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要約

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン bioink に埋め込まれた腫瘍、線維芽細胞の不死化細胞で構成される異種乳房癌モデルを開発しました。モデルは、生体内で腫瘍微小環境を繰り返すし、腫瘍形成を駆動メカニズムに洞察力をもたらす多細胞腫瘍スフェロイドの形成を促進します。

要約

ネイティブ腫瘍微小環境の細胞・生化学・生物物理学的不均一性がない成長不死化癌細胞を用いた従来の二次元 (2 D) の細胞培養で締めくくっています。異なったタイプの細胞が埋め込まれているという異種の三次元 (3 D) 腫瘍モデルを構築するバイオプリンティング技術を使用して、これらの課題を克服できます。アルギン酸、ゼラチン、バイオプリンティング生体適合性、バイオミミ クリー、機械的性質などに採用されている最も一般的な生体材料の 2 つです。2 つのポリマーを用いて、ネイティブの腫瘍間質の微細なアーキテクチャに類似し、bioprintable 合成ハイドロゲルを達成しました。レオロジーを介して複合ゲルの印刷適性を検討し、最適な印刷ウィンドウを取得します。乳癌細胞と線維芽細胞が、ヒドロゲルに埋め込まれ、生体内の微小環境を模倣した 3 D モデルを形成する印刷します。Bioprinted 異種モデルの長期細胞培養 (> 30 日) 高い生存率を実現し、促進する、回転楕円体細胞腫瘍 (MCT) に乳がん細胞の自己集合。移行とこのモデルに MCTS 癌関連付けられている線維芽細胞 (CAFs) の相互作用を観察した.共培養システムとして bioprinted 細胞文化のプラットフォームを使用して、それは腫瘍の間質組成依存性を研究するユニークなツールを提供しています。このテクニックを備えて高スループット、低コストと高い再現性と従来の細胞単層培養する代替モデルとがんの生物学を研究する動物腫瘍モデルも提供できます。

概要

2次元細胞培養は、がん研究で広く使用されますが、セルは、栄養素や酸素の濃度が均一膜形式で育つように制限があります。これらの文化は重要な細胞を欠いているし、ネイティブの腫瘍微小環境 (TME) に存在する細胞マトリックスの相互作用。したがって、これらのモデルは悪い生理的に不自然な形態、不規則な受容体組織、膜の分極と他の間で、異常な遺伝子発現を含む異常な細胞の行動の結果を要約します。条件1,2,3,4。その一方で、セルが集計、回転楕円体、または organoids として体積空間で展開されている 3 D 細胞培養基本の細胞生物学および生理学を勉強するより正確な体外環境を作成する方法を提供しています。3 D 細胞培養モデルもネイティブ TMEの in vitro1,4、5の重要な生理学的特性は、細胞外マトリクス相互作用を促すことができます。新興 3 D バイオプリンティング技術は、異機種混在の TME を模倣するモデルを構築する可能性を提供します。

3 D バイオプリンティング ラピッドプロトタイピングから派生でき、生活の複雑さのいくつかを模倣することができる 3 D 微細構造の作製組織サンプル6,7。インク ジェット、押出成形、レーザー印刷8など現在バイオプリンティング法。中でも、押出法は、異なる初期の場所に材料の種類を正確に配置によって印刷された行列内で制御される不均一性をことができます。したがって、複数の種類のセルや行列を含む異種の in vitroモデルを作製する最善のアプローチです。押出バイオプリンティングは耳介の形の足場構築9、血管構造10、11,12, と皮膚の組織13、高い印刷再現性と細胞の結果に正常に使用されています生存率。技術はまた多彩な材料選択、埋め込まれて既知の密度と再現性の高い14,15,16,17 セルと材料を堆積する機能を備えてください。.天然および合成ハイドロゲル、生体親和性、活性、および ECM7,18 のように構造的にするように設計することができます彼らの親水性ネットワークによる 3 D バイオプリンティングの bioinks として多用します。、19,20,21,22,23。ヒドロゲルはセル、構造要素、栄養素、ガス透過性の接着剤のサイトを含めることができますのでを奨励する適切な機械的性質細胞開発24有利ないます。例えば、コラーゲン ゲルはインテグリン細胞を使用してマトリックスをアタッチ アンカレッジ サイトを提供しています。変性コラーゲン、ゼラチンには、同様の細胞接着サイトが保持されます。対照的に、アルギン酸は不活性が、二価イオン25,26,27,28架橋を形成することにより機械的完全性を提供します。

この作品、bioink、アルギン酸とネイティブの腫瘍間質の微細なアーキテクチャに類似し、ゼラチンの構成として合成ハイドロゲルを開発しました。乳癌細胞と線維芽細胞、ヒドロゲルに埋め込まれていたし、生体内の微小環境を模倣する 3 D モデルを作成する押し出しベースの bioprinter経由で印刷します。設計された 3 D 環境では、細胞培養 (> 30 日) 長期間にわたって高い生存率と回転楕円体細胞腫瘍 (MCT) を形成する癌細胞をことができます。このプロトコルは、複合ゲルの合成、材料の微細構造と印刷適性、バイオプリンティング細胞異種モデル、および MCT の形成を観察の方法論を示します。薬剤のスクリーニング、細胞移動分析および基礎的な細胞に焦点を当てる研究への応用可能性と押し出しバイオプリンティング同様異種組織モデルの異なるデザインに関しての他の bioinks にこれらの方法論を適用できます。生理機能。

プロトコル

1. 材料、ヒドロゲル、、細胞培養材料の準備

  1. 材料とソリューションの準備
    1. 洗って、乾燥 250 mL と 100 mL ガラス ビーカー、磁気スターラー、へら、10 mL のカートリッジ、25 G (0.5 の長さ) と 250 μ m の内径円筒ノズル。材料をオートクレーブに入れることによって殺菌しなさいそれらの 121 ° C で 15 分/1 気圧は使用するまで滅菌条件下で材料を維持します。
      注: は、仕入先情報のテーブルの材料を参照してください。
    2. (以下 A3G7 として示される) 3 g アルギン酸 (3 %w/v)、ゼラチン (7 %w/v) の 7 グラムの重量を量る。
    3. 少なくとも 4 h: アルギン酸、ゼラチン パウダー、パラフィン フィルム アルミ箔部分 5 cm2、1 mL と 5 mL 注射器の紫外線の下で次の項目を滅菌します。少なくとも 4 時間の 70% エタノールでそれらを浸すことによってピストンの先端キャップ、エンド キャップを殺菌し、洗って滅菌超純水で 2 倍。
      注: は、仕入先情報のテーブルの材料を参照してください。
    4. 超純粋な水と寒天 4 g を溶解し、オートクレーブで滅菌します。
      注: agarose をオートクレーブ処理後完全に溶解します。
    5. 使用する前に (孔径 0.22 μ m) と無水塩化カルシウム (CaCl2) 滅菌超純水装置及び滅菌フィルターの 100 ミリメートルのソリューションを準備します。
    6. アガロース コーティング 6 ウェル プレート、溶かす液体のソリューションを取得するマイクロ波滅菌アガロースバイオ セーフティ キャビネット (BSC) と 1 mL ピペットを使用して、ウェルあたり 2 mL を追加し、井戸の底で均一な層を作成する優しく混ぜます。冷めるし、パラフィン フィルムでウェルを密閉しておきます。使用するまで室温 (RT) でそれを維持します。
  2. A3G7 ヒドロゲル前駆体の調製
    1. BSC 内 250 mL のビーカーに 3 g アルギン酸とゼラチン粉末 7 g を混ぜます。マグネチックスターラーと DPBS 100 mL 追加します。滅菌パラフィン フィルムとアルミ箔 (5 cm2) 汚染を避けるためにビーカーをシールします。
    2. 600 rpm の 60 ° C で 1 h、2 h 追加 RT 磁気/ホット プレートの定数撹拌下で粉末を溶解します。
    3. 37 ° C で材料を熱ゲル液体状態への相転移を経るまで (在庫ゲル溶液の 100 mL が約 45 分)。滅菌 50 mL コニカル遠沈管にソリューションを転送、それらをシール、素材から任意の気泡を除去するために 5 分間 834 x g でチューブを遠心分離機します。
    4. 10 mL 注射器にヒドロゲル前駆体を吸い出しなさい。シール キャップとパラフィン フィルムと注射器。使用するまで 4 ° C で保存します。
  3. 細胞培養
    注: このセクションの手順は、無菌条件の下で実行する必要があります。
    1. 次のように (1 L) ため基本 DMEM 培地を準備する: BSC でプラス抗生物質/抗真菌ソリューション (安定化ソリューション x 100) の 10 mL の牛胎児血清 (FBS) 100 mL を新鮮な滅菌容器にミックスします。混合気を調整する DMEM 培地を追加 1,000 mL。容器を密封し、4 ° C でそれを維持
    2. 以前温めた水浴 (37 ° C) の解凍 MDA-MB-231-GFP (ヒト乳がん培養細胞株 GFP 標識、核ローカリゼーション) の 1 バイアルと東北-90-mCherry (癌関連付けられている線維芽細胞細胞質局在、mCherry ラベルの 1 バイアル) 優しく水の中にそれらを移動することによって液体窒素貯蔵からの細胞。細胞株と GFP の mCherry ラベル、プラスミドが購入できます。
    3. 6 ウェル プレート 160 μ L/ウェルの細胞液 (3 x 106セル/mL) に転送し、温めた (37 ° C) 基本 DMEM 培地 5 mL を追加します。電池が 80% の合流点に達するまでは、24-48 時間 37 °C/5% CO2でプレートを孵化させなさい。
    4. 媒体を破棄し、リンスの DPBS; で 2 回細胞細胞に達すると合流、トリプシン-EDTA ソリューション/ウェルの 500 μ L でセルを孵化させなさい (0.25%、1 x 以前温め 37 ° C で) 6 分の 37 ° C で。その後、FBS の 500 μ L を追加することによって、トリプシンを不活化、携帯ソリューションを回復し、T-75 ボトルにそれを転送します。インキュベートして再び 37 °C/5% CO2セルまで 80% 合流。
      注: トリプシン EDTA 溶液の量は、細胞増殖血管によって異なります。
    5. セルより多く代謝活性と安定性を持っているときは通路 3-4 セルで動作する前の手順を繰り返します。
    6. ヒドロゲル混合する細胞の初期濃度を決定するためトリパン ブルーの試金 (0.4%) を使用してセルをカウントします。

