Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Agrobacterium sp. aktarmak ve kendi T-DNA bitkinin genom entegre olanağı olduğu gibi transgenik bitkiler elde etmek için en çok kullanılan yöntemlerinden biridir. Burada, genetik olarak patates (Solanum tuberosum) bitkiler değiştirmek için iki dönüşüm sistemleri mevcut. A. tumefaciens dönüştürme, yaprakları bulaşmış, dönüştürülmüş hücreler seçilir ve yeni tam dönüştürülmüş bitki 18 hafta içinde etki kullanarak yeniden oluşturulur. A. rhizogenes dönüştürme, sapları bakteri bir iğneyle enjekte edilerek bulaşmış, yeni ortaya dönüştürülmüş kıllı kökleri kırmızı bir floresan işaretçisi kullanarak algılanır ve sigara dönüştürülmüş kökleri kaldırılır. 5-6 hafta içinde elde edilen bitki tam gelişmiş dönüştürülmüş kıllı kökleri ile vahşi türü çekimleri karmaşıktır. Biyokütle artırmak için dönüştürülmüş kıllı kökleri eksize kendi kendine yayılır ve. Biz kökleri suberin biyosentetik gen düzenleyici tarafından tahrik GUS muhabir gen ifade elde etmek için her iki aracılı Agrobacterium -dönüştürme yöntemleri uygulanır. GUS boyama yordam sağlanır ve hücre yerelleştirme organizatörü indüksiyon sağlar. Her iki yöntem de GUS GUS faaliyet suberized endodermis ve exodermis ve buna ek olarak, dönüştürülmüş A. rhizogenes kökleri boyama da yan kökler ortaya çıkması algılandı dönüştürülmüş patates kökleri gösterdi. Bu sonuçlar A. rhizogenes kökleri ifade edilir genler çalışmaya hızlı alternatif bir araç olabilir öneririz.

Ekonomik çıkarları dışında transgenik bitkilerin üretimi araştırma ultimate işlev genlerin göstermek için ve Bitki fizyolojisi ve geliştirme daha iyi anlamak için kendi ilgisi yok. Bitki DNA ekleme Agrobacteriumiçin en yaygın yöntem kullanılan-dönüşüm aracılı. Agrobacterium tumefaciens crown galls birçok bitki türü virüslü dokuda onun tümör-inducing (Ti) plazmid eylem tarafından elde edebilecektir. Plazmid T-DNA bölge bitki genom entegre edilecek ve doku dedifferentiation^1,2neden genlerin bir dizi içerir. T-DNA transgene tarafından bu genlerde alışverişini fenotipik etkileri³kaçınarak belirli bitki değişiklikler nesil izin verdi. T-DNA'sı klonlama transgene kolaylaştırmak için T-DNA bölge Ti plazmid genler kalan süre ikili bir plazmid denilen bir bağımsız plazmid olarak eksize (T-DNA aktarımı ve ekleme mekanizmaları izin virülans genler) olmuştur bir yardımcı plazmid yerleştirilir. Bitki biyoteknoloji araştırmaları için dönüştürme A. tumefaciens tarafından birçok avantajı vardır: Bu pahalı cihazları gerekmez, istikrarlı ve geçici bitki dönüştürme hem Gen kopya içine entegre edilir az sayıda üretmek mümkün Kromozom⁴. Ancak, çoğu bitkiler ama değil Arabidopsis, kararlı transformants nesil bitki rejenerasyonu tek bir veya birkaç hücre eksojen etki, bu işlem yapma zahmetli ve zaman alıcı kullanarak gerektirir. A. rhizogenes da kıllı kökleri veya kök-inducing (RI) plazmid⁵' te kodlanmış rol (kök loci) gen ifadesi nedeniyle enfeksiyon sitelerdeki adventif kökleri üreten bitki genom değiştirmek yapabiliyor. Her ne kadar daha az A. tumefaciensokudu, A. rhizogenes transgenik kökleri elde etmek için de kullanılır. Bu durumda, A. rhizogenes özgün T-Ri Plazmid ve ikili bir plazmid DNA'sını ikinci bir T-DNA transgene taşıyan içerir. Enfeksiyonu site kaynaklanıyor olsa veya hypocotyls olduğunda, bileşik bir bitki, vahşi türü sürgünler ortaya çıkan yeni kıllı transgenik kökleri ile elde edilebilir. Alternatif olarak, kıllı dönüştürülmüş kökleri özerk vitro ortamda karbon kaynak girişi büyüyebilir. Kök çünkü bitki yeniden oluşturma işlemi gerekli değildir ve bu nedenle daha hızlı ve daha az maliyetli hedef organ olduğunda A. rhizogenes transgenik doku üretmek için A. tumefaciens yerine kullanımı alaka kazanıyor. Önceki çalışmalarda Bu metodoloji kök belirli genler^6,7,8,9fenotipik karakterizasyonu için tahsis göstermiştir.

