Method Article
In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.
Omurgalı sinir sisteminin gelişimi karmaşık hücresel davranışlar ve etkileşimlerin hassas bir koordinasyon gerektirir. Vivo görüntüleme tekniklerinde yüksek çözünürlüklü kullanımı, canlı organizmada bu süreçlere açık bir pencere açabilir. Örneğin, hücreleri ve bunların dölleri sinir sistemi formları olarak gerçek zamanlı olarak takip edilebilir bölme. Son yıllarda, çok renkli tekniklerde teknik gelişmeler araştırılabilir soru türlerini genişletti. Çok renkli Brainbow yaklaşımı sadece hücreler gibi ayırt etmek için değil, aynı zamanda her bir ata hücresi türetmek ilgili hücrelerin birden fazla farklı klonları renk kodu için kullanılabilir. Bu, geliştirme sırasında birçok farklı klonların ve davranışlarının aynı anda çok katlı bir soy analizine olanak tanır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz. Bu, özellikle geleneksel promotör odaklı renkleri kullanarak farklı bir şekilde etiketlemesi zor olan hücreler arasındaki hücresel etkileşimleri takip etmek için yararlıdır. Yaklaşımımız aynı anda birden fazla farklı klon lar arasındaki soy ilişkilerini izlemek için kullanılabilir. Bu teknik kullanılarak oluşturulan büyük veri kümeleri, genetik veya farmakolojik manipülasyonlar arasında nicel olarak karşılaştırılabilen zengin bilgiler sağlar. Sonuçta oluşturulan sonuçlar sinir sisteminin nasıl geliştiği hakkında sistematik sorulara cevap yardımcı olabilir.
Gelişimin ilk aşamalarında, özel leştirilmiş progenitor hücrelerinin havuzları proliferatif bölgelerde tekrar tekrar bölünür ve farklı kız hücreleri dizileri üretir. Bu gelişim döneminde doğan hücreler daha sonra farklılaşır ve yeni doğan organları oluşturmak için seyahat ederler. Sinir sisteminde radyal glia gibi atalar ventriküler bölgelerde olgunlaşmamış nöronlara yol açar. Nöronlar ventriküllerden uzaklaşır ve olgunlaşırken, genişleyen doku sonunda beynin son derece karmaşık yapılarını oluşturur1,2,3,4,5,6. Atalarının bölünmesi ve farklılaşma ve nöronların göç arasındaki koordinasyon nihai boyut, şekil belirleyecek ve böylece beynin fonksiyonu, doğrudan davranış etkileyen7,8,9,10. Bu süreçler üzerinde sıkı kontrol açıkça normal beyin gelişimi için çok önemli olmakla birlikte, bu dinamikleri düzenleyen küresel mekanizmalar iyi anlaşılamamıştır. Burada bir hücresel çözünürlükte sinir sistemi gelişimini incelemek için bir araç tarif, araştırmacılar Brainbow ile gelişmekte olan zebrabalığı beyninde progenitor hücreleri ve nöronlar in vivo görselleştirmek ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile zaman içinde davranışlarını izlemek için izin11. Yaklaşım aynı zamanda gelişmekte olan embriyonun diğer bölümlerini görselleştirmek için adapte edilebilir.
Gelişmekte olan zebra balığı beynindeki hücreleri gözlemlemek ve ayırt etmek için Brainbow hücre etiketlemetekniğini 11'euyarladık. Brainbow, bir hücre popülasyonunu etiketlemek için üç farklı floresan proteinin (FP) rastgele belirlenmiş, birleştirici ekspresyonu kullanır. Brainbow ekspresyonu için varsayılan ifade kırmızı FP dTomato iken, enzim Cre rekombinaz ile rekombinasyon mCerulean (siyan floresan protein, CFP) veya sarı floresan protein (YFP)12,13ifadesi ile sonuçlanır . Bir hücrede ifade edilen her FP'nin birleşik miktarı, hücreye benzersiz bir renk verir ve komşu hücrelerden net görsel ayrım sağlar. Ayrıca, bir ata hücresi bölündüğünde, her kız hücre renk kodlu klonlar üreten ve araştırmacılar hücre soy 11 ,,14izlemek için izin, kendi ana hücreden renk devralacak.11 Başlangıçta farelerde nöronal devreleri analiz etmek için kullanılırken12, Brainbow beri model organizmaların geniş bir yelpazede ifade edilmiştir, zebrabalığı da dahil olmak üzere15.
