהתאם לסוגי הפגמים שנותחו. תמונות מקרוסקופי ניתן לקחת עם כל הגדלה מתחת 10x. תמונות מיקרוסקופיים יש לקחת בהגדלה 40x או גבוה יותר. התמונות שצולמו בנייר זה צולמו עם הגדלה 5x באמצעות מיקרוסקופ סטריאו מטרה באוויר 40x (העדשה N.A. של 0.55) באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
   הערה: תמונות מקרוסקופיות הן נקודת התחלה טובה משום שהן מספקות תצוגה לכל הלב (איור 3). כאשר דפוסים הופכים להיות מזוהים, אזורים ספציפיים יכולים להיות ממוקדים בחקירה נוספת.
2. סדר את כל התמונות זה לצד זה על מסך המחשב. יש את כל התמונות של דגימות שליטה בצד אחד של המסך ואת כל התמונות של דגימות ניסיוני בצד השני של המסך. מומלץ לנתח קבוצת טיפול אחת בכל פעם.
3. חפש הבדלים פנוטיפים בין קבוצות הטיפול, החל באזורי מפתח שבו מומים לב נפוצות להתרחש. זה ישתנה בהתאם לשאלה אם התמונות הן מאקרוסקופיות, אשר מתארים אנטומיה ברוטו של הלב, או מיקרוסקופיים, אשר מתארים אנטומיה מיקרוסקופית של רקמת הלב.
4. התחילו לחפש פגמים מקרוסקופיים בלב, כגון פגמים במחיצה הבין-חדרית (איור 2א), פגמים בעלי מחיצה(איור 2ב), והארטידוטוס מפטנטים (איור 2ג). את כל הפגמים הללו ניתן לראות בקלות במראה הרוחבי של הלב.
5. כדי לזהות פגמים של מחיצה, שקול להסתכל על פרוסות מרובות, מכיוון שהם עשויים להיות מצופים במישור אחד של הרקמה ולא אחר.
   הערה: לעיתים פגם אינו היעדר מחיצת המחיצה, אלא חור במחיצה. לכן, שימו לב לא לטעות דמעה על פגם במחיצה. מחפש עיקביים בין הפרוסות הסמוכות באזור מסוים יכול לאשר אם זה בעצם פגם או דמעה מפני חיתוך.
6. כדי לזהות פגמים במערכת הזרימה, כגון העורק הראשי הפטנט, השתמשו במספר פרוסות כדי לעקוב אחר כלי הדם העיקריים כשהם עוזבים את הלב. צור תמונה של כלי הדם העיקריים ביחס אחד לשני. דוגמה מופיעה באיור 2ג.
   הערה: אי סדרים מסוימים עשויים להיות בשל השלב ההתפתחותי של העובר (למשל, הארטידוטוס הפטנט סוגר postnatally, זמן קצר לאחר הלידה; המחיצה הבין-חדרית אינה סוגרת לחלוטין עד ~ e 14.5). כמה פגמים נפוצים אחרים הלב מאקרוסקופי כי אינם כלולים בדמויות כוללים truncus מתמשך atereriosus, אשר ניתן להבחין בקלות ביותר ב-e 16.5 ומעלה; כפול שקע החדר הימני (DORV), אשר ניתן לזהות בפרוסות שבהן הלב נכנס למערכת הזרימה היוצאת; וכלי העורקים העוקף²². פגם מיקרוסקופי לב מיקרוסקופיים כולל דחיסה ירידה בשריר (איור 4).

