Method Article
Dans ce protocole, nous décrivons des procédures pour analyser qualitativement et quantitativement des phénotypes développementaux chez les souris associées aux défauts congénitaux de coeur.
Les malformations cardiaques congénitales (CHD) sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme, affectant jusqu’à 1 % de toutes les naissances vivantes. Cependant, les causes sous-jacentes de la coronaropathie sont encore mal comprises. La souris en développement constitue un modèle précieux pour l’étude de la coronaropathie, parce que les programmes de développement cardiaque entre les souris et les humains sont fortement conservés. Le protocole décrit en détail comment produire des embryons de souris du stade gestationnel souhaité, méthodes d’isolement et de préservation du cœur pour le traitement en aval, méthodes quantitatives pour identifier les types courants de CORONA par histologie (p. ex., septale ventriculaire défauts, défauts septaux auriculaires, brevets ductus arteriosus), et méthodes quantitatives d’histomorphométrie pour mesurer les phénotypes musculaires communs de compaction. Ces méthodes articulent toutes les étapes impliquées dans la préparation, la collecte et l’analyse de l’échantillon, permettant aux scientifiques de mesurer correctement et de façon reproductible la coronaropathie.
Les CHD sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme et sont la principale cause de décès liés aux malformations congénitales1,2,3,4,5,6. Bien qu’environ 90 % des nouveau-nés survivent à la coronaropathie, il est souvent associé à une morbidité et à des interventions médicales importantes au fil des ans, imposant un lourd fardeau à la vie des patients et au système de santé7,8,9,10. En dehors des facteurs purement génétiques, les causes de la coronaropathie sont malcomprises 4. Les causes non identifiées représentent 56-66% de tous les cas de CORONA selon l’American Heart Association et d’autres sources2,3,4,11. Les facteurs bien connus comprennent les mutations génétiques, les VNC, les variantes de nucléotide unique de novo et l’aneuploidy. On soupçonne que les facteurs environnementaux et diététiques sont également des sources importantes contribuant à la CORONA, comme le suggèrent des études épidémiologiques liant le mode de vie maternel2,12, la privation économique, et la race13, et par la recherche sur des facteurs alimentaires tels que l’acide folique11,14 et l’acide rétinoïque des lipides bioactifs15,16. Il est important d’étudier les mécanismes et les causes de la coronaropathie et d’autres défauts cardiovasculaires pour élaborer des stratégies préventives et de nouvelles options thérapeutiques1,4,17,18,19.
La souris en développement est un modèle de pierre angulaire pour l’étude du CHD chez les mammifères. Cependant, certaines des méthodes et des analyses utilisées, telles que les dissections préservant la morphologie cardiaque, l’analyse des stades de développement et l’identification des défauts associés au CHD, peuvent être intimidantes pour les scientifiques qui sont nouveaux à l’analyse des cœurs murins. L’objectif des méthodes décrites dans ce protocole est d’offrir des lignes directrices qualitatives et quantitatives pour ces processus. Ainsi, dans ce protocole, nous expliquons comment effectuer des accouplements chronométrés pour produire des embryons du stade gestationnel désiré, disséquent les femelles enceintes pour le rétablissement intact du cœur (y compris les tissus associés tels que le tractus), la fixation du cœur et la préparation pour section cryostat, méthodes d’histologie de base, analyses quantitatives des défauts cardiaques communs, et analyse qualitative du compaction de muscle cardiaque, un phénotype précurseur commun à certains types de CHD.
Tous les animaux utilisés dans les expériences mentionnées dans le présent document ont été traités à l’aide des lignes directrices sur les soins aux animaux du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan (IACUC).
1. Accouplement chronométré des souris C57BL6/J pour la production d’embryons
2. Dissection des femelles et des embryons pour le rétablissement cardiaque
3. Préparation des tissus
REMARQUE : Les tissus peuvent être préparés à l’aide d’un octogénaire (température de coupe optimale) ou d’intégration de paraffine. Il y a des avantages et des inconvénients à l’une ou l’autre méthode et l’objectif de l’analyse devrait être pris en considération au moment de décider quelle méthode d’intégration devrait être utilisée.
4. Section cryostat pour les tissus incrustés d’OCT
5. Section microtomée pour les tissus incorporés paraffine
6. Déféaffinisation des tissus
7. Tache d’hématoxyline et d’éosine
8. Analyse qualitative des malformations cardiaques courantes
9. Analyse quantitative du compactage cardiaque du muscle à l’aide d’hématoxyline et de tissus tachés d’éosine
L’indice de compactage musculaire a été comparé entre les cœurs se développant sous deux environnements différents, un contrôle et un groupe expérimental. Ces protocoles ont été utilisés pour analyser le compactage du tissu musculaire quantitativement, ce qui a permis l’analyse statistique. Le compactage de muscle s’est avéré sensiblement réduit dans les coeurs expérimentaux par rapport aux embryons qui se sont développés dans des conditions non expérimentales.