Patates (Solanum tuberosum) gıda ve Tarım Örgütü Birleşmiş Milletler (FAO) göre dünyanın dördüncü en önemli ürün olduğu için yumru vitaminler iyi bir kaynak olduğu için insan tüketimi için beslenme ilgisi vardır ve mineraller. Bu nedenle, patates tarımsal biyoteknoloji spot olarak yerleştirildi ve genetik ve gelişimsel için iyi bir biyolojik model^10,11çalışmalar olarak da kabul edilir. Patates dönüşüm önemli genler karakterizasyonu aracılığıyla altta yatan suberized dokularda suberin içinde yer ve biyosentezi^{12,13,14 balmumu moleküler mekanizmaları anlamak için bulunmuştur ,15,16,17}, suberin monomer taşıma¹⁸ ve transkripsiyon yönetmelik¹⁹. Suberin feruloyl transferaz gene, FHT, bu karakterize biyosentetik genlerin biridir; onun downregülasyon suberin ferulate esterleri güçlü bir düşüş ve Vakslar, patates yumrular¹⁴ile ilişkili periderm koruma güçlü bir bozulma artış sağlar. Kullanılazlar, kökleri ve Arabidopsis tohumları, onun sözde orthologue (ASFT/RWP1) nakavt de alkil ferulates suberin^20,21üreten rolüne gösterdi. Patates, FHT transkripsiyon muhabir çizgi ve FHT antikor sırasıyla organizatörü etkinlik ve protein exodermis, endodermis, phellogen türevleri ve yaralı doku¹⁵yer gösterdi.

Bu çalışmada, bir protokol A. rhizogenes yaban türü çekimleri de sürdürülür transgenik kıllı kökleri üretmek için kullanma, bileşik patates bitkiler oluşturmadan veya özerk içinde vitrobüyümeye eksize ayrıntı. Biz de tam patates transgenik bitkiler elde etmek için A. tumefaciens kullanarak iletişim kuralı sağlar. Bir vaka çalışması olarak A. rhizogenes ve A. tumefaciens ile aynı ikili vektör dönüşüm kökleri GUS muhabir gen ekspresyonu sürüş FHT organizatörü ile almak için kullanılır. Sonuçlar bildirdi ve karşılaştırıldığında.

A. rhizogenes dönüştürme Protokolü uyarlanmış ve boynuz vd.⁷ ' den değiştiren ve test genotip S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. özellikle). A. tumefaciens dönüştürme Protokolü uyarlanmış ve düşük Banerjee ve ark.²² değiştiren ve test genotip S. tuberosum ssp edildi. tuberosum (cv. özellikle) ve S. tuberosum ssp. andigena. Her iki yordamlar ana adımları şekil 1 ve Şekil 2'de, anılan sıraya göre özetlenir.

Not: Vitro transferler gerçekleştirme yordamı tüm adımları, hızlı bir şekilde yapmak ve mümkün olduğunda, tabak ya da kapalı, tencere böylece solan ve kontaminasyonu önlemek için havaya bitki maruz minimize korumak. Aksi belirtilmedikçe, tüm bitki incubations dolapları 24 ° C ışık/12 h 20 ° C karanlık ve 67 µmol m^-1 s^-112 h koşullar altında yapılmıştır. Aksi belirtilmedikçe, tüm bakteri manipülasyon ve vitro bitki transferler laminar akış kukuIeta aseptik şartlarda gerçekleştirin. Agrobacterium ve vitro bitki kültürler için tüm medya tarifleri Tablo S1içinde sağlanır.

Uyarı: Genetiği değiştirilmiş bakteri ve yürüttüğü atık konteyner bitkiler Kasası.

1. Agrobacterium kültürler dönüşümü için kullanılan

Not: (Lütfen Dr. Inge Broer tarafından sağlanan) C58C1:Pri1583⁷ A. rhizogenes dönüştürme için kullanılan zorlanma ve bunun için A. tumefaciens (lütfen Dr Salomé Prat tarafından sağlanan) GV2260 oldu. A. rhizogenes ile ikili vektör PK7GWIWG2_II-T-bir dönüşüm işareti taşıyan kıllı kök izlemek için DNA içeren RedRoot (VIB-bölümü bitki sistemleri Biyoloji Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) dönüştü oluşumu. A. rhizogenes ve A. tumefacienstarafından oluşturulan dönüştürülmüş kökleri karşılaştırmak için her ikisi de β-glucoronidase (GUS) muhabir gen sürüş FHT organizatörü taşıyan bir T-DNA içeren ikili vektör pKGWFS7 ile dönüştürülmüş ve sefaloridin direnç gen olarak seçilebilir işaret¹⁵.

