Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

Biz bir bioprintable aljinat/jelatin bioink gömülü ölümsüzleştirdi tümör ve fibroblast hücreleri içeren türdeş olmayan meme kanseri modeli geliştirilmiştir. Model vivo içinde tümör microenvironment recapitulates ve çok hücreli tümör pulcuklarının, kavrama tumorigenesis sürüş mekanizmaları içine verimli oluşumunu kolaylaştırır.

Yerel tümör microenvironment hücresel, Biyokimya ve biyofizik heterojen geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü kullanarak büyüyen ölümsüzleştirdi kanser hücre hatları ile recapitulated değil. Sayede hücreler farklı türde katıştırılmış türdeş olmayan üç boyutlu (3D) tümör modelleri oluşturmak için bioprinting teknikleri kullanarak bu zorlukların üstesinden gelebilir. Aljinat ve jelatin bioprinting biyouyumluluk, Biyomimikri ve mekanik özellikleri nedeniyle istihdam en yaygın Biyomalzeme ikisidir. İki polimerler birleştirerek, bioprintable bileşik hidrojel yerli tümör stroma mikroskobik mimariye benzerlikler ile elde etti. Biz yolu ile bileşik hidrojel Reolojisi baskıya okudu ve en uygun yazdırma penceresi elde. Meme kanseri hücreleri ve fibroblast hydrogels içinde gömülü ve in vivo microenvironment taklit eden bir 3D model oluşturmak için yazdırılabilir. Bioprinted heterojen modeli uzun vadeli hücre kültürü (> 30 gün) için yüksek bir canlılık sağlar ve destekler çok hücreli tümör pulcuklarının (MCTS) içine meme kanser hücrelerinin kendinden montajlı. Biz göç ve kanser ilişkili fibroblast hücre (restorantlar) etkileşim MCTS bu modelde gözlenen. Bioprinted hücre kültür platformlar ortak kültür sistemleri olarak kullanarak, tumorigenesis bağımlılığını stroma kompozisyon çalışması için benzersiz bir araç sunar. Bu teknik özellikleri yüksek üretilen iş, düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik ve ayrıca geleneksel hücre monolayer kültürleri için alternatif bir model ve kanser biyoloji çalışmaya hayvan tümör modelleri sağlayabilir.

2D hücre kültürü yaygın kanser araştırmalarında kullanılan rağmen hücrelere besin ve oksijen Tekdüzen bir konsantrasyon monolayer biçimiyle yetiştirilen gibi sınırlamalar var. Bu kültürler eksikliği önemli hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri yerli tümör microenvironment (TME) mevcut. Sonuç olarak, bu modeller özetlemek kötü sonuçlanan anormal hücre davranışları doğal olmayan türleri morfoloji, düzensiz reseptör organizasyon, membran polarizasyon ve aralarında anormal gen ekspresyonu da dahil olmak üzere, fizyolojik şartlarda koşulları^1,2,3,4. Öte yandan, 3D hücre kültürü, nerede hücreleri hacimsel bir alanda toplamları, pulcuklarının veya organoids genişletilir, temel hücre biyolojisi ve Fizyoloji çalışmaya daha doğru vitro ortamlar oluşturmak için alternatif bir teknik sunar. 3D hücre kültür modelleri aynı zamanda yerel TME vitro^1,4,5kritik fizyolojik özellikleri hücre-ECM etkileşimleri teşvik edebilir. Ortaya çıkan 3D bioprinting teknoloji heterojen TME taklit modeller oluşturmak için olanak sağlar.

3D bioprinting hızlı prototipleme türetilir ve yaşam karmaşıklığı bazılarına taklit yeteneği olan 3D microstructures imalatı sağlar doku örnekleri^6,7. Geçerli bioprinting yöntemleri mürekkep püskürtmeli, ekstrüzyon ve yazdırma⁸lazer destekli içerir. Bunlar arasında Ekstrüzyon yöntemi heterojenite içinde yazılı matrisler malzemelerin farklı türleri farklı başlangıç yerlerde tam konumlandırma tarafından denetlenmesini sağlar. Bu nedenle, bu hücre veya matrisler birden çok türü içeren türdeş olmayan vitro modelleri imal etmek en iyi yaklaşımdır. Ekstrüzyon bioprinting kulak çevresi şeklindeki iskele⁹, vasküler yapılar^10,11,12, kurmak ve doku¹³yüksek yazdırma sadakat ve hücre ile sonuçlanan, cilt için başarılı bir şekilde kullanılmıştır canlılığı. Teknoloji de çok yönlü malzeme seçimleri, bir bilinen yoğunluğu ve yüksek tekrarlanabilirlik^{14,15,16,17 ile gömülü hücrelerle malzemeleri yatırmak için yetenek özellikleri} . Doğal ve sentetik hydrogels sık onların biyouyumluluk, bioactivity ve yapısal olarak ECM^{7,18 benzemeye mühendislik hidrofilik ağlarına nedeniyle 3D bioprinting için bioinks kullanılır ,19,20,21,22,23}. Hydrogels, aynı zamanda beri hücreleri, yapı elemanları, geçirgenliği besin ve gazlar için yapıştırıcı siteleri içerebilir ve teşvik etmek için uygun mekanik özellikleri geliştirme²⁴hücre avantajlı vardır. Örneğin, kollajen hydrogels integrin hücreleri matrisin için eklemek için kullanabilirsiniz anchorage siteleri sunar. Jelatin, denatüre kollajen, benzer hücre adezyon siteleri korur. Buna ek olarak, aljinat bioinert ancak Glossar divalent iyonları^25,26,27,28ile oluşturarak mekanik bütünlük sağlar.

