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이 프로토콜에서는 선천성 심장 결함과 관련된 마우스의 발달 표현형을 정성적및 정량적으로 분석하는 절차를 설명합니다.
선천성 심장 결함 (CHD)는 모든 살아있는 출생의 1%까지 영향을 미치는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형입니다. 그러나, CHD에 대 한 근본 원인은 여전히 제대로 이해. 개발 마우스는 마우스와 인간 사이의 심장 발달 프로그램이 매우 보존되기 때문에 CHD의 연구를위한 가치있는 모델을 구성한다. 이 프로토콜은 원하는 임신 단계의 마우스 배아를 생산하는 방법, 하류 처리를 위해 심장을 분리하고 보존하는 방법, 조직학에 의한 일반적인 유형의 CHD를 식별하는 정량적 방법(예: 심실 중격)을 상세히 기술합니다. 결함, 심방 중격 결함, 특허 덕터스 동맥 동맥 및 일반적인 근육 다짐 표현형을 측정하는 정량적 조직 적 방법. 이러한 방법은 시료 준비, 수집 및 분석과 관련된 모든 단계를 명확하게 하여 과학자들이 CHD를 정확하고 재현가능하게 측정할 수 있도록 합니다.
CHD는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형이고 출생 결함 관련 죽음의 주요한 원인1,2,3,4,5,6. 신생아의 약 90 %가 CHD에서 생존하지만, 환자의 삶과 의료 시스템에 무거운 부담을 부과, 수년에 걸쳐 상당한 이환율 및 의료 개입과 자주연관7,8,9,10. 순전히 유전 적 요인 의 외부, CHD의 원인은 제대로 이해4. 미국 심장 협회 및 기타 소스 에 따라 모든 CHD 케이스의 ~ 56-66 %를 차지하는 미확인 원인2,3,4,11. 잘 알려진 인자는 유전 적 돌연변이, CNV, 드 노보 단일 뉴클레오티드 변이체, 및 이수성염을 포함한다. 모성생활2,12,경제적 박탈, 인종13을연결하는 역학 연구에서 제시한 바와 같이 환경 및 식이 요인이 CHD에 기여하는 중요한 원천이라고 의심되며 엽산11,14 및 생리활성 지질 망막 산15,16과같은 식이 인자를 연구하여 연구한다. CHD 및 기타 심혈관 결함의 메커니즘 및 원인을 조사하는 것은 예방 전략 및 새로운 치료 옵션1,4,17,18,19를개발하는 것이 중요하다.
개발 마우스는 포유류에서 CHD를 공부하기위한 초석 모델입니다. 그러나, 심장 형태를 보존하는 해부, 발달 단계의 분석 및 CHD 관련 결함의 확인과 같은 채택된 방법 및 분석의 몇몇은, murine 심혼의 분석에 새로운 과학자를 위해 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 방법의 목표는 이러한 프로세스에 대한 정성적 및 정량적 지침을 제공하는 것입니다. 따라서, 이 프로토콜에서는 원하는 임신 단계의 배아를 생산하기 위해 시간 적 짝짓기를 수행하는 방법, 임신 한 여성을 그대로 심장 회복 (유출 관과 같은 관련 조직 포함), 심장 고정 및 준비에 대한 해부하는 방법을 설명합니다. 저온 절제, 기본 운동학 방법, 일반적인 심장 결함의 정량적 분석 및 심장 근육 다짐의 정성적 분석, CHD의 일부 유형에 대한 일반적인 전구체 표현형.
이 논문에서 언급된 실험에 사용된 모든 동물은 미시간 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 동물 관리 지침을 사용하여 처리되었습니다.
1. 배아 생산을 위한 C57BL6/J 마우스의 시간 적시 짝짓기
2. 심장 회복을위한 여성과 배아의 해부
3. 조직 준비
참고 : 조직은 OCT (최적의 절삭 온도) 포함 또는 파라핀 포함을 사용하여 제조 할 수 있습니다. 두 방법 중 하나에 장점과 단점이 있으며 어떤 포함 방법을 사용해야 하는지 결정할 때 분석의 목표를 고려해야 합니다.
4. OCT 임베디드 조직에 대한 저온 절제
5. 파라핀 내장 된 조직에 대한 마이크로 토메임 절제
6. 조직의 탈파화
7. 헤마톡실린 및 에오신 염색
8. 일반적인 심장 결함의 질적 분석
9. 헤마톡실린과 에오신 염색 조직을 이용한 심장 근육 다짐의 정량적 분석
근육 다짐 지수는 두 개의 서로 다른 환경, 대조군 및 실험 군에서 발전하는 심장 사이에서 비교되었다. 이 프로토콜은 통계 분석을 허용하는 근육 조직의 압축을 정량적으로 분석하는 데 사용되었습니다. 근육 다짐은 비실험 조건에서 개발된 배아에 비해 실험심에서 현저히 감소되는 것으로 나타났다.
관찰 타이밍이 부정확해 보이는 경우 배아는 폐기되었습니다. 배아의 성장을 저해하는 것은 실험의 치료의 결과일 수 있고, 발달 진행의 범위가 있지만, 번식은 배아 발달의 타이밍을 보장하기에 충분히 간격을 두었다. 배아의 발판은 Theiler 스테이징21을사용하여 수행되었다. 샘플은 슬라이스가 일관성을 반영하지 않거나 명백한 눈물이나 주름이 있는 경우 제대로 슬라이스되지 않은 것으로 간주되었습니다. 염색은 조직 가장자리를 만들기에 충분한 대조를 제공하지만, 세포 특징을 구별 할 정도로 어둡지 않았다. 슬라이드는 40배 대한 목적을 가진 반전된 현미경으로 그 때 심상했습니다. MCI 값은 ImageJ 소프트웨어와 마이크로 소프트 엑셀을 사용하여 계산되었다. 이러한 MCI 값은 T-검정을 사용하여 분석되었다.