1. Agrobacterium kolonisi almak ve bu gecede (O/N) antibiyotik (Tablo S1) ile desteklenmiş YEB orta 5 ml 200 devir / dakikada sallayarak ile 50 mL santrifüj tüpü 28 ° C'de büyümek.
2. A. tumefaciens dönüştürme için OD₆₀₀ olmalıdır optik yoğunluk ölçmek = 0,6-1.0.
   1. Optik yoğunluk daha yüksek ise, OD₆₀₀ düşürücü bir alt kültür olun kültür OD₆₀₀ ulaşıncaya kadar taze medya ve bekleme ile 0,3 = = 0,6-1.
3. Agrobacterium kültür 3000 x g bir tezgah üstü santrifüj oda sıcaklığında 10 dakika içinde de 1 mL santrifüj kapasitesi.
4. Pipetting tarafından süpernatant kaldırın ve 1 mL taze YEB orta Antibiyotikler olmadan hücrelerde resuspend. Antibiyotik tümüyle kaldırılmasını sağlamak için bu adımı yineleyin.
   1. A. tumefaciens dönüşüm için son resuspension OD₆₀₀ son optik yoğunluğu elde etmek için uygun YEB birim ekleme 0.8 =.
5. Hücreler buz bulaşması için bitkiler hazırlanırken tutmak.

2. bitki materyali için dönüştürme

1. Bir ya da iki düğüm kök kesimler de apikal veya steril vitro patates bitkilerden (donör bitkiler); yardımcı tomurcukları içeren yapmak Onları 3-4 hafta boyunca (şekil 1A ve şekil 2A) katı 2MS orta tencere içinde büyümek.

3. bitki A. rhizogenes (şekil 1) kullanarak dönüştürme

Not: Bu prosedür dönüştürülmüş kıllı kökleri almak sağlanır. Transgene ifade değerlendirmek için bir negatif kontrol gereklidir. Negatif kontrol hazırlamak için dönüştürülmemiş ya da dönüştürme marker gen içerir boş vektör ile dönüştürülmüş bir A. rhizogenes zorlanma kullanarak yordamı izleyin.

1. Taze medya tabak kullanın; Alternatif olarak, tabakları, kapak tarafı ile 4 ° C'de medya kurutma önlemek için şeffaf filmle sıkıca kapalı tutulabilir. Kare medya tabak hazırlamak için onları ~ 15 °, MS, 40 mL ile doldurun eğim ve kuvvetlendirmek bildirin. Bu bitki ile orta hava parçası temasını en aza indirmek olacaktır.
2. Çok dikkatli bir şekilde bir donör bitki bir 120 x 120 mm kare tabak 2 MS ortamından aktarmak.
3. Cerrahi bir iğne A. rhizogenes kültürünün bir kök düğümler arası 3 μL için enjekte ve farklı internodes mümkün olduğunda bitki başına iki kez tekrarlayın.
   Not: her enjeksiyon bir bağımsız dönüşüm olayı (şekil 1B) olarak düşünün.
4. Hemen tüm bitki katı MS Orta 0,1 mM acetosyringone ile takviye ile kare bir tabağa aktarın. Plaka başına 2 bitkiler karşılamak.
   Not: 1 M acetosyringone hisse senedi çözüm DMSO içinde hazırlanan ve -20 ° C'de depolanan
5. Cerrahi bant kullanarak plaka mühür ve dikey 4 gündür bir büyüme kabine içinde düzenleyin.
6. Bitki için yeni bir kare plaka A. rhizogenesöldürmeye sefotaksim sodyum ile [500 µg/mL] desteklenen MS orta aktarabilirsiniz.
7. 10-12 gün sonra kıllı kökleri (şekil 1 c,1 D) görünmesini başlayacak. Daha sonra yerli bitki köklerinin tüketim ve bitki için yeni bir kare tabak sefotaksim sodyum [500 µg/mL] ile desteklenen MS orta aktarabilirsiniz.
   Not: Dönüştürülmüş kıllı kökleri tarafından kırmızı Floresans ne zaman bir DsRed dönüşümün işaretçisi (şekil 3D) kullanarak kontrol edilebilir.
8. Kompozit tesisi (şekil 1E) elde etmek için 3-4 hafta sefotaksim sodyum [500 μg/mL] ile desteklenen MS ortamda büyümeye transgenik kıllı kökleri izin (orta her hafta değiştirin).
9. Amacına bağlı olarak takip transgenik kıllı kökleri ve negatif kontrolleri yaymak.
   1. Bir hydroponic (Tablo S2) veya toprak orta büyük gelişme için izin vermek için tüm bileşik bitki aktarın.
   2. Kırmızı floresan dönüştürme işaretleyici (DsRed protein) ifade kökleri kesilmiş bir neşter kullanarak tek tek dönüştürülmüş kıllı kökleri yaymak için ne zaman onlar 4-8 cm uzunluğunda (şekil 1E) ve onları bir petri Gamborg B5 katı orta ile içine transfer % 2 sukroz ve sefotaksim sodyum ile [500 μg/mL] desteklenmiştir. Plastik laboratuar film ile plakalarının ve onları 20 ° C'de karanlıkta büyümek
      Not: Kökleri steril koşullarda ( Tablo malzemelerigörmek) floresan algılamak için donatılmış bir stereomicroscope altında manipüle edilebilir.
   3. Biyokütle üretimi (yani, gen ifade analizi) için 5 cm uzun kıllı kök kesmek ve ile Gamborg B5 sıvı orta % 2 sukroz ve sefotaksim sodyum ile [500 µg/mL] takıma 20 mL 150 ml Erlenmeyer şişeye aktarabilirsiniz. Bu karanlıkta 20 ° C ile 60 d/d, 6 hafta boyunca büyümeye.