Bu çalışmada, aljinat ve jelatin, bir yerel tümör stroma mikroskobik mimarisini benzerlikler ile oluşan bir bioink olarak bileşik hidrojel geliştirdik. Meme kanseri hücreleri ve fibroblast hydrogels içinde gömülü ve üzerinden bir ekstrüzyon tabanlı bioprinter in vivo microenvironment taklit eden bir 3D model oluşturmak için yazdırılabilir. Mühendislik 3D çevre çok hücreli tümör pulcuklarının (MCTS) oluşturmak kanser hücrelerinin hücre kültürü (> 30 gün) uzun süre ile yüksek bir canlılık verir. Bu iletişim kuralı bileşik hydrogels sentezleme, malzemelerin mikroyapı ve baskıya, bioprinting hücresel türdeş olmayan modelleri, karakterize ve MCTS oluşumu gözlemleyerek yöntemleri gösterir. Bu metodolojileri ekstrüzyon bioprinting de türdeş olmayan doku modelleri farklı tasarımlar olarak içinde diğer bioinks uyuşturucu tarama, hücre göç deneyleri ve temel cep telefonundan odak çalışmaları potansiyel uygulamalar ile uygulanabilir fizyolojik fonksiyonları.

1. malzeme, hidrojel ve hücre kültür malzemelerin hazırlanması

1. Malzeme ve eriyik hazırlığı
   1. Yıkayıp kurulayın 250 mL ve 100 mL Cam şişeler, manyetik karıştırıcı, spatula, 10 mL kartuş, 25 G silindirik püskürtme (0.5 uzunluğunda) ve 250 µm bir iç çapı ile. Malzemeler tarafından ısıyla sterilize 121 ° C/15 dk onları/1 atm. tutmak malzemeler steril koşullarda kadar kullanmak.
      Not: satıcı bilgileri Tablo reçetesi bakın.
   2. Aljinat (%3 w/v) ve 7 g jelatin (% 7 w/v) (bundan sonra A3G7 belirtilir) 3 g ağırlığında.
   3. UV en az 4 h: aljinat ve jelatin tozlar için parafin film, alüminyum folyo adet 5 cm²ve 1 mL ve 5 mL şırınga ışığı altında aşağıdaki öğeleri sterilize. Sterilize akmayan alın duvarları, ipucu kapaklar ve pistonlar onları en az 4 h için % 70 etanol içinde çeker ve onları yıkamak sterilize ultra saf su ile 2 x.
      Not: satıcı bilgileri Tablo reçetesi bakın.
   4. Özel ultra saf su ile 4 g dağıtılması ve ısıyla tarafından sterilize.
      Not: Özel ısıyla işleminden sonra tamamen çözülmüş.
   5. Susuz kalsiyum klorür (CaCl₂) steril ultra saf su ve steril bir filtre 100 mM çözüm (ile 0.22 µm gözenek boyutunu) kullanılmadan önce hazırlayın.
   6. Özel kaplamalı 6-şey plakalar için steril özel bir sıvı çözüm elde etmek için bir mikrodalga eritin; sonra bir Biyogüvenlik kabini (BSC) ve 1 mL micropipette kullanarak altında iyi başına 2 mL ekleyin ve hafifçe kuyunun içinde tek tip bir katman yaratmak için karıştırın. Sakin olun ve parafin film ile iyi mühür bırakın. Oda sıcaklığında (RT) kullanımı kadar devam et.
2. A3G7 hidrojel habercisi hazırlanması
   1. 3 g aljinat ve 7 g jelatin tozlar içinde bir BSC 250 mL kabı içine karıştırmak. Manyetik karıştırıcı ve DPBS 100 mL ekleyin. Kabı kirlenmesini önlemek için steril parafin film ve alüminyum folyo ile (5 cm²) kapatın.
   2. Tozlar altında bir manyetik/sıcak plaka 600 rpm 60 ° C için 1 h ve RT ek 2 h ile sabit bir ajitasyon geçiyoruz.
   3. Malzeme 37 ° C'de ısı kadar jel sıvı durumuna bir faz geçiş uğrar (100 mL için hisse senedi jel çözeltisi, bu yaklaşık 45 dakika sürer). Çözüm steril 50 mL konik santrifüj tüpler içine aktarmak, onları kapatın ve vasıl 834 x g malzemeden herhangi bir gaz kabarcıkları ortadan kaldırmak 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi.
   4. Hidrojel habercisi 10 mL şırınga Aspire edin. Mühür kapaklar ve parafin film ile şırıngalar. Onları kadar kullanmak 4 ° C'de depolayın.
3. Hücre kültürü
   Not: Bu bölümdeki adımlarda, steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir.
   1. Bazal DMEM Orta (1 L için) aşağıdaki gibi hazırlamak: bir BSC fetal Sığır serum (FBS) 100 mL 10 mL bir antibiyotik/antimycotic çözeltisi (stabilize çözüm x 100) artı bir taze Steril konteyner içine karıştırın. Karışım ayarlamak için DMEM orta Ekle 1000 mL. Konteyner mühür ve 4 ° C'de tutmak
   2. MDA-MB-231-GFP (insan meme kanseri hücre kültürünü GFP etiketli, nükleer yerelleştirme) 1 şişe ve IMR-90-mCherry (kanser ilişkili fibroblast hücre hatları ile sitoplazmik yerelleştirme mCherry etiketli, 1 şişe (37 ° C) bir daha önce ısıtılmış su banyosunda defrost ) hücreleri onları yavaşça suya hareket tarafından sıvı azot depolama. Hem hücre satırları ve plazmidlerin GFP ve mCherry etiketleme, ticari olarak kullanılabilir.
   3. 160 µL/iyi hücre çözümü (3 x 10⁶ hücre/mL), 6-şey plaka aktarmak ve 5 mL ılık (37 ° C) Bazal DMEM orta de ekleyin. Hücrelerin % 80 izdiham ulaşana kadar 37 °C/5% CO₂ için 24-48 h plaka kuluçkaya.
   4. Hücreleri izdiham ulaştıktan sonra orta atmak ve DPBS iki kez hücrelerle durulayın; tripsin-EDTA çözüm/iyi 500 µL hücrelerle kuluçkaya (%0.25, 1 x, daha önce ısındı 37 ° C'de) için 6 dk. 37 ° C'de. Tripsin FBS 500 µL ekleyerek devre dışı bırakın, hücre çözümü yeniden elde etmek ve T-75 şişeler için transfer. Hücrelerin % 80 izdiham ulaşana kadar onları tekrar 37 °C/5% CO₂ kuluçkaya.
      Not: Tripsin-EDTA çözüm hacmi hücre büyümesini gemi bağlı olarak değişebilir.
   5. Hücreleri daha fazla metabolik aktivite ve istikrar olduğunda olduğu gibi geçiş 3-4 hücreleri ile çalışmak için önceki adımı yineleyin.
   6. Hücre hidrojel ile karışık olması ilk konsantrasyonu belirlemek için bir trypan mavi tahlil (% 0,4) kullanarak hücreleri saymak.