2. ゲルのレオロジー的性質の測定

  1. 手順 1.2 アルギン酸/ゼラチン ゲル前駆体を準備します。
    注: 滅菌条件は機械試験・解析用に生成されるサンプルの必要はありません。レオロジーのすべてのテストは、3 通で実行されます。
  2. ヒドロゲル前駆体の注射器を取るし、1 h の 37 ° C の水浴中それをウォーム アップ。
  3. レオメータをオンにし、次の手順に従ってシステムを初期化します。
    1. レオメータと聞かせて、レオメーターに接続して 30 分、レオメータの温度コントロール ボックスのスイッチ自体、レオメーターに切り替えてとコンピューターで実行する空気圧縮機に接続されている空気圧縮機をオンにします。
    2. レオメータ ソフトウェアを開き、コントロール パネルの初期化をクリックして、初期化プロセスを完了します。コントロール パネルの [プラットフォーム温度を 37 ° C に設定します。
    3. 測定セット] タブをクリックしサービス機能を開始に移動、ドロップ ダウン メニューで調整ドライバー慣性を選択し、ポップアップ ウィンドウの調整を開始] をクリックします。
    4. 測定工具、レオメータの並列をマウントします。ここで実行されるすべての実験は、プレート間の 1 mm のギャップで 25 mm 径プレートを使用します。
    5. コントロール パネルのゼロギャップの設定] をクリックし、完了する手順を待ちます。、この過程で正常な力に注意を払います。
      注: この手順の後、正常な力は 0 をする必要があります。
    6. 測定セット] タブをクリックしサービス機能を開始に移動、調整上測定システム慣性を選択し、ポップアップ ウィンドウの調整を開始] をクリックします。一度完了したら、測定ツール移動することを許可するようにコントロール パネルの三角形のボタンをクリックします。
  4. 振幅掃引を行います。
    1. クリックを起動し、トップ メニューの挿入をクリックして、ドロップ ダウン メニューから待機を選択します。セットアップ ウィンドウをプルアップし、待機時間を 2 h に設定します。
      注: これは、テストの前に待っているステップを追加します。
    2. [スタート] ボタン、 [挿入] ボタンをもう一度クリックし、ドロップ ダウン メニューからデバイスを選択します。セットアップ ウィンドウをプルダウンし、選択温度、25 ° C に設定値に達するまで待機のボックスをオフにします。
    3. 測定の手順をクリックして、クリックして可変振動ひずみ、セットアップ ウィンドウをプルアップ、ランプ対数にプロファイルを設定し、0.001% と 100% 初期ひずみと最終的なひずみ値を変更それぞれ。0.01 Hz に周波数を設定します。
    4. 温度変数を追加するには、追加をクリックします。温度変数をクリックし、25 ° C に設定プルアップ ウィンドウの電卓を展開、点密度を 10 ポイント/10 年に設定します。
    5. 風呂の水から注射器を取るし、レオメータ プラットフォームに前駆体の約 0.5 mL を押し出します。
    6. クリックして、コントロール パネルのボタンで三角形は下方。トリミング位置を下に移動する測定ツールを待ちます。
    7. ヘラを使用して測定ツールのエッジでエスケープ任意の余分な前駆体をトリム、余計な材料を破棄します。
    8. ピペットの測定ツールのエッジに鉱物油との境界を完全にオイルシールまで待ちます。
    9. コントロール パネルの [続行を] をクリックします。下の画面で[続行] ボタンをクリックしてスタートボタン (緑色の三角) をクリックします。
    10. テストが完了したら、測定ツールをリリースし、[クリックして、上向き三角形ボタン コントロール パネル。測定ツールを削除し、70% エタノールで拭いてください。70% エタノールでプラットフォームをクリーンアップします。
    11. 現在のプロジェクトで測定手順をクリックし、セットアップ ウィンドウを引っ張ります。今、セット、周波数は 100 Hz に. はそのまま他のすべてのパラメーターをしてください。
    12. 2.4.5 - 2.4.10 の手順を繰り返します。
    13. 図をクリックします。G の曲線を確認 '、G"対振動ひずみ。G のたわみポイントを見つける ' の両方の周波数 (0.01 Hz と 100 Hz)。両方のたわみの点の対応する発振系統を見つけます。
    14. 小さい振動歪みを選択し、その後実施したすべての振動テストにこの緊張の 1/10 を使用します。
      注: G の発症「偏向がないフォロー アップ テストで超えることが究極線形弾性ひずみ (ULES) と見なされます。比の 1/10 は、安全上の理由のため工学で用いられます。これは、ひずみが gCとして示される計算されます。
    15. テストを完了すると、テーブルをクリックして、すべてのデータをコピー、テキスト ファイルに貼り付けます。
  5. 温度掃引を行います。