9. ניתוח כמותי של דחיסת שרירים לב באמצעות המטאוקסילין ורקמות אאוזין ויטראז

1. בעזרת התצוגה המקרו-קרוסקופית של דגימות הרקמה המוכתמת (איור 4א), זהה אזור מעניין לתמונה בהגדלה של 40 x (איור 4ב'). בשביל הנייר הזה, השתמשו בקיר. החדר השמאלי שמור את התמונה בתבנית הרצויה. עבור נייר זה, תמונות נשמרו כקבצי tif.
2. פתחו את התמונה בתוכנת ImageJ.
3. הגדר את התמונה ל-8 סיביות. הדבר מאפשר לתמונה להשתמש בכלי הסף בשלב הבא^23,24. כדי לעשות זאת, בחר 'תמונה | סוג | 8 סיביות".
4. הגדר את הסף של התמונה. מטרת שלב זה היא לבחור רק את הפיקסלים המייצגים את הרקע, למעט הפיקסלים המייצגים את הרקמות^23,24.
   הערה: אזור פני שטח זה ייושם בהמשך. סף נכון יבחר את הפיקסלים שהחוקר רוצה להוציא משטח רקמת השריר. לכן, התוצאה הסופית צריכה לכלול את הרקמה בגווני אפור והרקע ייבחר.
   1. לחץ על "Imagej" | תמונה | כוונן | . אני מבין הזז את המייצג העליון כדי ליצור כוונוני הסף. סגור את חלון התאמות הסף מבלי לבצע שינויים אחרים לאחר שהמקטעים הרצויים נבחרו²¹.
5. השתמשו בכלי מצולע כדי לבחור את השטח שעליו הרקמה מתפרסת. בזהירות לוודא שקווי המתאר לעקוב אחר גבולות הרקמה, כי מעקב רופף יספק מדידות שווא.
6. כוונן את הגדרות המדידה ב-ImageJ כך שהתוכנה רק תמדוד את אזור הפיקסלים שנבחרו באמצעות כלי הסף בשלב 9.4²³. "Imagej | לנתח את | הגדרת מדידות | אזור והגבל לסף". בחר אזור בלבד והגבל לסף.
7. מדוד את האזור של הפיקסלים המסומנים. "Imagej | לנתח את | מידה מדידה". ערך זה מייצג את האזור של השטח השלילי.
8. למדוד את האזור של האזור כולו הריבית. זהו האזור שנבחר באמצעות הכלי מצולע בחירה . "תמונה J | לנתח את | הגדרת מדידות | אזור". בחר אזור בלבד ובטל את הבחירה במגבלה של הסף. לאחר מכן למדוד, בחירת "תמונה J | לנתח את | מידה מדידה".
9. לחשב את האזור את רקמת השריר בפועל הוא כובש בתוך אזור הריבית. הפחת את אזור השטח השלילי מהאזור של אזור הריבית כולו. ערך זה הוא האזור של רקמת השריר.
10. לחשב את מדד Compaction שריר (MCI). לחלק את האזור של רקמת השריר על ידי האזור של אזור הריבית.
    
    ככל שערך ה-MCI גדול יותר, כך השריר דחוס יותר. לאחר מכן ניתן להשתמש בערכי MCI אלה לניתוח סטטיסטי כדי לבדוק שינויים משמעותיים בדחיסת השריר בין קבוצות הטיפול (איור 4ג).

מדד השריר שרירים הושווה בין לבבות המתפתחים בשתי סביבות שונות, שליטה וקבוצה ניסיונית. פרוטוקולים אלה שימשו כדי לנתח את הדחיסה של רקמת שריר רקמות, אשר התיר ניתוח סטטיסטי. דחיסת שרירים הוכח להצטמצם באופן משמעותי בלבבות הניסיוניים ביחס לעוברים שפותחו בתנאים שאינם ניסיוניים.

העוברים נזרקו אם תזמון ההתבוננות לא היה מדויק. למרות שהצמיחה הננסיים של העוברים יכולה להיות תוצאה של הטיפול בניסוי, ויש מגוון בהתקדמות התפתחותית, הרבייה הייתה מלאה מספיק כדי להבטיח את התזמון של התפתחות העובר. החלק הזמני של העוברים התבצע באמצעות התלר אחסון מזמני²¹. דגימות נחשבו לפרוסות בצורה גרועה אם הפרוסות לא משקפות עקביות או אם היו להן דמעות או קפלי ברורות. כתמים סיפק מספיק ניגודיות כדי להפוך את קצוות הרקמה, אבל לא היה כל כך כהה כדי להפוך את תכונות התא להבדיל. לאחר מכן שקופיות התמונה עם מיקרוסקופ הפוך עם מטרה 40x. ערכי MCI חושבו באמצעות תוכנת ImageJ ו-Microsoft Excel. ערכי MCI אלה נותחו באמצעות מבחן T.