Les embryons ont été écartés si le moment d’observation semblait inexact. Bien que la croissance rabougrie des embryons puisse être le résultat du traitement de l’expérience, et qu’il existe une gamme de progrès du développement, la reproduction a été suffisamment espacée pour assurer le moment du développement de l’embryon. La mise en scène des embryons a été réalisée à l’aide de Theiler Staging21. Les échantillons ont été jugés mal tranchés si les tranches ne reflétaient pas la consistance ou si elles avaient des larmes ou des plis évidents. La coloration a fourni assez de contraste pour faire dehors les bords de tissu, mais n’était pas si foncée qu’à rendre les dispositifs cellulaires indiscernables. Des diapositives ont ensuite été illustrées avec un microscope inversé avec un objectif 40x. Les valeurs MCI ont été calculées à l’aide du logiciel ImageJ et de Microsoft Excel. Ces valeurs mcI ont été analysées à l’aide d’un T-test.
Figure 1 : L’essai de plug donne des souris C57BL6/J. (A) Une souris avec un bouchon de copulation facilement identifiable. (B) Une souris sans bouchon de copulation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Malformations cardiaques courantes. Schémas de la vraie morphologie anticipée d’un défaut congénital de coeur. (A) Vue transversale d’un défaut septal ventriculaire. (B) Vue transversale d’un défaut septal auriculaire. (C) Brevet ductus arteriosus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Hématoxyline et tache d’éosine des cœurs e15.5. (A) Un cœur taché qui s’est développé dans des conditions normales. Barre d’échelle de 750 m . (B) Un cœur souillé qui s’est développé dans des conditions expérimentales. Barre d’échelle de 750 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse quantitative du compactage musculaire entre les cœurs qui se sont développés sous les régimes maternels normaux et les cœurs qui se sont développés sous les régimes maternels déficients en acides gras essentiels. (A) Hématoxyline et cœurs tachés d’éosine à une vue macroscopique (5x). Barres d’échelle à 1 000 m (B) Hématoxyline et cœurs tachés d’éosine à la vue microscopique (40x). Barres d’échelle de 75 m. (C) Les données résultantes des mesures de l’indice de compaction musculaire. Les valeurs ont été analysées à l’aide d’un T-test (n - 4 par groupe de traitement). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Ce protocole explore les techniques impliquées dans l’analyse du développement cardiaque dans les cœurs embryonnaires. Certaines limites de cette méthode sont la dextérité physique requise pour les techniques préparatoires, qui peuvent nécessiter la pratique, et la compétence avec l’imagerie au microscope. Si les tranches obtenues au cryostat sont désordonnées, la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine ne sera pas claire, ou si les images prises au microscope ont un mauvais éclairage, alors la méthode utilisée avec ImageJ ne fonctionnera pas. Une limitation de la fonction seuil du logiciel ImageJ est qu’il sélectionne des pixels situés sur une extrémité d’un seuil dépendant de la valeur pixel. Par conséquent, tous les pixels qui existent du mauvais côté du seuil seront incorrectement inclus ou exclus dans le calcul. En fin de compte, le dépannage sera nécessaire pour l’adoption des protocoles à utiliser dans une étude.
Dans le cas où l’extraction cardiaque est trop difficile, envisager de sauter à l’étape 2.8. En outre, envisager d’enlever plus que le cœur et les poumons de la cavité thoracique. La cible devient alors plus grande et plus facile à manipuler, et le contact direct entre le cœur et les forces fines est minimisé. Lors de la section cryostat, les échantillons expérimentaux seront toujours directement comparés aux échantillons témoins. Cela permet une certaine marge d’erreur de l’utilisateur tant que l’erreur est cohérente dans tous les échantillons. Pour minimiser les erreurs de l’utilisateur et éviter les faux résultats, assurez-vous que des sections comparables sont obtenues des deux groupes de traitement. Par exemple, si plus d’une personne produit des sections, assurez-vous qu’une personne produit un nombre uniforme de sections pour les contrôles et tous les groupes de traitement, et pas seulement un sous-groupe. Enfin, lors du seuil des images sur ImageJ, l’outil de seuil est utilisé pour permettre une liberté maximale dans la sélection des pixels qui représentent les tissus et les pixels qui ne le font pas. Si nécessaire, ajustez le contraste des images pour intensifier davantage la valeur pixel de l’arrière-plan à partir de la valeur pixel du tissu. Bien qu’il existe des options de dépannage, les techniques exigent encore un haut degré de compétence. Cependant, l’exécution de ce protocole donne accès à des données qui ne sont généralement pas mesurées dans d’autres études de recherche sur le développement cardiaque. Ainsi, l’utilisation des caractéristiques de ce protocole pourrait apporter une contribution significative à une recherche scientifique.
L’identification des impacts des traitements expérimentaux dans la recherche en cardiologie est souvent étudiée par l’évaluation de la morphologie. C’est particulièrement le cas en biologie du développement, dans lequel le placenta rend difficile la mesure des caractéristiques physiologiques des cœurs en développement. Par conséquent, l’analyse morphologique qui permet de perspicacité dans la fonction du cœur déplace considérablement la trajectoire de la recherche en biologie du développement. Bien que la plupart des papiers analysent l’épaisseur du muscle cardiaque pour déterminer la force du cœur, la mesure directe du compactage musculaire pourrait fournir un aperçu plus approfondi de la physiologie du cœur mammifère en développement25,26,27.
Les auteurs n’ont aucune divulgation à signaler.
Le laboratoire Aguirre est soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution K01HL135464 et par l’American Heart Association sous le numéro de prix 19IPLOI34660342.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
ImageJ Software | ImageJ | ||
Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
Paint Brushes (at least 2) | |||
Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
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