Tekniğimiz, yaşayan zebra balıklarında zaman içinde birden fazla renk kodlu klonları doğrudan görüntülemek için önceki çok renkli etiketleme ve görüntüleme yöntemlerine dayanmaktadır. Embriyo lar gibi optik şeffaflık nedeniyle, zebra balıkları görüntüleme deneyleri için uygundur16, ve önceki çalışmalarda sinir sistemi11, 15,,17,18,19,20,21,22,23,15,25, çeşitli dokuları incelemek için zebrabalığı Brainbow kullandık24 26,27. Canlı organizmanın doğrudan görüntü yeteneği, onların hızlı eski rahim gelişimi ile birlikte, zebra balığı omurgalı gelişimi değerli bir model yapmak. Memeli beyninin aksine, zebra balığı hindbrain tüm proliferatif bölge endojen çevre6bozulmadan görüntüleme için hazırdır. Bu deneylerin in vitro veya sabit doku preparatları yerine canlı organizmada yapılmasını sağlar. Sabit görüntüleme deneylerinin aksine, in vivo çalışmalar uzunlamasına bir tasarıma olanak sağlayarak desenler için analiz edilebilen saatler süren veriler üreterek nispeten nadir olayları gözlemleme olasılığını artırır. İlgi çekici olayların hızına ve uzunluğuna bağlı olarak, araştırmacılar kısa (1-2 saat) veya uzun (~16 saate kadar) hızlandırılmış görüntüleme deneyleri yapmayı seçebilirler. Zebrabalığı ısı şok organizatörü 70 (hsp70, hsp) kullanılarak, Brainbow ekspresyonu zamansal olarak kontrol edilebilir28,29. Ayrıca, bu organizatör tarafından indüklenen mozaik ifade de etiketleme ve birçok klonlar11izleme için uygundur.
Canlı beyindeki birden fazla klonu görsel olarak tanımlayabilme yeteneği bu yöntemin bir avantajıdır. Sinir sisteminin gelişiminde klonların rolünü araştıran önemli önceki çalışmalar, tek bir ata hücresi ve onun atasını tek bir FP veya diğer kolayca görselleştirilmiş protein kullanarak etiketlemek için retroviral vektörler kullanılmıştır. Bu tür etiketleme araştırmacılar zaman içinde tek bir klon gözlemlemek için izin verir, in vitro veya in vivo2,30,,31,32,33,34,35,36,37,38. Brainbow'un farklı renkleri, bir klondaki hücrelerin davranışını izleme yöntemlerinin aksine, araştırmacıların klonlar arasındaki dinamikleri gözlemlemelerine olanak tanır. Ayrıca, beyindeki birçok klonları etiketlemek için Brainbow kullanılarak, klonal davranışla ilgili ek veriler tek bir klonu11etiketleyen tekniklere göre toplanır. Daha da önemlisi, burada açıklanan yaklaşımlar farklı genetik veya farmakolojik manipülasyonlar18uğramıştır balıklar arasında gelişimsel karşılaştırmalar oluşturmak için genişletilebilir. Genel olarak, bu avantajlar, omurgalı sinir sisteminin gelişimini araştıran araştırmacılar için ideal olan Brainbow ifade eden zebra balığının vivo konfokal görüntülemesinde zaman atlamalı hale getirilmektedir, özellikle de klonların rolüyle ilgilenenler.
Hayvan denekleri ile ilgili prosedürler Lewis & Clark Koleji'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Zebrabalığı Embriyolarının Mikroenjeksiyonu
2. Brainbow İfadesi İndüklemek için Isı Şoku
NOT: Plazmid DNA enjekte veya transgen ifade ifade hsp70 organizatörü kullanarak ifade kullanmıyorsa, ısı şoku adımı atlanabilir ve sağlıklı embriyolar hemen fenilthiourea transfer edilmelidir (PTU) 24 saat sonrası döllenme (hpf).