Resim 1: patates transgenik kıllı kökleri A. rhizogeneskullanarak elde etmek için zaman çizelgesi '. Dönüşüm süreci ve kıllı kökleri büyümek için sonraki adımları her aşamada ulaşmak için toplu hafta gösterilir. Farklı aşamalarında temsil edici görüntüleri tasvir: 3-hafta-yaşlı vitro kullanarak işlemi başlatma tertibatları (A), o zaman enfeksiyon bitkilerin A. rhizogenes (B), proliferatif oluşumu enjekte edilerek doku (C, ok) gelişmekte olan kıllı kökleri (D) ile ve kırmızı floresan dönüşümün işaretçisi DsRed (E) ifade gelişmiş kıllı kökleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. bitki A. tumefaciens (Şekil 2) kullanarak dönüştürme

Not: Bu prosedür dönüştürülmüş bitkilerin almak sağlanır. Transgene'nın etkisini değerlendirmek için bir negatif kontrol gereklidir. Bir seçenek ile boş vektör dönüştürülmüş bir A. tumefaciens kullanarak yordamı takip etmektir. Alternatif olarak, vahşi türü bitkiler kullanılabilir.

1. Keser ve bir yaprak (şekil 2A) 3-4-hafta-yaşlı bitkilerden bir kabında yerleştirir. Bir neşter kullanarak petiole dışlamak ve enine keser (yaprak boyutuna bağlı olarak 1-3) (şekil 2B) kesme kaçınarak kenarları yaprak Merkezi'nden yapmak.
2. Hemen taze 2MS üzerinde 10 mL sıvı bir petri abaxial tarafı ile medyada yukarı yüzen yaprak yerleştirmek ve plaka kapatın. İlâ 15 accomodating adım cv. özellikle yaprakları yineleyin ve 25 (yaprak boyutu) bağlı olarakndigena ssp. için bırakır.
3. Hemen A. tumefaciens kültürünün 80 µL OD₆₀₀ eklemek sıvı ortamda 0.8 = ve bakteriyel çözüm dağıtmak 1 dk için el ile plaka lunaparkçı.
4. Dikkatle film mühürleme ile mühür, alüminyum folyo ile kapatın ve 24 ° C'de ortaya dönüştürme izin için bir odasında 2 gün kuluçkaya.
5. CIM orta (şekil 2B) kadar abaxial yan tutmak yapraklarını aktarın ve onları bir hafta içinde bir büyüme kabine için kuluçkaya.
   1. Böylece yapraklar daha iyi medyada kalabileceği CIM orta cımbız ile kazı.
6. SIM orta (şekil 2C) kadar abaxial yan tutmak yapraklarını aktarın ve onları bir büyüme orta her 7-10 günde, sürgünler 2 cm boyunda olana yenileniyor kabine kuluçkaya.
   1. Böylece yapraklar tamamen medya tarafından çevrili olmak SIM orta cımbız ile kazı. Ortaya sürgünler kapağı ulaştığınızda, uzun boylu Petri yemekler ile çalışmak (100 x 20 mm, yükseklik x çapı).
      Not: 6-7 hafta (şekil 2E) sonra SIM orta (şekil 2B) ve sürgünler 2-3 hafta sonra Kallus oluşturacak. Çekimleri ne zaman onlar bağımsız yarasından oluşmuş Kallus ortaya bağımsız dönüşüm olayları olarak kabul edilecektir.
7. Kesme üç vuruyor ortaya çıktı (aynı dönüşüm olayı olarak kabul edilir) her Kallus (şekil 2E), onlara kültür şişeler MG orta ile sefotaksim sodyum [250 mg/L] ile izin vermek için takıma transfer destekliyorum, etiket alt bir sayı ile ve bir büyüme kabin 3-4 hafta için ya da sürgün dinç (şekil 2F) kadar kuluçkaya.
   Not: sürgün, kesme kaldırdığınızda de Kallus aksi takdirde kök oluşturacak değil.
   1. Olarak bağımsız satırları gerektiği kadar yineleyin. En fazla 5 farklı dönüştürme olayları farklı etkinlikler bitkilerden değil karışık tam güven içinde çalışmak için 8 cm çapında bir kültür şişesi yerleştirilebilir.
8. Her olay en güçlü bitki seçin, 3-4 internodes ile çekim apikal segment keser ve yeni bir kültür şişeye sefotaksim sodyum [250 mg/L] ile desteklenmiş 2MS orta ile yerleştirir.
   Not: 3-6 hafta içinde bitki verimli bir şekilde büyüyecek, güçlü bir çekim ve kökleri gelişmekte.
   1. Seçilen bitki tam olarak geliştirmiştir kadar seçili olmayan sürgünler odasına getir.
9. En az bir düğümler arası veya apikal bud ile bitki kök kesimleri kesme ve sefotaksim [250 mg/L] ile desteklenen yeni 2MS orta aktarabilirsiniz. Onları kabine büyüme kuluçkaya.
   1. Her 3-4 hafta dönüştürülmüş vitro hatları kurmak için çoğaltma.
      Not: Sefotaksim sodyum 2MS orta için en az üç sonraki transferler emin olmak için A. tumefaciensöldürmek için gereklidir; A. tumefaciens büyüme gözlem yapılırsa, daha sonra bitkiler tekrar sefotaksim sodyum ile desteklenmiş 2MS medyaya aktarmak.
10. Bitki fenotip karakterize etmek için bitkiler toprak tam onların karakterizasyonu için ya da suda kültür kök muayene için aktarmak.
    1. Toprakta yaymak ve kurulan satırları korumak için üretilen yumrular tutun.