    1. 私のアプリをクリックし、テンプレートを選択温度ランプ、振動せん断: ゲル化。
    2. プロジェクトを名前します。
    3. ワークフローのステップ測定をクリックします。温度変数をクリックして、セットアップ ウィンドウをプルアップし、37 ° C そして 25 ° C、それぞれに最初と最後の温度を設定します。
    4. プルアップ ウィンドウで 0.1%、発振周波数 1 Hz とする振動ひずみを設定します。その後、61 データ ポイント数を設定します。1 ポイント/分をクリックして電卓にデータ収集頻度を設定し、0.2 の ° C のポイント密度を設定/ポイントします。
      注: これは 0.2 ° C/分の割合で変更する温度になります。
    5. レオメータ プラットフォームでサンプルをロードし、次の手順 2.4.5 - 2.4.10 によってテストを実行します。
    6. G を観察図をクリックして '、G"対温度。G クロス オーバー ポイントを見つける '、G"。クロス オーバー ポイントにおける温度を求めます。
      注: これはヒドロゲル前駆体のゾル ・ ゲル転移温度です。
    7. 2.4.15 手順を繰り返します。
  6. 等温時間掃引を行います。
    1. [マイアプリ] をクリックして、[等温時間-温度テストテンプレートをクリックします。ワークフローでは、ステップ測定をクリックして、変数振動歪みをクリックして、振動歪みを 0.1% に設定し、発振周波数を 1 Hz に設定セットアップ ウィンドウをプルアップします。プルアップ ウィンドウでデータ ポイントの数を 120 に設定します。1 ポイント/分データ コレクションの頻度を設定します。
      注: このひずみの値は振幅掃引の結果に基づいています。
    2. 温度変数を追加する追加ボタンをクリックします。可変温度中央のウィンドウでをクリックし、25 ° C に設定
      1. ワークフローのステップ測定ポイントに移動するデバイスを右クリックして、削除をクリックします。デバイス設定値ステップをクリックして、値に達するまで待機ボックスをオフ、25 ° C に値を設定画像、タイトル画面の下部にあるボタンをクリックして、オフにして続行。ステップを開始名、プロジェクトをクリックし、それを保存します。
    3. レオメータ プラットフォーム上にサンプルをロードし、次の手順 2.4.5 - 2.4.10 テストを開始します。
    4. 観察、G'、G"対時間。G クロス オーバー ポイントを見つける '、G"。クロス オーバー ポイントの時間を見つけます。テストを完了すると、テーブルをクリックして、すべてのデータをコピー、テキスト ファイルに貼り付けます。
      注: これは 25 ° C でヒドロゲル前駆体のゾル ・ ゲル転移時間です。
  7. 様々 なゲル化時降伏強度を測定します。
    1. 私のアプリをクリックし、検索テンプレートをクリックして収量と流動応力、ゲルのような。プロジェクトを名前します。ワークフローの開始手順をクリックします。トップ メニューの [挿入] をクリックし、ドロップ ダウン メニューで選択を待ちます。セットアップ ウィンドウをプルアップし、20 分に待機時間を設定します。
      注: これは、テストの前に待っているステップを追加します。
    2. [開始 、挿入をもう一度クリックし、ドロップ ダウン メニューでデバイスを選択します。セットアップ ウィンドウをプルダウンし、選んだ温度、 25 ° C に設定値に達するまで待機ボックスをオフにします。
    3. ワークフローのステップ測定をクリックして、変数せん断応力を選択、セットアップ ウィンドウをプルアップ、最初と最後のせん断応力はそれぞれ 0 と 10,000 Pa に設定。 電卓をクリックし、点密度を 0.2 ポイント/ペンシルバニア州に設定左側の [データ ポイント] タブで、1 ポイント/秒を設定します。
      注: これは 5 Pa ・ s のストレス ランピング加工料金になります。
    4. プルアップ ウィンドウの下部に [イベント コントロール] タブをクリックし、停止条件を設定: せん断率 > 100 の-1測定を停止します。
      注: 測定は材料が得られた場合この自動的に止まります。
    5. レオメータ プラットフォーム上にサンプルをロードし、次の手順 2.4.5 - 2.4.10 テストを開始します。
    6. 図をクリックします。ひずみ-応力曲線を観察します。ひずみとその対応するストレスのたわみ点を見つけます。2.7.2 - 2.7.6 の手順を繰り返しますが、30、40、各複製; 50 分し、待機時間を変更これは降伏強度の異なるゲル化時間になります。
      注: このストレスは、見かけの降伏強度とみなされます。
      注: ソフトウェアのクリック レオメータ モデルやソフトウェアのバージョンによって異なります。読者に提供し、テスト パラメーターの参照をお勧めします間実用的な使用中の特定のレオメータ/ソフトウェアのマニュアルを参照してください。
       

3. 足場設計・細胞含んだハイドロゲル ・ 3 D プリント モデル

  1. 足場の設計
    1. 紙の上には、プロペラのようなモデルを描画します。
      注: プロペラのようなモデルは、次の考慮事項に基づいて設計されている: (、) それはがん細胞が CAFs; に囲まれている生体内でシナリオをシミュレート(b) のストレスを介して円形のジオメトリの使用濃度を最小限に抑えます(c) それは柔軟な既存のジオメトリを変更することがなく、将来モデルにより多くのセクターを追加できます。(d) の栄養拡散しやすく、垂直方向のスケールでフラットです。
    2. プロペラの中心の起点し、内側の円、中間のセクターおよび外側のセクターの最大半径をそれぞれ表すR0 R1 R2シンボルを使用しなさい記号m 、 nを使用して、それぞれ内部アークとセクター領域の内側のスポークの数を表します。
    3. プロペラのようなモデル上の各ノードの座標を計算し、 R0 R1 R2 m、そしてnの象徴的な表現でそれらを書きます。
    4. 起動プログラム スクリプト変数としてR0 R1 R2 m、そしてnを設定し、各キーのノードの象徴的な表現を入力します。
      注: 任意のソフトウェアについては、材料表を参照します。
    5. ノードを接続するパスを手配し、内側の円、中間のセクターおよび外側のセクターのためのカートリッジを割り当てます。層の厚さ 150 μ m、4 層の数を設定します。
    6. プログラム、bioprinter で認識できる G コード形式のテキスト ファイルを出力してみましょう。
    7. R0を設定 = 3.85、 R1 = 6.85、 R2 = 8.65 m = 2, n = 5。スクリプトを実行し、生成された G コード ファイルを取得します。コピーして bioprinter の専用 G コード フォルダーにファイルを貼り付けます。
    8. Bioprinter とその制御ソフトウェアを入れます。プリンターを初期化します。オープン G コード スクリプトだけ作成し、すべての圧力をゼロに設定します。制御ソフトウェアに戻り、 Scaffolder 発電機タブをクリックして、右下隅の [実行] ボタンをクリックします。プリンターの移動パスを確認します。
      注: これは生成された G コードの精度をテストします。材料表、bioprinter に関連する情報を参照してください。
    9. このステップはオプションです。上記の計算機援用設計 (CAD) ソフトウェアを介してパラメーターに基づいた実証 3 D モデルを構築します。
      注: ベンダーのソフトウェア情報材料表を参照します。
  2. 細胞を含んだ A3G7 ヒドロゲル前駆体を作る
    注: このセクションの手順は、無菌条件の下で実行する必要があります。BSC 内 bioprinter を維持します。
    1. Bioprinter を徹底的に 70% エタノールを噴霧して消毒し、紫外線にさらすこと一晩します。
    2. (4 ° C) でヒドロゲル前駆体の注射器を取り出し、1 h の 37 ° C で水のお風呂で温めてください。
    3. CO から (手順 1.3 参照) 細胞と T フラスコ2インキュベーターを取るし、BSC の内部に配置します。培を破棄し、DPBS とセルを 2 回すすいでください。温めたトリプシン-EDTA 溶液 (3.0 mL) を追加し、37 ° C、6 分不活性化 FBS と同じボリュームでトリプシンで細胞をインキュベートします。トリパン ブルーの試金を使用してセルをカウントします。
    4. 風呂の水からヒドロゲル前駆体の注射器を取り出して、それをきれいに 70% エタノールで消毒します。BSC に注射器を置きます。
    5. ヒドロゲル前駆体の約 3 mL を 10 mL の印刷カートリッジに押し出します。1 x 106セル/mL で MDA-MB-231-GFP の細胞の泡の生産を避ける、ゆっくりとピペッティング システムによって前駆体をミックスします。滅菌終了とトップ キャップがカートリッジをカバーし、パラフィン フィルムでシールします。生成される任意の気泡を除去するために 1 分間 834 × g で遠心分離機それ。
    6. 3.2.3 - 東北-90-mCherry 細胞を含んだ前駆体および細胞前駆体の 3.2.5 の手順を繰り返します。
    7. 70% エタノールですべて 3 カートリッジを殺菌し、bioprinter 商工に読み込みます。プリンターの制御ソフトウェアでカートリッジ温度を 25 ° C に設定します。35 分印刷可能な状態に到達するための前駆体を許可するを待ちます。
      注: 今回は、ヒドロゲルに埋め込まれた細胞の生存率には影響しません。
  3. 3 D 印刷モデル
    1. プリンターの制御ソフトウェア、プリンターのコントロール ソフトウェアのツールのヘッドのタブを展開し、左側のグラフィック インターフェイスで 1 カートリッジをクリックしてノズル先端の位置を測定する尺度の短いボタンをクリックします。他の 2 のカートリッジのこの手順を繰り返します。
    2. 明らかポリスチレン製マイクロ プレートを配置、G コード ファイルを開き、すべてのカートリッジの 200 kpa の圧力を変更します。制御ソフトウェアに戻り、 Scaffolder ジェネレーター] タブをクリックして、印刷を開始するポイントを選択、右下隅の [実行] ボタンをクリックします。3 より複製を得るにこの手順を繰り返します。
    3. プロペラ モデルのすべての複製を印刷後 100 mM 1 分のモデルを架橋し、洗い流して CaCl2ソリューションを追加 Ca+ +イオンの過剰を削除する DPBS で 2 倍。
    4. 慎重にへらを使用して agarose コーティング 6 ウェル プレート上にモデルを転送します。各ウェルに 5 mL の DMEM 培地を追加します。37 ° C、5% CO2でインキュベーターの版を孵化させなさい。
      注: モデルが井戸の中に浮かんでいることを確認します。
    5. 新鮮な培地で細胞培養液を交換して 3 日おき、合計で 30 日間培養したもの。

4. 生存率およびハイドロゲル ディスク回転楕円体形成実験。

  1. ハイドロゲル ディスク準備作業
    1. 3.2.1 - 3.2.6 の手順を繰り返します。
      注: 小さな滅菌容器でカートリッジを代用することが可能です。
    2. 卒業 1 mL の滅菌注射器を使用し、(穴は、注射器管の残りの部分と同じ直径を持っている) 注射器で大きな穴を作成するノズルをカットします。70% エタノールで拭いてし、それが乾燥するまで放置します。
      注: は、滅菌 BSC でこれを行います。
    3. ウェル プレート蓋を使用、表面が覆われる; まで 100 mM CaCl2を追加その後、注射器; を入力するセルを含んだハイドロゲルを取る絞首刑を使用して 100 μ L を押し出す方法をドロップします。1 分のハイドロゲルを残して、過度の DPBS でそれをすすいでください。アガロース - コーティング 6 ウェル プレートにハイドロゲル ディスクを転送基底 DMEM の 5 mL を追加し、最大 30 日間の 37 ° C、5% CO2でそれらを孵化させなさい。媒体ごとに 3 日間を更新します。
  2. セルと回転楕円体の生存率
    1. MTS の試金を使用して、セル実行可能性を決定します。DPBS と各ディスクを洗浄し、罰金滅菌ブレードで 4 つの部分にそれをカットします。ディスク全体の部分を収集し、96 ウェル プレートに転送しています。各ウェルに 100 μ L DMEM のプラス MTS 試薬の 20 μ L を追加し、37 ° C 2 時間で混合物を孵化させなさい。
    2. MTS 反応後上澄みを回復し、きれいな 96 ウェル プレートに転送します。490 でサンプルの吸光度を測定 nm。
  3. スフェロイドの形成
    1. 0、7、15、21、および 30 日文化インキュベーターから孵化プロペラまたはディスク モデルを取り出し、きれいな 6 ウェル プレートに転送しています。
    2. 共焦点回転ディスク倒立顕微鏡を使用して、回転楕円体を視覚化して複数の位置および z スタックを使用して画像を取得します。各プロペラ、または 500 μ m ギャップで右し、各水平位置にトップの焦点面に底から z スタックを取得する左からその水平方向の直径に沿ってディスク モデルをイメージします。
      注: は、仕入先情報のテーブルの材料を参照してください。
    3. 回転楕円体の解析に使用される 2D イメージを作成する ImageJ、プログラムによって提供される最大スタック算術ツールを使用してイメージを再構築します。