איור 1: תוצאות הסדר הכנס בעכברים C57BL6/J. (א) עכבר עם תקע הזדווגות קל לזיהוי. (ב) עכבר ללא תקע הזדווגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ליקויי לב נפוצים. תרשימים של המבנה הצפוי האמיתי של מום לב מולד. (א) השקפה רוחבי של פגם במחיצה הבין-חדרית. (ב) מבט רוחבי של פגם במחיצה. (ג) דוקטוס פטנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: המטאוקסילין והכתם האאוזין של ה-15.5 לבבות. (א) לב ויטראז ' שהתפתח בתנאים נורמליים. סרגל קנה מידה = 750 μm. (ב) לב ויטראז ' שהתפתח בתנאים ניסיוניים. סרגל בקנה מידה = 750 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח כמותי של דחיסה שרירים בין לבבות שפותחו תחת תזונה אימהית נורמלי ולבבות שפותחו תחת חומצות שומן חיוניות לקויה דיאטות. (א) המטאוקסילין ואאוזין לבבות מוכתמים בנוף מאקרוסקופי (5x). קנה מידה ברים = 1,000 μm. (ב) המטאוקסילין ולבבות אאוזין ויטראז ' בתצוגה מיקרוסקופית (40x). קנה מידה ברים = 75 μm. (ג) הנתונים היוצרים של מדידות מדד Compaction שרירים. הערכים נותחו באמצעות מבחן T (n = 4 לכל קבוצת הטיפול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול זה בוחן את הטכניקות המעורבות בניתוח של התפתחות הלב בלבבות עובריים. חלק מהמגבלות של שיטה זו הן המיומנות הפיזית הנדרשת עבור טכניקות ההכנה, שעשויות לדרוש תרגול, ומיומנות עם דימות מיקרוסקופ. אם הפרוסות המתקבלות בקריוסטט מלוכלכות, המטאוקסילין והאאוזין כתמים לא יהיו ברורים, או אם התמונות הננקטות במיקרוסקופ יש תאורה ירודה, אז השיטה המשמשת עם ImageJ לא יעבוד. מגבלה של תכונת הסף של תוכנת ImageJ היא שהיא בוחרת פיקסלים הממוקמים בקצה אחד של סף התלוי בערך הפיקסל. לכן, כל הפיקסלים הקיימים בצד הלא נכון של הסף ייכללו או לא ייכללו בחישוב. בסופו של דבר, פתרון בעיות יהיה הכרחי לאימוץ הפרוטוקולים לשימוש במחקר.

במקרה שחילוץ הלב קשה מדי, שקול דילוג לשלב 2.8. בנוסף, שקול הסרת יותר מאשר רק את הלב והריאות מחלל החזה. המטרה ואז הופך לגדול יותר קל יותר לתמרן, וקשר ישיר בין הלב לבין מלקחיים קנס הוא ממוזער. כאשר ההקפאה מכוונת, הדגימות הנסיוניות תמיד יהיו ישירות לעומת דגימות שליטה. הדבר מאפשר מקום לשגיאת משתמש כל עוד השגיאה עקבית בכל הדגימות. כדי למזער את שגיאת המשתמש ולהימנע מתוצאות כוזבות, ודא שהמקטעים המקבילים מתקבלים משתי קבוצות הטיפולים. לדוגמה, אם יותר מאדם אחד מייצר מקטעים, ודא שאדם אחד מייצר מספר זוגי של מקטעים עבור פקדים וכל קבוצות הטיפול, ולא רק קבוצת ממשנה אחת. לבסוף, כסף תמונות ב-ImageJ, כלי הסף משמש כדי לאפשר חופש מירבי בבחירת פיקסלים המייצגים רקמות ופיקסלים שלא. במקרה הצורך, התאימו את הניגודיות של התמונות כדי להעצים עוד יותר את ערך הפיקסל של הרקע מערך הפיקסל של הרקמה. למרות שקיימות אפשרויות לפתרון בעיות, השיטות עדיין דורשות רמה גבוהה של מיומנות. עם זאת, ביצוע פרוטוקול זה מספק גישה לנתונים שאינם נמדדים בדרך כלל במחקרים אחרים התפתחותיים לב. לפיכך, ניצול תכונות של פרוטוקול זה עשוי לתרום תרומה משמעותית לחקירה מדעית.

זיהוי ההשפעות של טיפולים ניסיוניים במחקר קרדיולוגיה לעתים קרובות נחקר באמצעות הערכה מורפולוגיה. זה במיוחד המקרה בביולוגיה התפתחותית, שבה השליה מקשה על תכונות פיזיולוגיות של לבבות מתפתחים להיות נמדד. לכן, ניתוח מורפולוגי המאפשר תובנה לתוך הפונקציה של הלב משמרות באופן דרמטי את המסלול של מחקר ביולוגיה התפתחותית. למרות שרוב העיתונים לנתח את העובי של שריר הלב כדי לקבוע את חוזק הלב, מדידה ישירה של דחיסה שרירים יכול לספק תובנה נוספת לתוך הפיזיולוגיה של הלב היונקים המתפתחים^25,26,27.

למחברים אין כל גילוי לדווח.

מעבדת אגירי נתמכת על ידי הלב הלאומי, הריאות, ומכון הדם של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס K01HL135464 ועל ידי איגוד הלב האמריקני תחת מספר הפרס 19IPLOI34660342.