2. Hydrogels Rheological özelliklerini ölçümleri

1. 1.2. adımda açıklandığı gibi aljinat/jelatin hidrojel habercisi hazırlayın.
   Not: Steril koşullar mekanik test ve analiz için oluşturulan örnekleri için gerekli değildir. Tüm rheological testler nüsha uygulanmaktadır.
2. Hidrojel öncü bir şırınga al ve 1 h için 37 ° C su banyosunda ısınmak.
3. Rheometer üzerinde açmak ve sistem için aşağıdaki adımları göre başlatılamıyor.
   1. Rheometer ve hava kompresörü için 30 dk. rheometer için sıcaklık kontrol kutusunu açma rheometer üzerinde geçiş ve açmak bilgisayar çalıştırmak için rheometer bağlı izin bağlı hava kompresörü açın.
   2. Açık rheometer bilgisayar yazılımı, kontrol panelindeki Başlat ' ı tıklatın ve bitirmek başlatma işlemini izin. Platform sıcaklık kontrol Paneli'nde 37 ° C için ayarlayın.
   3. Ölçüm Seti sekmesini tıklatın ve hizmet işlevini başlatmakiçin gidin, ayarlama sürücü atalet aþaðý açýlan menüden seçin ve açılan pencerede ayarı Başlat ' ı tıklatın.
   4. Rheometer kesici takımlar için ölçme paralel bağlama. Burada gerçekleştirilen tüm deneylerin plakaları arasında bir 1 mm boşluk ile 25 mm çapında tabak kullanın.
   5. Kontrol Paneli'nde sıfır-boşluğu ayarla ' yı tıklatın ve bitirmek prosedür bekleyin. Bu işlem sırasında normal kuvvet dikkat.
      Not: Bu işlemden sonra normal kuvvet 0 olmalıdır.
   6. Ölçüm Seti sekmesini tıklatın ve hizmet işlevini başlatmakiçin gidin, ayar üst ölçüm sistemi ataletseçin ve açılan pencerede ayarı Başlat ' ı tıklatın. Bir kez bitmiş, yukarı taşımak ölçüm alet bırakmak için kontrol panelindeki üçgen düğmesini tıklatın.
4. Bir genlik operasyonunda kuralları.
   1. Başlat' ı tıklatın, sonra üst menüden, bekle aþaðý açýlan menüsünden seçin Ekle ' yi tıklatın. Kurulumu penceresini çekin ve 2 h için bekleme süresini ayarla.
      Not: Bu testler önce bekleyen adım eklemek olacaktır.
   2. Başlat' ı tıklatın, Ekle düğmesini yeniden tıklatın ve açılır menüden cihaz. Kurulumu penceresini çekin, sıcaklıkseçin ve 25 ° c olarak ayarla Değere ulaşıncaya kadar bekle, kutunun işaretini kaldırın.
   3. Ölçümadım'ı tıklatın, sonra değişken salınım zorlanmatıklatın, Kurulumu penceresini çekin, rampa logaritmasınıolmak profili ayarla ve değeri %0,001 ve % 100 ilk zorlanma ve son baskı değiştirmek, anılan sıraya göre. Frekansı 0.01 Hz ayarla.
   4. Sıcaklık değişken eklemek için Ekle düğmesini tıklatın. Değişken sıcaklık tıklatın ve 25 ° c olarak ayarla Pull-up penceresinde hesap makinesi' ni genişletin, nokta yoğunluğu on 10 puan/yıl için ayarlayın.
   5. Su banyosu dışında şırınga al ve öncü rheometer platformu üzerine yaklaşık 0.5 mL bükün.
   6. Tıklatın aşağı doğru üçgen kontrol panelinden düğme. Ölçme aracı düzeltme konum aşağı taşımak bekleyin.
   7. Ölçme aracı arasındaki sınırda kaçan herhangi bir aşırı hareketlenme öncesi ilk belirtiler ve gereksiz malzeme atmak için bir spatula kullanın.
   8. Mineral yağ ölçme aracı kenar üzerine pipet ve petrol tam sınır mühürler kadar bekleyin.
   9. Devam üzerinde Denetim Masası'nı tıklatın. Sonra alt ekran devam düğmesini tıklatarak ardından Başlat düğmesini (yeşil üçgen),'ı tıklatın.
   10. Test tamamlandığında, ölçme aracı yayımlamayı ve ardından yukarı doğru üçgen kontrol panelinden düğme. Ölçme aracı çıkarın ve % 70 etanol ile temizleyin. % 70 etanol platformuyla temiz.
   11. Geçerli projedeki ölçüm adım tıklatın ve Kurulumu penceresini çekin. Şimdi, küme sıklığı 100 Hz. için tüm diğer parametreler değişmeden tutmak.
   12. Adımları yineleyin 2.4.5 - 2.4.10.
   13. Diyagramı' nı tıklatın. G eğrisi gözlemlemek ', G " karşı salınım zorlanma. G saptırma noktaları bulmak ' her iki Frekanslar (0.01 Hz ve 100 Hz). Karşılık gelen salınım suşları için her iki saptırma puan bulmak.
   14. Daha küçük salınım zorlanma ve 1/10 bu baskı daha sonra yapılan tüm salınım testleri için kullanabilirsiniz.
       Not: G başlangıcı ' saptırma izleme testleri aşan değil nihai doğrusal elastik zorlanma (yuva) olarak kabul edilir. Oranı 1/10 genellikle güvenlik nedeniyle mühendisliğinde kullanılır. Bu hesaplanan strain g_Cgösterilir.
   15. Test yapıldıktan sonra tablo' ı tıklatın, tüm veri kopyalamak ve bir metin dosyasına yapıştırın.
5. Bir sıcaklık tarama yapmak.