Resim 2: patates elde etmek için zaman çizelgesi dönüştürülmüş A. tumefacienskullanarak bitkiler. Dönüşüm süreci ve bitkiler büyümek için sonraki adımları her aşamada ulaşmak için toplu hafta gösterilir. Farklı aşamalarında temsil edici görüntüleri tasvir: işlemi kullanarak başlatma (A) 3 - hafta eski vitro bitkilerin yaprakları, yaralı ve virüslü transferini CIM medya (B), ne zaman transfer yaprakları yaprakları SIM medya (C), yaralı alanların etrafında Kallus görselleştirme SIM medya (D), SIM medya (E) 9-11 hafta sonra ateş oluşumu ve (F) MG medyaya transfer ediliyor sonra sürgünler 2-3 hafta sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

5. hydroponic kültür

1. Hoagland'ın çözüm yarım strength için hazırlamak (0.5 x) (Tablo S2) 10 L kova.
2. Homojenliği ve uygun oksijen koşulları korumak için bir akvaryum pompası sokmak.
3. Karanlık koşullarda kökleri büyümeye alüminyum folyo ile kova duvarlarını kapsayacak.
4. Kök zarar kaçınarak, vitro bitkiler için hydroponic kültür aktarın.
   Not: kökleri mikroorganizma yayılması kuluçka sırasında dikkatli bir şekilde suya batırılır kökleri sallayarak önlemek için kalan herhangi bir vitro ortamda kaldırın.
5. Şeffaf film yeterli iklimlendirme ve büyüyen odasında kuluçkaya sağlamak bir sera gibi bitkilerle kapsar.
6. 3 gün sonra filmde delikler yapmak ve tamamen bir hafta sonra çıkarın.
7. Taze medya ile 10 günde değiştirin.

6. GUS histochemical muhabir gen tahlil

Not: bizim durumumuzda GUS analiz 2-3 hafta suda veya içinde vitrokökleri ile gerçekleştirildi.

1. Kökleri % 90'ı soğuk aseton (v/v) ile düzeltmek ve 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya.
2. Distile su ile iki yıkama gerçekleştirin.
3. Taze GUS çözüm (Tablo 1) Boyama ekleyin ve vakum uygulayın (-70 Pa) 20 dk için.
4. İçinde karanlık bir mavi renk görünene kadar veya 4 h için ışığa duyarlı GUS korumak için 37 ° C'de kuluçkaya.
   Not: Ferri ve ferrocyanide GUS çözümde varlığı reaksiyon ürünleri Difüzyon en aza indirmek ve daha kesin yerelleştirme sağlar.
   Dikkat: bir duman başlığı kullan ve toksik siyanür türevleri GUS çözüm (potasyum ferricyanide ve potasyum ferrocyanide) ele alırken koruyucu giysi giyin. GUS substrat ve elden çıkarma malzeme güvenli bir şekilde atılmalıdır.
5. Çözüm boyama GUS kaldırmak ve uygun kaplarda atın.
6. Etanol % 70 (v/v) ile iki yıkama gerçekleştirin.
7. Parlak alan mikroskop altında gözlemlemek.
   Not: boyama GUS için birkaç hafta stabil; Ancak, ilk haftasında GUS sinyal açıktır ve komşu hücrelerin içine daha az dağılır. Daha uzun depolama, tüp mühür ve 4 ° C'de depolayın

Tablo 1: GUS boyama çözüm tarifi.