3. Brainbow İfadesi Için Embriyo Ların Taranması
4. In Vivo Görüntüleme için Montaj Embriyolar
5. Zebrabalığı Hindbrain Geliştirme Zaman Atlamalı Konfokal Görüntüleme
6. Hızlandırılmış Dosya Yönetimi
7. Brainbow Görüntülerinin Nicel Klonal Renk Analizi
Bu bölümde, burada açıklanan in vivo çok renkli hızlandırılmış görüntüleme yaklaşımı kullanılarak elde edilebilen sonuçlara örnekler gösterilmektedir. Gelişmekte olan zebra balığıhindbrain14 proliferatif ventriküler zonlarında hücrelerin Brainbow renk kodlu klonları göstermek(Şekil 1).
Tipik olarak, Brainbow etiketli hücreler belirli bir radyal lif boyunca düzenlendiğinde, göreceli RGB kanal ağırlıkları olarak ölçülebilen aynı rengi(Şekil 1D)paylaştılar (Şekil 1E). Bu, bu radyal grupların bölünen hücrelerin klonları olduğunu ve benzer renklerinin, zebra balığı, fare ve civciv14,15'te daha önceki çalışmalarda gözlendiği gibi, klonsal ilişkili olarak tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Brainbow etiketleme yoğunluğu nispeten seyrek olduğunda, bu renk kodlama açıkça görselleştirmek ve yaşayan omurgalı beynin proliferatif bölgelerde birçok farklı radyal klonları izlemek için kullanılabilir.
Nicel renk analizi, kız hücrelerinin anne (ata) hücresi(Şekil 1F)ile aynı rengi ifade ettiğini, ancak komşu radyal hücre kümelerinin birbirinden ayırt edilebildiği ni göstermiştir11 (Şekil 1E). Bu, ilgili hücrelerin çok sayıda klonları aynı anda vivo saat içinde takip edilebilir anlamına gelir(Şekil 2),bir multipleks soy analizi ve karşılaştırma için izin. 2 dpf'de klonlarda renk ekspresyonunun ve daha sonra tekrar 3 dpf 'de renk ekspresyonunun ölçülmesi(Şekil 2A-B)Brainbow ekspresyonunun da 2-3 gün in vivo11'dennispeten sabit kaldığını göstermiştir. Böylece tek tek hücreler gelişim sırasında nispeten uzun süreler boyunca gerçek zamanlı olarak tanımlanabilir ve izlenebilir.
Hızlandırılmış görüntüleme, hücre döngüsünün incelenmesine izin veren 1-2 dpf(Şekil 2C–F)11arasındaki dönemde interkinetik nükleer göç ve hücre bölünmesi geçiren çok sayıda hücre yi saptamaktaydı. 30 dk'lık bir zaman atlamalı aralık kullanarak, hücre bölünmesi sırasında her zaman mitotik figürü yakalayamadık. Bu hücre bölünmesi atanan zaman akadar 30 dakika potansiyel bir hata tanıttı. Ayrıca, bazı klonların iki ata hücresi içerdiğini gözlemledik (örneğin, Şekil 2F). Bu kısıtlamalar içinde, hücre döngüsünün uzunluğu ölçülebilir. Zaman içinde tek tek Brainbow etiketli ataları izleyerek, zebra balığı1,45,46'dakiönceki ölçümlerle karşılaştırılabilir, ortalama hücre döngüsü olan 8,4 ± 1,5 saat olarak hesapladık. Ayrıca, Brainbow zaman atlamalı görüntüleme tekniğini kullanarak, membran blebbing ve hücre parçalanması47,,48gibi apoptoz ile ilişkili stereotipik morfolojik değişiklikler geçiren tek tek hücreleri gözlemleyebildik (Şekil 3)11.