   1. Benim apps ' ı tıklatın ve şablonu seçin sıcaklık rampa, salınım makaslama: jelleşme.
   2. Projesini adlandırın.
   3. İş akışındaki ölçüm adım'ı tıklatın. Sonra değişken sıcaklıktıklatın, Kurulumu penceresini çekin ve 37 ° C ve 25 ° C, sırasıyla olduğu için ilk ve son sıcaklık ayarlayın.
   4. Pull-up penceresinde salınım zorlanma %0,1, 1 Hz salınım frekansı ayarlayın. Sonra 61 olmak veri noktalarının sayısını ayarlayın. Veri koleksiyon sıklığı 1 puan/dak için tıklayın hesap makinesi ayarlayabilirsiniz ve yoğunluk gelin 0.2 ° C/nokta.
      Not: Bu sıcaklık 0.2 ° C/dk hızında değiştirmek olanak sağlar.
   5. Örnek rheometer platformu üzerinde yük ve aşağıdaki adımlarla 2.4.5 - 2.4.10 testi gerçekleştirmek.
   6. Tıklatın Diyagramı, G gözlemlemek ', G " karşı sıcaklık. Crossover G noktası bulmak ' ve G ". Çapraz bağlantı noktası sıcaklığında bulmak.
      Not: Bu sol/jel geçiş sıcaklığını hidrojel habercisi olduğunu.
   7. 2.4.15 arasındaki adımları yineleyin.
6. Bir izotermal zaman operasyonunda kuralları.
   1. Benim apps ' ı tıklatın ve bulmak ve izotermal zaman-sıcaklık testşablonu'nu tıklatın. İş akışında, ölçüm adım'ı tıklatın ve ardından değişken salınım zorlanma, salınım zorlanma için % 0,1 ve salınım frekansı 1 Hz olarak ayarlayın Kurulumu penceresinde yukarı çekin. Pull-up penceresinde veri noktalarının sayısı 120 için ayarlayın. Veri koleksiyon sıklığı 1 puan/dak için ayarlayın.
      Not: Bu zorlanma değer genlik tarama sonuçlarını temel alır.
   2. Sıcaklık değişken eklemek için Ekle düğmesini tıklatın. Değişken sıcaklık orta penceresinde tıklatın ve 25 ° C'ye ayarlayın
      1. Doğru tıkırtı iş akışı içinde belgili tanımlık adım aygıt hareket noktası ölçüm için Sil' i tıklatın. Adım aygıt değer ayarla' yı tıklatın, uncheck belgili tanımlık kutu değere ulaşıncaya kadar bekleyinve değeri 25 ° C'ye ayarla Resim, zerre, alt ekran düğmeleri tıklatın, uncheck belgili tanımlık kutu devam. O zaman başlamak, adı proje adım tıklayın ve kaydedin.
   3. Örnek rheometer platformu üzerine yüklemek ve test aşağıdaki adımları tarafından 2.4.5 - 2.4.10 başlar.
   4. G gözlemlemek ', G " karşı tam zamanı. Crossover G noktası bulmak ' ve G ". Zaman crossover noktada bulmak. Test yapıldıktan sonra tablo' ı tıklatın, tüm veri kopyalamak ve bir metin dosyasına yapıştırın.
      Not: Bu sol/jel geçiş hidrojel habercisi 25 ° C'de zamanı
7. Verim gücü çeşitli jelleşme zamanlarda ölçmek.
   1. Benim apps ' ı tıklatın ve bulmak istediğiniz şablon verim ve akış stres, jel gibi. Projesini adlandırın. İş akışını başlatmak adım'ı tıklatın. Üst menüde Ekle ' yi tıklatın ve açılan menüde bekleseçin. Kurulumu penceresini çekin ve 20 dk olmak için bekleme süresini ayarlayın.
      Not: Bu testler önce bekleyen adım eklemek olacaktır.
   2. Başlat' ı tıklatın sonra tekrar Ekle ' yi tıklatın ve açılan menüde aygıtıseçin. Kurulumu penceresini çekin, sıcaklık, açmadı ve 25 ° C'ye ayarla Uncheck belgili tanımlık kutu değere ulaşıncaya kadar bekleyin.
   3. İş akışındaki ölçüm adım'ı tıklatın, yamultma stresdeğişkeni seçin, Kurulumu penceresini çekin ve ilk ve son kesme stres sırasıyla 0 ve 10.000 Pa için ayarla.  Hesap Makinesi'ni tıklatın, nokta yoğunluğu ayarlamak için 0.2 noktası/baba. Soldaki veri noktaları sekmesinde 1 puan/saniye ayarlayın.
      Not: Bu bir stres bayiliği hızı 5 Pa/s neden olur.
   4. Pull-up penceresinin altındaki olay denetimi sekmesini tıklatın ve stop ölçüt ayarlayın: kesme > 100 s^-1oranı ölçümü durdurmak.
      Not: malzeme vermiştir, bu otomatik olarak ölçüm durdurur.
   5. Örnek rheometer platformu üzerine yüklemek ve test aşağıdaki adımları tarafından 2.4.5 - 2.4.10 başlar.
   6. Diyagramı' nı tıklatın. Soy-stres eğrisi gözlemlemek. Zorlanma ve karşılık gelen stres saptırma nokta bulmak. Aygıtlarından 2.7.2 - 2.7.6, ama 30, 40 ve 50 dk her çoğaltma için bekleme süresini değiştirmek; Bu farklı jelleşme zamanlarda verim gücü neden olur.
      Not: Bu stres belirgin verim gücü olarak kabul edilir.
      Not: yazılım tıklama rheometer modelleri ve yazılım sürümleri tarafından farklı olabilir. Sağladığımız test parametreleri referans almak okuyucuların öneririz süre belirli rheometer/yazılımında pratik kullanım kılavuzuna bakın.
       