5. 走査型電子顕微鏡 (SEM)

  1. 手順 1.2 アルギン酸/ゼラチン ゲルを準備します。
    注: 無菌状態は必要ではありません。
    注意: 液体窒素やパラホルムアルデヒド危険、注意して処理する必要があります。
  2. ハイドロゲルの 1 mL を入れ、モルタル、液体窒素を追加、乳棒を用いてそれを挽きます。解凍からハイドロゲルを避けるために液体窒素を追加していきます。1.5 mL 遠心管に粉体を転送、封印し、2 h. 凍結乾燥 24 時間のサンプルのため、-80 ° C で保存します。
  3. 回転楕円体イメージングの DPBS 2 で軽くハイドロゲルを洗う x、4% パラホルムアルデヒド 37 ° C で 30 分間浸漬によってセルを修正し DPBS で洗浄し、液体窒素で凍結します。最後に、24 h のサンプルを凍結乾燥します。
  4. ハイドロゲル/回転楕円体構造と 25.0 に走査型電子顕微鏡 (SEM) と形態分析 kV 未満 70 Pa (減圧) 40 最大 5 倍の倍率で 000 X。

結果

温度掃引は、25 ° C と 37 ° C で A3G7 前駆体の明確な違いを示しています。前駆体は 37 ° C で液体と 1938.1 84.0 ± mPa の粘度が複雑な大きい G で検証され、s x"g '。温度が低下すると、前駆体はトライ ヘリックス形成29,30にゼラチン分子の自発的な物理エンタングルメントによる物理ゲル化を経る。両方 G'、G"を増やすし、ゾル-ゲル転移を示す 30.6 ° C で収束します。係数は 468.5 ± 34.2 に到達減少の温度で、増加し続ける G Pa' と 140.7 ± 9.3 G Pa」25 ° c (図 1 a)。温度掃引の結果に基づいて、我々 は印刷温度 25 ° C を選んだ。ゲル化反応実験試料調製及び処理中に発生する温度変化をシミュレートする (つまり、37 ° C からサンプルを削除する水バス、25 ° C の bioprinter 室に配置すること)。G'、G"と | η * |体温の低下で時間とともに増加し、ゾル-ゲル転移で起こる ~ 25 ° C で 17 分とき G' ≈ G「≈ 64.3 Pa と損失係数に等しい 1 (図 1 bと1 c)。前駆体は硬直し続けて、ゲル化の 50-90 分後印刷ウィンドウに達する。この印刷のウィンドウ内で、200 kPa の圧力で G25 円筒ノズルを使用して前駆体がスムーズに押し出されます。降伏応力の存在は、材料の固体のような動作を意味し、31独自の重量に耐えるように押出成形した構造的な整合性を発生させます。ストレス ランプは、ゲル化の別の回での降伏応力を認識しています。結果は、降伏応力が増加のゲル化時間とともに増加することを示す.ゲル化の 50 分で降伏応力に達する 325.9 押し出し後 Pa、モデル確保は安定しています。

印刷されたプロペラ モデルを図 2に示します。共焦点顕微鏡は、MDA MB 231 GFP の東北大金研 90 mCherry 細胞 (図 2 b) 初期押出の場所を確認します。MDA-MB-231-GFP の細胞は日 30 (図 2 c - 2 階) まで増加のサイズと回転楕円体の数字が続く培養期間に 15 日間回転楕円体の開発を開始します。東北大金研 90 mCherry 細胞のいくつかはまた集積 (図 2 g - 2 j) を形成します。著しく、30 日間培養後、東北 90 mCherry 細胞はモデルに可能な限り移行イベントを意味最初 MDA-MB-231-GFP の細胞 (図 2 f) が占めている領域に観察された.同様に、移行した MDA-MB-231-GFP の細胞を観察するは (図 2 j) 30 日東北-90-mCherry 支配地域でも。

図 3 aにディスク モデルを示します。共焦点顕微鏡は、ディスク (図 3 b) 内で均一な細胞の分布を確認します。MDA-MB-231-GFP の細胞は、プロペラ モデルとして印刷するときと同様ディスク モデルで同様に動作します。代表的な画像は、図 3 c - 3 fに表示されます。SEM イメージング文化 (図 4 a) の 21 日後 MDA-MB-231-GFP 回転楕円体を含んだハイドロゲルを明らかにします。生成、および回転楕円体の存在は、sem による無細胞系ハイドロゲル (図 4 b) とを比較することによって検証されます。

両方の細胞型の細胞生存率は、図 4 cで示されます。MDA-MB-231-GFP 細胞は、IMR 90 mCherry 細胞と比較してより高い細胞生存率を表現します。興味深いことに、MDA-MB-231-GFP の細胞は 0 日目と比較して生菌数の 3 倍、15 日前に生存率の増加傾向を示します。30 日に再度リカバリする前に、21 日の減少が続きます。対照的に、東北-90-mCherry 細胞培養期間中生存率の最小変動があります。21 日目に MDA-MB-231-GFP の細胞の減少値は、壊死のコアを開発した大規模な MTCSs 形成に対応します。

figure-results-2599
図 1: ヒドロゲル前駆体のレオロジー特性の解析。(、) A 温度掃引 30.6 ° C でゾル-ゲル転移を示しています。(b ・ c)A3G7 前駆体のゲル化速度が G の増加を示しています '、G"と | η*|ゾル-ゲル法と、ゲル化時間で移行は、25 ° C で約 17 分(d) このパネルはゲル化時間対前駆体の降伏応力を示しています。長いゲル化時間で降伏応力の増加が観察されます。結果は、平均 ± SD、 n≥ 3 のとおりです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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東北-90-mCherry myofibroblast と MDA-MB-231-GFP 乳癌細胞から成る 3 D bioprinted in vitroモデル内で図 2: MCTS 形成します。(、) これらの写真を示し、(左) サンプルの in vitro bioprinted CAD モデル (右)。(b) この代表的な共焦点タイムラプス映像を示し、MDA-MB-231-GFP (緑)、東北-90-mCherry (レッド) 細胞モデル内で bioprinted。(c ・ f)これらのズーム イン MDA-MB-231-GFP の細胞領域 (白点線のボックス) の表示します。(g ・ j) これらのズーム イン東北 90 mCherry セル領域 (黄色点線のボックス) の表示。スケール バーのパネル2 c - 選択したエリアの2 j 500 μ m、パネル2 b、1 mm パネル2 a2 mm、倍率は 10 倍。大文字の"D"の画像では、「文化の日」を意味します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4099
図 3: 3 D の MDA を MB-231-GFP-含んだハイドロゲル ディスク内で MCT 形成します。(、) この写真を示していますハイドロゲル ディスク。(b) この代表的な共焦点画像は複合体に埋め込まれている MDA-MB-231-GFP の細胞を示しています。(c f)これらのズーム イン表示 0、7、15、(e) (d) (c) MDA-MB-231-GFP セル領域 (パネル3 bで白の点線のボックス) および (f) 文化の 21 日。スケール バー パネル3 a、パネル3 b、1 mm、500 μ m のパネル3 c - 選択したエリアの3 fで 2 mm、倍率は 10 倍。大文字の"D"の画像では、「文化の日」を意味します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 4: MTCSs の形態と細胞生存率。(、) この SEM 画像は、小さな MCTS (矢印指摘) を示す文化の 21 日後ゲル内 MDA-MB-231-GFP MCTS を示します。(b) この SEM 画像は、セルなしアルギン酸/ゼラチンハイドロゲルを示しています。倍率は 350 X です。(c) このパネルは、ハイドロゲル内文化の 30 日間 MDA-MB-231-GFP および東北 90 mCherry の細胞生存率を示しています。結果は平均 ± SD として分析し、双方向の分散分析およびボンフェローニの事後テストを使用して統計学的に分析します。p (*) < 0.05、 n ≥ 3。データは、0 日目にサンプルを作成するために使用細胞密度に正規化されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

細胞を含んだ構造は汚染 (生物的または化学) が、プロセスの任意の時点で発生した場合危険にさらされることができます。通常、2 つの後生物学的汚染を見てか、文化メディアまたは bioprinted 構造の変更に色として文化の 3 日間。したがって、滅菌 (物理的・化学的消毒) は、細胞に関連するすべてのプロセスの重要なステップです。注目すべき、オートクレーブ ゼラチンは、我々 の試験でゲルのより遅いそれを作ったそのゲル化のプロパティを変更します。したがって、我々 は露出を介してUV アルギン酸とゼラチンの電源を滅菌しました。紫外線の非常に限られた浸透機能により非常に薄層 (< 0.5 mm) を使用してください。32の機械的及び生物学的特性を調整するアルギン酸とゼラチンの濃度を任意に変更することができます。現在の仕事では、我々 は、印刷ウィンドウ中に望ましい適性を提供し、架橋ハイドロゲルが 30 日間実験により高い安定性を提供しています A3G7 を選んだ。ゼラチンの性の液化を高めるのに役立ちます DPBS に粉体を溶解しながら 60 ° C に加熱、攪拌が容易になります。低温も使用できます。しかし、もはや感動の時間が必要になります。

流動温度掃引は、30.6 ° c、その他の出版物の33と互換性がゾル-ゲル ポイントを与えます。理論上は、任意の温度での前駆物質を溶かすことが 30.6 ° C よりも高い。細胞培養培地は 37 ° C の水浴中に予め温めておいた、作業を簡素化する 37 ° C を選びました。セルの混合; 約 17 分 (前に前駆体ゲル) ゲル化速度論に基づく、あります。この時間の後細胞とゲル前駆体の混合は粘度上昇係数、非均質な細胞を含んだ bioink を引き起こしているため難しい。したがって、ゲル化の最初の 10 分以内細胞混合処理をお勧めします。降伏応力は最近34; まで印刷適性に影響を与える材料の属性にするとは見なされませんそれにもかかわらず、それ、ペースト/粒状流体31,35,36,37のマーカーとして高分子科学者によって広く認識されています。降伏応力の存在、独自の重量に耐えられるように構造健全性を構築することができます。高降伏応力は押出; 増加起動圧力を要求することもしたがって、これが過剰な剪断応力32による細胞に損傷であります。最適な印刷ウィンドウの外押出プロセスが発生した場合、モデルの忠実度をできなくなります。この問題の一般的な指標は、最終的な bioprinted 構造に示される: それはあまりにもラフまたはエッジでも液体になるか。A3G7 前駆体は、構造の安定性および細胞の存続の両方を満たす、異種腫瘍を構築する媒体モデル14として使えるゲル化の 50-90 分間最適な印刷ウィンドウを展示します。