Şekil 1: Brainbow, gelişmekte olan zebra balığı arka beyninde klonsal olarak bölünen hücreler kümelerini etiketletir. (A) HSP şeması:Zebrabow (Brainbow) DNA geçici renk kodu klonlar ifade. (B) In vivo 1 ve 2 dpf'de gelişen zebra balığının ışık görüntülerini iletilir; oklar görüntüleme için hedeflenen genel arka beyin bölgesini gösterir. Embriyoların translucency her balık altında yerleştirilen bir mikrometre ile gösterilmiştir. Tek hücreli aşamada enjeksiyonları gösteren deneysel zaman çizelgesi, 24 hpf'de ısı şoku (HS) ve 1-3 dpf'den görüntüleme. (C) Brainbow etiketli 29 hpf zebra balığının sırt görünümü. İletilen ışık kanalı, 165 μm'yi temsil eden Brainbow etiketli klonların maksimum yoğunluklu projeksiyonu ile kaplanmış arka beyin ve ventrikül morfolojisini gösterdi. Rostral kalktı. (D) Arka beyinde in vivo Brainbow ekspresyonu, seyrek etiketli 41 μm'yi temsil eden maksimum yoğunluk projeksiyonlarında gösterilmiştir 51 hpf zebra balığı (D1), ve 63.5 hpf zebrabalığında 81 μm (D2). Her iki panelde de dorsal yukarı, rostral soldadır. (E) D1 ve D2'deki hücrelerin rengi, karşılık gelen üçer parsellerde göreli kanal ağırlıkları olarak ölçüldü (n = 54 hücre E1; 461 hücre E2). (F) Hücre bölünmesini takiben kız hücrelerinde hücre rengi nispeten sabit kalmıştır. 29 hpf Brainbow etiketli zebra balığının arka beyninde in vivo mitotik olayları gösteren bir dizi zaman puanı 1 saat(F1, maksimum yoğunluk projeksiyonları, 30 μm derinlik). F1'dekikara kutularda gösterilen anne ve kız hücrelerinin rengi, F2'dekiüçüncüplanda göreceli kanal ağırlıkları olarak temsil edilir. Inset, sıkıca kümelenmiş hücre renklerini göstermek için aynı çizimin yakınlaştırılmasını gösterir (M annedir; D1 ve D2 30 dk/kare ve 60 dk/üçgen) kız çocuklarıdır. Ölçek çubukları = 30 μm (C), 20 μm (D1), 16 μm (D2), ve 5 μm (F1). C, D ve F'de dTomato kırmızı, YFP yeşil ve CFP mavi olarak kodlanır. Görüntüler Brockway ve ark.11izni ile yeniden basıldı . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnterkinetik nükleer göç ve bölme geçiren hücrelerin birden fazla komşu klonları ayırt Brainbow renk kodlama ile birlikte vivo görüntüleme de zaman atlamalı. (A) 2 dpf (55 hpf; A1) ve 3 dpf (71 hpf; A2); sırasıyla 62 μm ve 47 μm'yi temsil eden maksimum yoğunluk projeksiyonları. Her zaman noktasında üç renk kodlu radyal küme ok başları ile tanımlanır. (B) A1 ve A2'deki tüm Brainbow etiketli hücrelerin rengi, B 1ve B2 'deki (n = 106 hücre, 119 hücre) ilgili üçüncül çizimlerdeki göreli kanal ağırlıkları olarak ölçüldü. (C) Zebrabalığı arka beyni 35 hpf'de Brainbow ile etiketlenmiştir (maksimum yoğunluklu projeksiyon 24 μm gösterir); kesik li beyaz kutu ile gösterilen inset, C'den arka beyinde 30 dk aralıklarla alınan zaman noktalarının D. (D) Serisinde gösterilen ilk kez noktadır. >9.5 saat bir süre gösterilir. Etiketli hücreler interkinetik nükleer göç egirdi; beyaz ok uçları apikal yüzeyde bir hücre gösterir. Hücre soma larının apikal yüzeyde yuvarlanması ve klon sayısındaki artış (örn. 5,5 saat ve sonra 8 saat kırmızı hücre) mitotik bir olay olarak kabul edildi. (E) Zebra balığının 30.5 hpf'de arka beyninin dorsolateral görünümü, beyaz kesikli ve noktalı çizginin başın yaklaşık sınırını gösterdiği Brainbow ile etiketlenir ve beyaz kesikli kutu f. (F) E'den arka beyinde 30 dk aralıklarla alınan zaman noktalarının ilk zaman noktasında gösterilen inset'i gösterir. 