3. iskele tasarımı, hücre yüklü hidrojel ve 3D baskı modelleri

1. İskele tasarımı
   1. Bir pervane gibi model kağıt üzerinde çizin.
      Not: Pervane gibi modeli temel alınarak aşağıdaki önemli noktalar tasarlanmıştır: (a) BT restorantlar; kanser hücrelerinin çevrelendiği vivo içinde senaryo benzetimi yapar. (b) konsantrasyonu stres ile dairesel geometrilerin kullanımını en aza indirir; (c) mevcut geometrileri değiştirmeden modele gelecekte daha fazla sektörler eklenebilir böylece esnek olduğunu; ve (d) besin difüzyon kolaylaştırmak için düz kendi dikey ölçek içinde.
   2. Pervane ortasına kaynak olduğu ve iç daire, orta kesimleri ve dış sektörler, maksimal RADIUS sırasıyla temsil etmek üzere R₀, R₁ve R₂ sembolleri kullanmak izin. Sembolleri m ve n iç yay ve sektör alanı içinde konuşmacı sayısı sırasıyla göstermek için kullanın.
   3. Pervane gibi modeli her düğümde koordinatlarını hesaplamak ve bunları R₀, R₁, R₂, mve nsembolik ifadeleri yazmak.
   4. Bir program komut dosyasını başlatmak, R₀, R₁, R₂, mve n değişkenler olarak ayarlayın ve sembolik ifade anahtar her düğümün giriş.
      Not: herhangi bir yazılım bilgi için Malzemeler tablo bakın.
   5. Düğümler bağlayan bir yol düzenlemek ve iç daire, orta kesimleri ve dış sektörleri için bir kartuş atayın. Katman kalınlığı 150 µm ve 4 için katman sayısını ayarlayın.
   6. Bir metin dosyası olarak bioprinter tarafından algılanabilmesini G-kodu biçiminde çıktı programın izin.
   7. R₀ ayarlanır 3.85, R₁ = 6.85, R₂ = 8,65, m = 2 ve n = 5 =. Komut dosyasını çalıştırmak ve oluşturulan G-code dosya almak. Kopyala Yapıştır bioprinter'ın özel G-code klasöre dosya.
   8. Bioprinter ve onun kontrol yazılımı açın. Yazıcının başlatın. Açık G-kodu komut dosyası sadece oluşturulan ve tüm baskıların sıfır olarak ayarlayın. Denetim yazılımı iade, Scaffolder jeneratörsekmesini tıklatın ve ardından sağ alt köşedeki Çalıştır düğmesini tıklatın. Yazıcının hareket yolunu gözlemlemek.
      Not: Bu oluşturulan G-code duyarlığını sınayacak. Malzemeler tablo için bioprinter ile ilgili bilgi için bakın.
   9. Bu isteğe bağlı bir adımdır. Yolu ile bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılım yukarıda parametrelere göre bir demonstrasyon 3D modeli oluşturmak.
      Not: satıcı yazılım bilgileri Tablo reçetesi bakın.
2. Bir hücre yüklü A3G7 hidrojel öncü olun
   Not: Bu bölümdeki adımlarda, steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir. Bioprinter bir BSC içinde tutun.
   1. Bioprinter % 70 etanol iyice püskürtülerek sterilize ve UV ışığına maruz bir gecede.
   2. Bir şırınga hidrojel habercisi (4 ° C'de) çıkarmak ve 1 h için 37 ° C'de bir su banyosunda sıcak.
   3. T-şişeye (bkz. Adım 1.3) hücrelerden CO ile₂ kuluçka alıp bir BSC yerleştirin. Kültür orta atın ve iki kez DPBS hücrelerle durulayın. Isıtılan tripsin-EDTA çözüm (3,0 mL) ekleyin ve 6 dk. Yinele tripsin FBS aynı hacmi ile 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Trypan mavi tahlil kullanarak hücreleri saymak.
   4. Hidrojel habercisi su banyosu üzerinden şırınga al, temizle ve % 70 etanol ile sterilize. Şırınga BSC koymak.
   5. Yaklaşık 3 mL hidrojel öncü bir 10 mL yazdırma kartuşu A'ya. MDA-MB-231-GFP hücreleri 1 x 10⁶ hücre/mL, yavaş yavaş, kabarcıklar üretimini kaçınarak pipetting tarafından habercisi karıştırın. Steril sonu ve üst kapaklar kartuşla kapak ve parafin film ile kapatın. Vasıl 834 x g için üretilen herhangi bir gaz kabarcıkları ortadan kaldırmak 1 dk santrifüj kapasitesi.
   6. 3.2.3 - 3.2.5 hücre yüklü IMR-90-mCherry habercisi ve boş hücre öncü için yineleyin.
   7. Tüm 3 Kartuşları % 70 etanol ile sterilize ve sonra onları bioprinter odaları yükleyin. Yazıcının denetim yazılımı, kartuş sıcaklık 25 ° C'ye ayarlayın. Yazdırılabilir koşulları ulaşmak habercisi izin vermek için 35 dk. bekleyin.
      Not: Bu sefer hidrojel içinde gömülü hücre canlılığı etkilemez.
3. 3D baskı modelleri
   1. Yazıcının kontrol yazılımı, yazıcının denetim yazılım Aracı kafa sekmesinde genişletin, 1 kartuş sol tarafındaki grafik arayüzü, tıklayın ve sonra meme ucunu konumunu ölçmek için ölçü kısa düğmesini tıklatın. Diğer 2 kartuşları için bu işlemi yineleyin.
   2. NET polistren Mikroplaka yerleştirin, G-kod dosyasını açın ve tüm kartuş satın alma 200 kPa basınç değiştirin. Denetim yazılımı iade, Scaffolder jeneratörsekmesini tıklatın, yazdırmayı başlatmak için bir nokta seçin ve sonra sağ alt köşedeki Çalıştır düğmesini tıklatın. 3 daha fazla çoğaltır almak için bu adımı yineleyin.
   3. Pervane modelleri tüm çoğaltır yazdırdıktan sonra 100 mM CaCl₂ eriyik-e doğru 1 dk modellerinde bölünmelerini ve durulayın eklemek 2 x ile Ca⁺⁺ iyonları fazlalığı kaldırmak için DPBS.
   4. Dikkatle modelleri bir spatula kullanarak özel kaplamalı 6-şey plaka üzerine aktarın. 5 mL DMEM medya de her şey için ekleyin. Bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂tabak kuluçkaya.
      Not: modelleri kuyu içinde yüzen emin olun.
   5. Hücre kültür orta ile taze orta yerine 3 günde, toplam 30 gün için kültür.

4. canlılığı ve küresel oluşumu deneyler hidrojel disklerdeki.