Agrobacterium rhizogenes -patates dönüştürme aracılı

Bu makale, A. rhizogenes ile dönüştürülmüş kök elde etmek için adım adım yordam sunulur. Şekil 1 tamamen (üzerinden tam olarak gelişmiş kıllı kökleri edinmeye A. rhizogenes enjeksiyon) yaklaşık 5-6 hafta sürer yordamı, genel bir bakış sunar. O zaman, bitki bileşik (vahşi türü ateş, transgenik kök) veya eksize ve özerk katı Gamborg B5 orta % 2 Sükroz ile desteklenmiş yetiştirilen klonlar transgenik kıllı kök olarak okudu olabilir. Alternatif olarak, kıllı kökleri ağır sıvı Gamborg B5 medya kullanarak yayılamaz. Sunulan yordamı S. tuberosum spp. tuberosum ile (cv. özellikle) yapılmıştır.

Yordamı izlemek ve patates transgenik kıllı kökleri elde etmek için yöntem bir dönüşümün işaretçisi (VIB-bölümü bitki sistemleri Biyoloji Universiteit Gent, PK7GWIWG2_II-RedRoot) olarak DsRed ile ikili bir vektör kullanılarak doğrulandı. Bu kırmızı Floresans tarafından gelen transgenik olmayan transgenik kıllı kökleri ayrım izin verdi. Bu göre yeşil ışık ile aydınlatılmış zaman kırmızı Floresans dönüştürülmüş kıllı kökleri şekil 3 ' te sergiledi. Dönüştürülmemiş Agrobacterium kullanarak negatif kontrol yok kırmızı Floresans (şekil 3 c), transgenik kıllı kökleri (şekil 3D) tanımlamak için DsRed dönüştürme işaretçiyi uygunluğu gösteren genel gösterdi. Diğer dönüşüm işaretleri antibiyotik direnci gibi diğer yazarlar^23,24tarafından açıklandığı gibi kullanılabilir; Ancak, medya antibiyotik transgenik kökleri işaretçiyi içeren büyüme gecikmeden üretebilir.

Şekil 3: A. rhizogenestarafından dönüştürülmüş floresan transgenik kıllı kökleri patates (cv. özellikle). Kıllı kökleri bir sigara dönüştürülmüş A. rhizogenes kullanarak elde edilmiştir (C58C1 soy: pRI1583) (A ve C) ve boş vektör pK7GWIWG2_II-kırmızı-kök taşıyan ile dönüştürülmüş A. rhizogenes (zorlanma C58C1:pRI1583) ile bir DsRed dönüşümün işaretçisi (B ve D). Kıllı kökleri her iki enfeksiyonlar (A, B) oluştu ama kırmızı Floresans sadece içinde gözlenen kıllı kökleri içeren ikili vektör A. rhizogenes ile dönüştürülmüş olduğunu. Görüntüleri kırmızı Floresans görselleştirmek için bir lamba ve belirli bir filtre ile donatılmış bir stereomicroscope ile alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Agrobacterium tumefaciens -patates dönüştürme aracılı

Elde edilir, adım adım, bu el yazması açıklanan ikinci protokol ayarlamak A. tumefaciensile dönüştürülmüş bir tam patates bitki. Resim 2 (--dan yaprak hastalık A. tumefaciens ile tam olarak rejenere bitkiler elde etmek için) 15-18 haftalar arasında tamamen alır yordamı, genel bir bakış sunar. En zaman alıcı yordamı bitki yenilenme organogenesis tarafından parçasıdır. Bu özel adım bu yöntem daha zahmetli A. rhizogeneskullanarak daha yapar. S. tuberosum spp. tuberosum (cv. özellikle) ve S. tuberosum ssp. andigena, tuberization. ikna etmek için short-day koşullara daha az bağımlı olmak eski yordamı yapılmıştır

A. tumefaciensiçinde-aracılı dönüşüm, aksine A. rhizogenes -aracılı dönüştürme, rejenere tesisleri tamamen transgenik organizmalar. Ancak, transgenik bitkiler sefaloridin seçici medyada yeniden oluşturulur rağmen tüm satırları verimli transgene hızlı. Bu nedenle, doğrulama transgene ifade gereklidir.

Karşılaştırma kökleri FHT organizatörü faaliyete kullanılarak elde A. tumefaciens ve A. rhizogenes

Yukarıda belirtilen yordamlar FHT gen organizatörü altında GUS gen ifade kökleri üretmek için uygulandı. Tam dönüştürülmüş A. tumefaciens bitkilerle vardı daha önce raporlanmış¹⁵ikili vektör pKGWFS7 kullanarak, FHT organizatörü içeren. Şimdi, bu ikili vektör dokular karşılaştırmak için yeni dönüştürülmüş kıllı kökleri üretmek için düzenleyici etkin olduğu kullanılmıştır ve bu nedenle kıllı kök sistemi çalışma organizatörü harekete geçirmek için bir araç olarak test etmek için.