그림 1: C57BL6/J 마우스에서 플러그 분석 결과. (A)쉽게 식별 할 수있는 교합 플러그가있는 마우스. (B)교합 플러그가 없는 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일반적인 심장 결함. 선천성 심장 결함의 진정한 예상 형태도. (A)심실 중격 결함의 횡방향 보기. (B)심방 중격 결함의 횡방향 보기. (C)특허 덕터스 동맥 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: e15.5 하트의 헤마톡실린 및 에오신 얼룩. (A)정상적인 조건에서 발달한 스테인드 하트. 스케일 바 = 750 μm.(B)실험 조건하에서 개발된 염색된 심장. 배율 표시줄 = 750 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 필수 지방산 결핍 모계 식단하에서 개발된 정상적인 모계 식단과 심장 사이의 근육 다짐에 대한 정량적 분석. (A)헤마톡실린과 에오신스테인은 거시적(5배) 보기에서 하트를 염색하였다. 스케일 바 = 1,000 μm.(B)헤마톡실린 및 에오신 스테인 드 하트 (40x). 축척 막대 = 75 μm.(C)근육 다짐 지수 측정의 결과 데이터. 값을 T 검정(n=치료 군당 4)을 사용하여 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜은 배아 심장에서 심장 발달의 분석에 관련된 기술을 탐구합니다. 이 방법의 몇몇 제한은 현미경 화상 진찰을 가진 사례 및 기술, 필요로 할 수 있는 예비 기술에 필요한 물리적 손재주입니다. 저온 유지 작업에서 얻은 조각이 지저분하면 헤마톡실린 및 에오신 얼룩이 명확하지 않거나 현미경에서 찍은 이미지가 조명이 좋지 않은 경우 ImageJ와 함께 사용되는 방법이 작동하지 않습니다. ImageJ 소프트웨어의 임계값 피쳐의 한계는 픽셀 값에 의존하는 임계값의 한쪽 끝에 위치한 픽셀을 선택한다는 것입니다. 따라서 임계값의 잘못된 쪽에 있는 모든 픽셀이 계산에 잘못 포함되거나 제외됩니다. 궁극적으로, 문제 해결 연구에 사용 하기 위해 프로토콜의 채택에 필요한 것입니다.
심장 추출이 너무 어려운 경우 2.8 단계로 건너 뛰는 것이 좋습니다. 또한 흉강에서 심장과 폐 이상을 제거하는 것이 좋습니다. 그런 다음 대상이 더 크고 조작하기 쉬워지며 심장과 미세 집게 사이의 직접적인 접촉이 최소화됩니다. 저온 절편시, 실험 샘플은 항상 제어 샘플과 직접 비교됩니다. 이렇게 하면 모든 샘플에서 오류가 일관된 한 사용자 오류에 대한 일부 공간을 확보할 수 있습니다. 사용자 오류를 최소화하고 잘못된 결과를 방지하려면 두 치료 그룹 모두에서 비교 가능한 섹션을 얻을 수 있는지 확인하십시오. 예를 들어, 두 명 이상이 섹션을 생산하는 경우 한 개인이 하나의 하위 그룹이 아니라 컨트롤 및 모든 치료 그룹에 대해 짝수 의 섹션을 생성해야 합니다. 마지막으로 ImageJ에서 이미지를 임계값으로 설정하면 임계값 도구가 사용되어 조직과 그렇지 않은 픽셀을 나타내는 픽셀을 선택할 때 최대한의 자유도를 허용합니다. 필요한 경우 이미지의 대비를 조정하여 조직의 픽셀 값에서 배경의 픽셀 값을 더욱 강화합니다. 문제 해결 옵션이 있지만 이 기술에는 여전히 높은 수준의 기술이 필요합니다. 그러나 이 프로토콜을 수행하면 일반적으로 다른 심장 발달 연구 연구에서 측정되지 않는 데이터에 액세스할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜의 기능을 활용하면 과학적 조사에 상당한 기여를 할 수 있습니다.
심장학 연구에서 실험 적 치료의 영향을 식별하는 것은 종종 형태학 평가를 통해 조사됩니다. 이것은 특히 발달 생물학의 경우, 태반이 심장 발달의 생리적 특징을 측정하기가 어려워집니다. 따라서, 심장의 기능에 대한 통찰력을 허용하는 형태학적 분석은 발달 생물학 연구의 궤적을 극적으로 바꿔줍니다. 대부분의 논문은 심장의 강도를 결정하기 위해 심장 근육의 두께를 분석하지만, 근육 다짐의 직접 측정은 개발 포유류 심장의 생리학에 대한 추가 통찰력을 제공 할 수25,26,27.
저자는 보고할 공개가 없습니다.
Aguirre Lab은 수상 번호 K01HL135464에 따라 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소와 수상 번호 19IPLOI34660342에 따라 미국 심장 협회에 의해 지원됩니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
ImageJ Software | ImageJ | ||
Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
Paint Brushes (at least 2) | |||
Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
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