1. Hidrojel disk hazırlığı
   1. Adımları yineleyin 3.2.1 - 3.2.6.
      Not: Küçük bir steril kap kartuşla yerine mümkündür.
   2. Steril mezun 1 mL şırınga kullanın ve meme (şırınga tüp kalanıyla aynı çapı deliği vardır) şırınga büyük bir delik oluşturmak için kesti. % 70 etanol ile temiz ve kuru kadar bırakın.
      Not: steril bir BSC bunu.
   3. Bir şey-plaka kapak kullanın, yüzeyi kaplı kadar 100 mM CaCl₂ ekleyin; o zaman, şırıngayı doldurmak için hücre yüklü hidrojel al; 100 µL asılı kullanarak Yükselt bırak yöntemi. 1 dk. için hidrojel bırakın ve aşırı DPBS ile durulayın. Bir özel-kaplı 6-şey plaka hidrojel disklere transfer bazal DMEM 5 mL ekleyin ve onları ilâ 30 yaşam için 37 ° C ve % 5 CO₂ kuluçkaya. Orta 3 günde yenileyin.
2. Hücre ve küresel canlılığı
   1. Bir MTS tahlil hücre canlılığı belirlemek için kullanın. Her disk DPBS ile yıkayın ve ince bir steril bıçakla 4 parçaya kesti. Tüm diski parçaları toplamak ve bir 96-şey plakasına aktarabilirsiniz. Daha sonra her şey için DMEM 100 μL artı 20 μL MTS reaktif ekleyin ve karışımı için 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
   2. MTS reaksiyon sonra süpernatant kurtarmak ve temiz 96-şey plakasına aktar. 490, örneklerin absorbans ölçmek nm.
3. Küresel oluşumu
   1. Gün kültür 0, 7, 15, 21 ve 30 kuluçka makinesi inkübe pervane veya disk modelinden çıkarmak ve temiz 6-şey plakasına aktarmak.
   2. Confocal iplik disk ters mikroskop pulcuklarının görselleştirmek ve çoklu konumlarını ve z-yığınlar kullanarak görüntüleri elde etmek için kullanın. Her pervane veya disk modeli ile 500 µm farkı sağ ve alt üst odak düzlemi her yatay konumda için bir z-yığın edinmek için soldan yatay çapına boyunca görüntü.
      Not: satıcı bilgileri Tablo reçetesi bakın.
   3. Küresel çözümlemesi için kullanılan 2D görüntüler oluşturmak için ImageJ, program tarafından sağlanan bir maksimum yığın aritmetik aracını kullanarak görüntü yeniden.

5. Tarama elektron mikroskobu (SEM)

1. 1.2. adımda açıklandığı gibi aljinat/jelatin hidrojel hazırlayın.
   Not: Steril koşullar gerekli değildir.
   Dikkat: Sıvı azot ve paraformaldehyde tehlikelidir ve bakımı ile ele alınması gerekir.
2. 1 mL hidrojel bir harç koymak, sıvı nitrojen eklemek ve bir havaneli ile kullanarak eziyet. Defrost üzerinden hidrojel önlemek için sıvı azot eklemeye devam edin. Toz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın, kapatın ve 2 h. şeytanibir için örnek 24 h için-80 ° C'de depolayın.
3. Küresel görüntüleme için hidrojel DPBS 2 ile hafifçe yıkamak x, %4 paraformaldehyde 37 ° C'de 30 dk için daldırma tarafından hücreleri tamir ve DPBS ile yıka ve onları sıvı azot ile dondurma. Son olarak, 24 h için örnek şeytanibir.
4. Morfoloji 25.0, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile ve hidrojel/küresel yapısını analiz kV, küçük 70 Pa (oda basınç) 40 ilâ 5, X büyütme ile 000 X.

Sıcaklık süpürme A3G7 habercisi 25 ° C ve 37 ° c de ayrı bir fark gösterir Habercisi 37 ° C'de sıvı ve 1938.1 ± 84.0 mPa karmaşık bir viskozite vardır bir büyük G tarafından doğrulanır s x "G üzerinde '. Sıcaklık azaldıkça habercisi jelatin molekülleri spontan fiziksel Dolaşıklık tri-helix oluşumu^29,30içine nedeniyle fiziksel jelleşme uğrar. Her iki G' ve G "artırmak ve sol-jel geçiş gösteren 30,6 ° C'de birleşirler. Dönmeler ulaşan 468.5 ± 34,2 düşük sıcaklık ile artmaya devam G Pa' ve 140.7 ± 9,3 G Pa "25 ° c (Şekil 1a). Sıcaklık Tarama sonuçlarına göre biz yazdırma sıcaklığı 25 ° C seçti. Jelleşme kinetik deney numune hazırlama ve işleme sırasında ortaya çıkan sıcaklık değişikliği simüle (yani, 37 ° C örnek kaldırma su banyosu ve 25 ° C bioprinter odanın içine yerleştirerek). G', G ", ve | η * | zamanla alçaltılmış sıcaklık artışı ve sol-jel geçiş olmaz ~ 25 ° C'de 17 dk zaman G' ≈ G "≈ 64,3 Pa ve kayıp faktörü eşittir 1 (Şekil 1b ve 1 c). Habercisi pekiştirmek devam eder ve bir yazdırma penceresi jelleşme 50-90 dakika sonra ulaşır. Bu yazdırma penceresi içinde habercisi sorunsuz bir G25 silindirik meme 200 kPa basınç ile kullanarak kalıptan çekilmiş. Verim stres varlığını malzeme katı benzeri davranışını ima ve yapısal bütünlük ekstrüzyon sonra kendi ağırlık³¹dayanacak şekilde yükseltir. Stres rampa verim stres jelleşme, farklı zamanlarda tanır. Sonuçları verim stres artan jelleşme zamanla arttığını gösteriyor. Jelleşme, 50 dk verim stres 325.9 ulaşır bu model temin Pa, ekstrüzyon sonra kararlı.

Yazdırılan pervane modeli Şekil 2agösterilir. Confocal mikroskobu MDA-MB-231-GFP ve IMR-90-mCherry hücreleri (Şekil 2b) ilk ekstrüzyon yerlerinin onaylar. MDA-MB-231-GFP hücreleri artan boyutu ve pulcuklarının sayıda güne kadar 30 (Şekil 2 c - 2f) ardından 15 gün kültür dönemine pulcuklarının gelişmeye başlar. Bazı IMR-90-mCherry hücreleri de aglomerasyonlar (Şekil 2 g - 2j) oluşturur. Fark, kültür 30 gün sonra IMR-90-mCherry hücreleri olası göç olayları modelindeki ima başlangıçta (Şekil 2f), MDA-MB-231-GFP hücreleri tarafından işgal bölgesi gözlenmektedir. Aynı şekilde, geçirilen MDA-MB-231-GFP hücreleri da IMR-90-mCherry hakim olduğu bölgede gün 30 (2j rakam) görülebilir.

Disk modeli Şekil 3aiçinde gösterilir. Confocal mikroskobu (Şekil 3b) disk içinde homojen hücre dağıtım onaylar. Bir pervane model olarak yazdırıldığında yaptıkları gibi MDA-MB-231-GFP hücreleri disk modelinde benzer şekilde davranır. Temsil edici resimler resim 3 c - 3fgörüntülenir. SEM görüntüleme küresel yüklü bir MDA-MB-231-GFP hidrojel Kültür (Şekil 4a) 21 gün sonra ortaya koymaktadır. Üretimi ve varlığı, küresel doğrulanmış boş hücre hydrogels (Şekil 4b) ile SEM görüntüleri karşılaştırarak.

Her iki hücre türü hücre canlılığı Şekil 4 cgösterilmiştir. MDA-MB-231-GFP hücreleri IMR-90-mCherry hücrelere kıyasla daha yüksek bir hücre canlılığı hızlı. İlginçtir, MDA-MB-231-GFP hücreleri gün 0 karşılaştırıldığında hücrelerin sayısını üçe katlandı ile 15 gün önce canlılık artan bir eğilim sergilemektedir. Bu bir düşüş tekrar günde 30 kurtarma önce günde 21, izler. Buna ek olarak, IMR-90-mCherry hücreleri kültür döneminin tamamını sırasında en az canlılığı dalgalanmalar var. Günde 21 MDA-MB-231-GFP hücre canlılığı azalan değerleri nekrotik çekirdek geliştirdi bir büyük MTCSs oluşumu için karşılık gelir.

Şekil 1: hidrojel habercisi Rheological karakterizasyonu. (bir) A sıcaklık süpürme sol-jel geçiş 30,6 ° C'de gösterir. (b-c) A3G7 habercisi jelleşme kinetik bir g gösterir ', G ", ve | η^*| jelleşme zamanının ve sol-jel yaklaşık 17 dk 25 ° C'de geçiş olur (d) Bu panel jelleşme zamanının verim stres habercisi karşı gösterir. Artık bu jelleşme vakit geçirmek verim stres bir artış görülmektedir. Sonuçları Ortalama ± SD, n≥ 3 gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: MCTS formasyonu içerisinde IMR-90-mCherry myofibroblast ve MDA-MB-231-GFP meme kanseri hücrelerinin oluşan bir 3D bioprinted içinde vitro modeli. (bir) bu fotoğrafları (solda) bioprinted vitro örnek ve CAD modeli (sağda) gösterir. (b) Bu temsilcisi confocal hızlandırılmış görüntü MDA-MB-231-GFP (yeşil) gösterir ve IMR-90-mCherry (kırmızı) bioprinted modeli içindeki hücreleri. (c - f) Bu zum-ins göster MDA-MB-231-GFP hücre bölgeleri (beyaz noktalı kutu). (g - j) Bu zoom-ins göster IMR-90-mCherry hücre bölgeleri (Sarı noktalı kutu). Ölçek çubukları paneli 2a, 1 mm panel 2bve paneller 2 c - 2j seçili alanlar için 500 µm 2 mm ve büyütmeyi 10 X. Görüntüleri "D" başkentte "kültür gün" anlamına gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 3: bir 3D MDA-MB-231-GFP-yüklü hidrojel disk içinde MCTS oluşumu. (bir) bu fotoğraf hidrojel disk gösterir. (b) Bu temsilcisi confocal resim kompozit içinde gömülü MDA-MB-231-GFP hücreleri gösterir. (c-f) Bu zum-ins göster (c) 0, (d) 7, (e) 15, MDA-MB-231-GFP hücre bölge (beyaz noktalı kutusunda Masası 3b) ve (f) 21 gün kültür. Ölçek çubukları paneli 3a, 3bpaneli 1 mm ve panelleri 3 c - 3f seçili alanlar için 500 µm 2 mm ve büyütmeyi 10 X. Görüntüleri "D" başkentte "kültür gün" anlamına gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: MTCSs Morfoloji ve hücre canlılığı. (bir) Bu SEM görüntü bir MDA-MB-231-GFP MCTS jel içinde kültür, küçük MCTS (ok sivri uçlu) gösterilen 21 gün sonra gösterir. (b) Bu SEM görüntü bir aljinat/jelatin hidrojel hücreleri gösterir. Büyütme oranını 350 X var. (c) Bu panel kültür hidrojel içinde 30 gün boyunca hücre canlılığı MDA-MB-231-GFP ve IMR-90-mCherry gösterir. Sonuçlar ortalama ± SD analiz edildi ve istatistiksel olarak iki yönlü ANOVA ve bir Bonferroni'nın sonrası testi kullanılarak analiz. p (*) < 0,05, n ≥ 3. Verileri gün 0 örnekleri oluşturmak için kullanılan hücre yoğunluğu için normalleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kirlenme (biyolojik ya da kimyasal) sürecinde herhangi bir noktada oluşursa hücre yüklü yapıları tehlikeye girebilir. Genellikle, biyolojik kirlenme iki sonra görülür veya kültür medya veya bioprinted yapı ile üç gün kültür bir renk olarak değiştirin. Bu nedenle, sterilizasyon (fiziksel ve kimyasal dezenfeksiyon) tüm hücre ile ilgili işlemler için önemli bir adımdır. Önemli, ısıyla jelatin daha yavaş jel biz yürütülen çalışmalarda yapılan jelleşme özelliklerini değiştirir. Bu nedenle, biz yolu ile UV aljinat ve jelatin güç pozlama sterilize. UV ışık çok sınırlı penetrasyon özelliği nedeniyle, çok ince bir tabaka (< 0,5 mm) kullanılmalıdır. Aljinat ve jelatin konsantrasyon, mekanik ve biyolojik özellikleri³²ayarlamak için keyfi olarak değiştirilebilir. Mevcut çalışma, biz A3G7, arzu edilen baskıya sırasında yazdırma penceresi sağlar, ve çapraz hidrojel 30 günlük deneme yoluyla yüksek bir istikrar sağlar seçti. Toz DPBS eriterek jelatin liquefication geliştirmek için yardımcı olurken 60 ° C ile Isıtma, hangi karıştırma kolaylaştırır. Daha düşük sıcaklık de kullanılabilir; Ancak, artık bu heyecan verici bir zaman sonra gerekli olacak.

Rheological sıcaklık süpürme 30,6 ° c, diğer yayınlar³³ile uyumlu olan bir sol-jel noktası verir. Teorik olarak, herhangi bir sıcaklık 30,6 ° C habercisi sıvılaştırmak daha yüksek. Hücre kültür orta bir 37 ° C su banyosunda önceden ısıtılmış ne kadar iş basitleştirmek için 37 ° C seçti. Jelleşme kinetik (önce habercisi jeller) bağlı olarak, hücre karıştırma için yaklaşık 17 dk işte; Bu saatten sonra yüksek viskozite ve dönmeler, homojen olmayan bir hücre yüklü bioink neden nedeniyle hücreleri ve hidrojel habercisi karıştırma zordur. Bu nedenle, biz gelling ilk 10 dakika içinde hücre karıştırma iş işleme öneririz. Verim stres baskıya son zamanlarda³⁴kadar etkiler malzeme bir öznitelik olarak kabul değil; ne olursa olsun, bu kapsamlı Polimer bilim adamları tarafından Mantı/taneli sıvı^31,35,36,37bir işareti olarak kabul edilmiştir. Verim stres varlığını kendi ağırlığı dayanacak şekilde yapısal bütünlüğü kadar oluşturmak için yardımcı olur. Yüksek verimli stres Ayrıca ekstrüzyon bir artan başlangıç basınç gerektirebilir; Böylece, bu aşırı kesme stres³²nedeniyle hücrelere zarar görmesine neden olabilir. Ekstrüzyon işlemi en uygun yazdırma penceresinin dışına oluşursa modeli sadakat tehlikeye girebilir. Bu sorunun yaygın göstergeleri son bioprinted yapısında gösterilir: ya çok sert ya da çok kenarlı sıvı olacak. A3G7 öncül bir en uygun yazdırma penceresi 50-90 gelling, yapısal kararlılık ve hücre survival karşılar ve türdeş olmayan tümör oluşturmak için orta¹⁴modelleri gibi kullanılabilir min sırasında sergiler.

Toplam pervane modeli dört üretileceğini değil gibi 600 µm 150 µm filamentler katmanlı yüksekliğidir. Bu tasarım sağlar besin ve gaz alışverişi hücreleri en az 300 µm medya kuluçka sırasında temas yüzeyinden olduğu gibi. Daha yüksek modeller fabrikasyon ulaşılabilir vardır ama çekirdek bölge düşük hücre hayatta neden olabilir hidrojel³⁸besinlerin sınırlı difüzyon mesafeye göre bottlenecked.

Farklı stratejiler mikrosıvısal çip, montaj ve bioprinting³⁹formu MCTS vitro, asılı damla gibi geliştirilmiştir. Ancak bu metodolojileri bazıları hücre Fizyoloji ve biyokimya, ortaya farklı hücre davranışları normal tümör dokusunda üreten değiştirebilirsiniz. Örneğin, idam yöntemi kuvvetler tek hücreleri hücre toplamları den fiziksel doğumdan⁴⁰olarak kalmak için bırakın. Ayrıca, forma MCTS bir peptid ek tarafından kimyasal indüksiyon pulcuklarının⁴¹Biyokimya değiştirebilirsiniz. Burada açıklanan hidrojel Kompozit dış stres olmadan bir biomimetic ortamı yaratarak bir MCTS oluşumu sağlar. Kültürlerin, hücreleri yeniden Düzenle küçük MCTS olarak 7 gün sonra tek iyi dağınık hücreler olarak yola çıkıp (küresel başına 6'dan fazla hücre), onların boyutu ve miktar kültür 30 gün boyunca artan.

Bu araştırma sonuçlarında, MDA-MB-231-GFP pulcuklarının gün 21, hücre canlılığı azaltmak bu olay büyük pulcuklarının oluşumu ile korele bulduk. Solid tümör sayede dış katman orta tabaka ve küresel¹⁸iç nekrotik veya senescent özünü göre yüksek proliferasyon oranı sunar üç farklı katmandan oluşur. Bu sonuçlar canlılığı azalma açıklayabilir.

Bu sınırlamalar bu Protokolü'nün (1) bioink dinamikleri ve (2) hücre türü uyumluluk vardır. Bioink dynamics basılı yapısı bozuk olan bir en uygun yazdırma penceresinde kaynaklanan jelleşme işlemi sırasında değişen malzeme özelliklerine başvurur. Hücre türü uyumluluğunu belirli hücre tipleri (hücre veya birincil kültür) göremezlik yerli vivo içinde davranışlar gösteren ifade eder.

A3G7 hidrojel yüksek kararlılık ve hücre canlılığı sağlar. 3D bioprinting geleneksel hücre kültürü ve küçük hayvan tümör modelleri için daha gerçekçi bir alternatif olarak yüksek performans, düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik ile 3D türdeş olmayan hastalık modelleri oluşturmak için kullanılabilir.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Tao Jiang Çin burs Konseyi (201403170354) ve McGill Mühendisliği doktora Ödülü (90025) kendi burs finansman için teşekkürler. Jose G. Munguia-Lopez CONACYT (250279, 290936 ve 291168) ve FRQNT (258421) kendi burs finansman için teşekkürler. Salvador Flores-Torres CONACYT (751540) finansman onların burs için teşekkürler. Joseph M. Kinsella Ulusal Bilim ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada Vakfı yenilik, Townshend-Lamarre Aile Vakfı ve McGill Üniversitesi için kendi finansman için teşekkürler. Allen Ehrlicher onun rheometer Dan bize fluorescently etiketli hücre hatları için erişim vermek için onun confocal mikroskop ve Morag Park kullanmak bize izin verdiği Nicolau kullanmak için bize izin verdiği için teşekkür etmek istiyorum.