1.5 saat boyunca, beyaz ok başları tarafından belirtilen iki mavi hücre apikal yüzeye hareket ve mitoz geçiren görülebilir, iki ata hücreleri içeren bir klon düşündüren. Ölçek çubuğu = 20 μm (A), 25 μm (C) ve 20 μm (F). A-D'de dorsal yukarı, rostral soldadır. E ve F'de rostral soldadır. Tüm görüntülerde dTomato kırmızı, YFP yeşil ve CFP mavi olarak kodlanır. Görüntüler Brockway ve ark.11izni ile yeniden basıldı . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Zaman atlamalı Brainbow görüntüleme ventriküler zondaki hücrelerin in vivo hücre ölümü geçiren gösterir. (A) Zebrabalığı arka beyni 31 hpf'de Brainbow ile etiketlenmiştir (maksimum yoğunluklu projeksiyon 36 μm'yi temsil eder). Beyaz kesikli kutu, B. (B) A'da arka beyni 30 dk aralıklarla gösteren zaman noktalarının ilk zaman noktasında gösterilen inset'i gösterir. İlk panelde beyaz ok ucu sonraki panellerde gösterildiği gibi apoptoz yapıldı bir lavanta hücre gösterir, apoptotik organların kademeli açıklık takip hücre parçalanması ile gösterilir. Komşu etiketli hücreler boyunca sağlıklı göründü. Dorsal yukarı ve rostral solda. Ölçek çubuğu = 20 μm (B). Tüm görüntülerde dTomato kırmızı, YFP yeşil ve CFP mavi olarak kodlanır. Görüntüler Brockway ve ark.11izni ile yeniden basıldı . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, gelişmekte olan zebra balığı arka beyninde progenitor hücreleri ve nöronların klonlarını görselleştirmek ve Brainbow ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi11kullanarak in vivo onları takip etmek için bir yöntem açıklar. Bu protokolün in vitro veya ex vivo çalışmalara kıyasla en büyük avantajı, omurgalı beyninin proliferatif bölgesini zaman içinde doğal ortamında doğrudan gözlemleyebilme yeteneğidir. Bu teknik retroviral vektörler kullanarak tek bir klon etiketli önceki çalışmalar üzerine inşa edilmiştir. Buna karşılık, hspkullanımı :Zebrabow aynı anda birçok klonlar renk kodları inşa, multipleks soy izleme ve klonlar arasında dinamikleri bir odak sağlayan11. Bu protokol, diğer sistemlerde veya hücre türlerinde geliştirmeye odaklanacak şekilde değiştirilebilir. Örneğin, farklı Brainbow yapıları zebra balığı embriyolarında ifade edilebilir. Hspzebrabalığı hsp70 organizatörü kullanımı :Zebrabow Nöral atalar ve nöronlar 11 de dahil olmak üzere ısı şoku aşağıdaki hücre türlerinin çeşitli mozaik etiketleme neden olacak11, ve gen ekspresyonu üzerinde araştırmacılar zamansal kontrol sağlar29. Diğer organizatörler açıkça bu şekilde hücre soyundan çizgi olmayabilir ise ısı şok organizatörü kullanımı sürekli renk kodlu klonlar etiketleri unutulmamalıdır. Klonal kimlik ilgi çekici bir faktör olmadığında, belirli hücre türlerini etiketlemek için diğer organizatörleri kullanan yapılar kullanılabilir. Örneğin, nöroD organizatörü olgunlaşmamış nöronlar etiketlemek için kullanılabilir18,49. Ayrıca, yerine mikroenjeksiyonlar gerçekleştirmek, araştırmacılar transgenik Brainbow zebra balığı kullanmayı seçebilirsiniz, Tg gibi çizgiler de dahil olmak üzere (ubi:Zebrabow)15 ve Tg (nörod:Zebrabow)18. Bu durumda, Tg(hsp:Crea134)15gibi Cre rekombinaz ifade çizgileri haçlar, toplanan ve benzer bir şekilde muhafaza enjekte edilmemiş embriyolar üretmek. Bu protokol balıkları 1-3 dpf arasında görüntülemek için tasarlanırken, gelişimsel nörogenezin50'ninana dönemine denk gelecek şekilde zebra balığı ilginin gelişim evresine bağlı olarak daha uzun süre muhafaza edilebilir. Ancak, 24 hpf önce Brainbow ifade neden ısı şoku embriyolar için daha zararlı olabilir51. Yaşve ilgi dokusuna bağlı olarak, hedeflenen dokunun doğru yönlendirilmesi için farklı montaj stratejileri uygun olacaktır.