Şekil 4 gösterir transgenik bitkilerin kökleri boyama GUS elde edilen A. tumefaciens (şekil 4AB) ve A. rhizogenes tarafından (şekil 4 cD, E, F) elde edilen transgenik kıllı kökleri tarafından, anılan sıraya göre. Görüldüğü gibi kökleri A. tumefaciens ile değiştirdi ve yetişkin vitro göster mavi endodermis (şekil 4A), hücre katmanı korteks ve stel arasında boyama. Daha fazla bilgi için kökleri, geliştirilen mavi etiketleme parçalıdır exodermis (şekil 4B) karşılık gelen dış katmanı. Suda yetişen dönüştürülmüş kıllı kökleri GUS marker özellikle yan kökler (şekil 4 dE), ortaya çıkması olarak endodermis (şekil 4 cE), yaralı alanları (şekil 4E yer oldu ) ve exodermis (şekil 4F). Kökleri yok GUS leke negatif denetimlerinde, her iki kıllı kökleri PromFHT:GUS T-DNA kaset veya vahşi türü kökleri olmadan olduğunu gösterdi.

Resim 4: Histochemical gözlem FHTdüzenleyici tarafından tahrik GUS muhabir gen ifade transgenik patates köklerinin. A. tumefaciens (S. tuberosum ssp. andigena) dönüştürme (A-B) Haritayı mavi endodermis(a)ve exodermis (B) Boyama tarafından elde edilen tam transgenik bitkiler kökleri. Transgenik kıllı kökleri dönüştürme (C-F) görüntülemek boyama GUS endodermis (C ve E), A. rhizogenes (S. tuberosum ssp. tuberosum cv. özellikle) yan kök elde ortaya çıkması (D ve E), yara iyileşmesi bölgesinde (E) ve (F) exodermis. Endodermis (tr); Exodermis (eski); Xylem (XL); Yanal kök (LR) primordia. Kırmızı ok yaralı alanı gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Masa S1: Medya tarifleri bitkiler büyüyen bakteriler ve vitro için kullanılır.  Bu tablo indirmek için buraya tıklayınız

Masa S2: Suda patates bitki yetiştirme için yarım güç Hoagland'ın çözüm. Bu tablo indirmek için buraya tıklayınız

Patates, istikrarlı tam transgenik bitkiler elde etmek için en yaygın sistem eksojen etki kullanarak organogenesis gerektiren Agrobacterium tumefaciens suşları tarafından dönüştürme kullanır. Sigara-T-DNA vektör sıra²⁵entegre potansiyeline göre Agrobacterium protokolleri sahip olmasına rağmen bu metodoloji hala en kolay ve daha az pahalı patates bitkiler dönüştürmek kullanılabilir. Son yıl içinde A. rhizogenesilgi-aracılı dönüştürme transgenik kökleri A. tumefacienskullanarak daha kısa dönemlerde elde etmek için izin verdiği için araştırmacılar ilgi var. A. rhizogenes yine genler enzimler phytohormone auxin kontrol ve cytokinin sentezi için kodlama bir dizi taşıyan kök-inducing (RI) plazmid korur ve için kodlama²⁶opines. Ri T-DNA ana bilgisayar genomik DNA eklendiğinde, yeni hormonal denge Proliferasyona kökleri, kıllı kökleri, enfeksiyon²⁷noktalarda ortaya çıkan denilen oluşumu inducing enfekte hücreleri deregulates. Ek bir ikili vektör yabancı bir DNA tümleştirmek için kullanıldığında, RI plazmid korunması dönüştürülmüş kıllı kökleri ile hayır lüzum-in organogenesis exogenously uygulanan etki²⁸kullanarak elde etmek için olasılık confers. Kıllı kökleri bileşik bir bitki üreten vahşi türü ateş bağlı korunabilir veya kendi kendine yayılan olabilir. Kendi kendini yaymak için bu yeteneği kıllı köklerin üretimi değerli metabolitleri veya yabancı proteinler, İlaç sanayii ve hatta phytoremediation alanları () oluşturmak için biyolojik bir sistem olarak çeşitli bitkiler kıllı kökleri üretmek için istismar gözden geçirme^29,30için bkz.). Patates (var. Kufri Bahar), transgenik komple tesis kıllı kökleri Hepatit B yüzey antijenleri (HBsAg)²³ifade üretmek için vahşi türü A. rhizogenes gerilme ile bulaşmış. Alternatif olarak, tam bir transgenik bitki kıllı kökleri yeniden elde edilebilir ama patates bitki ve yumrular dönüştürülmemiş kontrollere göre farklı gelişme gösterdi. Fenotip bu farklılıkları nedeniyle özgün Ri T-genom^31,32içinde entegre DNA vardır.

Bu çalışmada, transgenik elde etmek için ayrıntılı yordamlar kıllı kökleri A. rhizogenes kullanarak kararlı ve istikrarlı transgenik bitkiler A. tumefaciens kullanarak (Resim 1 ve Şekil 2) sunulmaktadır. Tam olarak gelişmiş transgenik kıllı kökleri 5-6 hafta içinde elde edilmiştir, transgenik kökleri A. tumefaciens kullanarak 15-18 hafta dönüştürülmüş hücreleri ve seçimi ve dönüştürülmüş bitkilerin yayılma organogenesis gereksinimi nedeniyle gerekli. Elimizde, A. tumefaciens dönüştürme yordamı etkili biçimde S. tuberosum ssp. andigena ve ssp. tuberosum içinde (cv. özellikle), bildirilen dönüşüm verimliliği ile yaklaşık %35²² ve % 48 ^{çalışır 12}, anılan sıraya göre. Açıklanan A. rhizogenes dönüştürme yordamı dayanmaktadır üzerinde boynuz⁷tarafından bildirilen, hangi göstermiştir yüksek (% 80-100) cv. özellikle dönüşüm verimliliği ve diğer üç patates çeşitlerin (Albatros, Sabina ve Saturna).

Patates kökleri ile aynı ikili dönüştürmek için her iki sistemin vektör A. rhizogenes patates için bir alternatif dönüşüm sistemi olarak fonksiyonel çalışmalar sunmak için ve ilk varlığı Ri T-DNA endişe meselesi olup olmadığı, biz kullanılan belirtmek için bir T-DNA suberin biyosentetik gen (FHT) GUS muhabir gen ifadesinin sürüş bir organizatörü ile yer. A. tumefaciens içinde bitkiler dönüştürülmüş histochemical çözümleme ortaya, iç ve dış suberized Katmanlar köklerinin FHT düzenleyicinin etkinliği oldu (endodermis ve exodermis, sırasıyla) (şekil 4A,B ) ve aynı zamanda yaprak, kök ve yumru¹⁵yaralı alanlarında. Dönüştürülmüş A. rhizogenes kıllı kökleri, etkinlik aynı zamanda endodermis ve exodermis ve yaralı kök alanlarda (şekil 4E) tespit edilmiştir. Ri T-DNA entegre dönüştürülmüş kökleri her iki tür suberin organizatörü faaliyete eş oluşumunu gösterir suberization için en az bu kök dokularda ilgili gelişim süreçlerini etkilemiyor. Dönüştürülmüş kıllı kökleri de FHT düzenleyicinin yan kökler (şekil 4 d,E) ortaya çıkması çevreleyen alanlarda faaliyet tespit ettik. Bu suberin monomerleri nakliyesi gibi dahil diğer genler tarafından bildirilen organizatörü aktivite ile kabul eder ABCG11 / WBC11^33,34,35,36 veya regülatör StNAC103 ¹⁹. patates dönüştürme suberin gen çalışmaya A. rhizogenes tarafından zaten son zamanlarda³⁷ ve ayrıca bu durumda kıllı kökleri CYP86A33, bir yağ asidi organizatörü aktivasyonu göstermek için izin bildirilmiştir Ω-hidroksilaz. Ancak, kökleri boyama GUS Fluorometrik tahlil kullanarak sayısal toplu oldu, dolayısıyla suberized dokularda belirli ifade sadece tahmin.

Tamamen bu sonuçlar kanıt A. rhizogenes dönüşümdür hücre türüne özgü organizatörü aktivasyonu suberin ilgili genlerin kökleri, diğer yandan dayalı çalışmalar için uzatılabilir keşfetmek için daha hızlı bir alternatif araç şu işlemleri kökleri oluşur. Sözleşmesinde, bazı diğer fonksiyonel genetik çalışmalar A. rhizogenes patates, domates ve okaliptüs gen işlevi^6,eğitim^7,8,-⁹, göstermek için kullanımında başarılı olmuştur hormonal yanıt^38,39 veya organizatörü etkinlik^40,41. Ancak, bu strateji hala sınırlamalar, özellikle Ri T-DNA tarafından veya bütün bitki veya yumrular veya diğer organlara kökleri farklı belirlenmesi istediğinizde deregulated sıkı kontrol gelişimsel süreçleri okurken takdim edebilir miyim? Bu durumlarda, A. tumefaciens dönüşüm sistemi hala tercih edilir.

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu eser "gayri resmi" de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, PB FPI hibe), "gayri resmi" de Economía y Competitividad ve finansman (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) FEDER ve Girona Üniversitesi (doktora hibe SF ve grant tarafından desteklenmiştir SING11/1). Yazarlar Dr. Inge Broer (arazi kullanımı, üniversite Rostock, Rostock, Almanya Enstitüsü) ve Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, İspanya) A. rhizogenes ve A. tumefaciens zorlanma sağlamak için minnettarız, sırasıyla ve Dr Marçal Soler ve Dr Anna Plasencia A. rhizogenes dönüştürme deneyler başlatılıyor alınan destek ve yardım için (Toulouse III Paul Sabatier Üniversitesi — CNRS, bitki Araştırma Laboratuvarı (LRSV), Castanet Tolosan, Fransa). Yazarlar Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) laboratuvar iş dışarı taşıyan ve bitkiler ve Ferran Fontdecaba ve Carla Sánchez yardımcı bazı deneyler ile onlar yapıyor iken Bakımı onun değerli yardım için teşekkür ederiz onların son derece proje.