プロペラ モデルの合計の高さは、600 μ m 4 から生成されるに従い層 150 μ m のフィラメントです。この設計により、栄養素およびガス交換セルがほとんどの孵化の間にメディアに連絡表面から 300 μ m。高いモデルは加工で達成可能であるが、コア領域の低細胞の存続につながるハイドロゲル38に、栄養素の限られた拡散距離でボトルネックになっています。

別の戦略は、マイクロ チップ、アセンブリ、およびバイオプリンティング39フォーム MCTS体外、ハンギング ドロップなどに開発されています。ただし、これらの方法のいくつかは、細胞生理学、生化学、通常腫瘍組織内に発生する別のセルの動作を生成するを変更できます。例えば、ぶら下げドロップ軍単一細胞の物理的な監禁40を介して細胞凝集塊として滞在する方法です。また、ペプチド添加によるフォーム MCTS に化学的誘導は、回転楕円体41の生化学を変更できます。ここで説明したハイドロゲル複合外部ストレスなくバイオミメティック環境を作成することによって MCTS 形成が可能します。文化、小さな MCTS として細胞再編成の 7 日後単一の分散であるセルとして開始 (回転楕円体ごとの以上 6 セル) は、文化の 30 日間のサイズと量を増やすこと。

この研究の結果、わかりました MDA-MB-231-GFP 回転楕円体が細胞を 21 日までに減少この現象を関連づける大きなスフェロイドの形成。固形腫瘍は、外部の層が中間層と18回転楕円体の内部の壊死または老齢のコアに比べて高い増殖率を提示するという、3 つの異なるレイヤーで構成されます。これは結果の生存率の低下を説明する可能性があります。

このプロトコルのこの制限は、(1) bioink ダイナミクスと (2) 携帯型の互換性です。Bioink 動力学はこれを超える印刷の構造に欠陥が最適な印刷ウィンドウにゲル化過程におけるさまざまな材料の特性を指します。携帯型の互換性は、ネイティブ生体内の現象が発生する特定の細胞型 (細胞初代培養) の無能力を指します。

A3G7 ハイドロゲルは、高い安定性と細胞の生存率を実現します。3 D バイオプリンティングは、高スループット、低コスト、高再現性の伝統的な細胞培養および小動物腫瘍モデルにより現実的な代わりとして 3 D 異種疾患モデルの構築に使用できます。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

Tao 江は、彼らの奨学金の資金を中国公費 (201403170354) とマギル大学工学博士賞 (90025) をありがちましょう。G. ムンギア ホセロペス奨学金資金調達のため CONACYT (250279、290936、291168) と FRQNT (258421) のおかげでください。サルバドール フローレス トレス感謝 CONACYT 彼らの奨学金の資金 (751540)。ジョセフ ・ m ・ キンセラは、彼らの資金のイノベーション ・ タウンゼント ラマール家族財団・ マギル大学国立科学と工学の研究議会、カナダの財団を感謝します。彼のレオメータ ダン Nicolau 私たちに蛍光に分類されたセルの行へのアクセスを許可するための彼の共焦点顕微鏡と Morag 公園の使用を許可するために使用を許可するためアレン Ehrlicher に感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium alginateFMC BioPolymerCAS-No: 9005-38-3Protanal LF 10/60 FT
GelatinSigma-AldrichG9391Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X)GibcoLS141901361×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplateCorning N/AStirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubesCorning352098Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
CentrifugeGMIN/ASorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrousSigma-AldrichC1016
MilliQ waterMilliporeN/A
Millipore 0.22 µm filtersMilliporeSLGS033SBMillex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302Anton PaarN/A
Rheometer measuring tool CP25Anton Paar79038Conical plate geometry for rheometer
RheoCompassAnton PaarN/ASoftware controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscopeHitachiN/ASEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pureAcros Organics416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM)Gibco11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilizedSigmaA5955
Fetal bovine serumWisent Bioproducts080-150
Cell culture T-75 flasksSigma-AldrichCLS43064175 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1GeSiMN/A
GeSim softwareGeSiMN/ASoftware controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resistEFD Nordson7012126
End capEFD Nordson7014472
Tip capEFD Nordson7014469
Piston EFD Nordson7012182
Stainless nozzle G25EFD Nordson7018345
Water bathVWRN/A
AgaroseSigma-AldrichA9539Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates Corning3516TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscopeOlympus Life ScienceN/AOlympus IX83
MTS assay kitPromegaG3582CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kitMolecular Probes,ThermoFisher ScientificL3224
Trypsin 0.25/EDTA 1XGibco25200-072
Corning 96-well plateCorning3595Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave TuttnauerHeidolph BrinkmannN/AHeidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blueInvitrogen T102820.4% solution
EthanolCommercial AlcoholsP016EA95Greenfield Speciality Alcohols
CO2 IncubatorPanasonicN/AMCO 19AIC-PA
Lyophilizer SP ScientificN/AVirtis Sentry 2.0
SolidWorksDassault SystemsN/AA CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLABThe MathWorksN/AA programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

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