Özellikle protokolde değişiklikler yapılıyorsa, sorun giderme gerektirebilecek birkaç adım vardır. Dna konsantrasyonu, bolus boyutu enjekte edilen ve embriyo başına teslim edilen toplam DNA miktarı, Brainbow ekspresyonu loş veya seyrek ise veya embriyolar sağlıklı görünmüyorsa ayarlanabilir. Ayrıca, istenilen ifade elde edilmezse ısı şoku adımının uzunluğu ve zamanlaması değiştirilebilir. Görüntülemede kullanılan edinme parametreleri, mevcut lazer çizgileri ve filtrelerin yanı sıra ifade, montaj ve istenen analiz türüparlaklığına bağlı olarak değişir. Ayrıca, zaman atlamalı parametreler, ilgi olaylarının hızına ve tek bir Z yığını elde etmek için gereken zamana bağlı olarak ayarlanmalıdır. Protokoldeki en kritik adımlardan biri balığın agarose'a uygun şekilde monte edilmesidir: balığın açısı uygun değilse veya balık çok fazla agarose ile kaplıysa, optimal görüntüleme mümkün olmayacaktır. Bu tekniğin optimizasyonu biraz pratik alabilir. Ayrıca, konfokal mikroskop üzerinde FP ifadesini görüntülemeden önce montajın uygun olup olmadığını belirlemek zor olabileceğinden, görüntülemeden önce birden fazla balık monte etmek genellikle yararlıdır. Bir diğer kritik adım da görüntülenecek belirli balıkların taranması ve seçilmesidir. Mikroenjeksiyonlar, parlaklık, etiketleme yoğunluğu ve Brainbow kopya numarası gerçekleştiriyorsa balıklar arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Loş etiketleme, aşırı yoğun etiketleme veya az renkle sonuçlanan düşük kopya numarası ile balıklarda çekilen görüntüleri analiz etmek daha zor olabilir.
Bu protokol ile 16 saat11'ekadar yaşayan zebra balıklarını sürekli olarak görüntüleyebildik. Bu süre görüntüleme odasından E3 buharlaşma ile sınırlı olabilir, görüntüleme düzleminden balık büyüme, ölüm veya balık hareketi, ya da konfokal mikroskop zaman kullanıcı kısıtlamaları. Buharlaşma, mikroskop aşamasında ısı kontrollü bir aksesuar ın kullanılmasıyla azaltılabilir. Bu yaklaşım kullanılarak oluşturulan 5D veri kümelerinin önemli sabit disk alanı (örneğin, bir gecede zaman atlamalı için ~100 GB'a kadar) ve analiz etmek için yeterli bilgi işlem gücü gerektiren büyük dosyalar olma eğiliminde olduğu unutulmamalıdır.
Bu protokol, araştırmacılara, gelişmekte olan zebra balığı beynindeki nöral atalar ve kız nöronlar popülasyonu içinde renk kodlu klonları görselleştirmeleri ve zaman içinde dinamiklerini izlemeleri için rehberlik eder. Olası genişlemelerden biri, brainbow hızlandırılmış görüntülemeile uzak kırmızı FP etiketlemesinin kombinasyonudur ve gelişimdeki belirli genlerin rollerini değerlendirmek için18. Bu şekilde, manipüle edilmiş genleri ifade eden klonlar farklı bir renkte görüntülenebilir, zaman içinde izlenebilir ve Brainbow etiketli, manipüle edilmemiş komşu klonlara kıyasla. In vivo çok renkli görüntüleme sinir sistemi formları ve fonksiyonları hakkında önemli mekanik sorulara cevap vermek için kullanılabilir.
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Y. A. Pan, J. Livet ve Z. Tobias'a teknik ve entelektüel katkıları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (Ödül 1553764) ve M.J. Murdock Charitable Trust tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL transfer pipette (fine tip) | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
50 mL conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
7.5 mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 42 °C |
Epifluorescence dissection scope | |||
Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28 °C |
Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
Phenol red | Sigma | P0290 | |
Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır