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* Estes autores contribuíram igualmente
Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.
A heterogeneidade celular, bioquímica e biofísica do microambiente do tumor nativo não é recapitulada por linhas de células de câncer imortalizado crescente usando a cultura convencional bidimensional (2D) celular. Esses desafios podem ser superados por meio de técnicas bioprinting para construir modelos heterogêneos tridimensional (3D) tumor, segundo o qual diferentes tipos de células são incorporados. Alginato e gelatina são dois dos biomateriais mais comuns empregados em bioprinting devido à sua biocompatibilidade, biomimetismo e propriedades mecânicas. Combinando os dois polímeros, atingimos um hidrogel composto bioprintable com semelhanças com a arquitetura microscópica de uma estroma do tumor nativo. Estudamos a qualidade de impressão de hidrogel composto através de reologia e obtidos da janela de impressão ideal. Fibroblastos e células de câncer de mama foram incorporados no hidrogel e impressos para formar um modelo 3D, imitando o microambiente no vivo . O modelo heterogêneo bioprinted alcança uma alta viabilidade para cultura de células a longo prazo (> 30 dias) e promove a auto-montagem de células de câncer de mama em esferoides tumor multicelulares (MCTS). Observamos a migração e a interação das células de câncer-associado do fibroblasto (CAFs) com o MCTS neste modelo. Usando plataformas de cultura de células bioprinted como sistemas de co-cultura, dispõe de uma exclusiva ferramenta para estudar a dependência da tumorigênese sobre a composição do estroma. Esta técnica apresenta uma alta produtividade, baixo custo e alta reprodutibilidade, e também pode fornecer um modelo alternativo para culturas convencionais monocamada e modelos de tumor animal para estudar a biologia do câncer.
Embora a cultura de pilha 2D é amplamente utilizada na pesquisa do câncer, existem limitações como as células são cultivadas em um formato de monocamada com uma concentração uniforme de nutrientes e oxigênio. Essas culturas faltam importante célula-célula e interações célula-matriz presentes no microambiente do tumor nativo (TME). Consequentemente, estes modelos mal recapitular condições fisiológicas, resultando em comportamentos aberrantes de células, incluindo morfologias antinaturais, organização irregular do receptor, polarização de membrana e expressão do gene anormal, entre outros condições1,2,3,4. Por outro lado, a cultura de células 3D, onde as células são expandidas em um espaço volumétrico como agregados, esferoides ou organoids, oferece uma técnica alternativa para criar ambientes em vitro mais precisos para estudar a fisiologia e biologia celular fundamentais. Modelos de cultura de células 3D também podem incentivar interações célula-ECM que são críticas características fisiológicas do nativo TME em vitro1,4,5. A tecnologia emergente de bioprinting 3D fornece possibilidades para construir modelos que imitam o TME heterogêneo.
Bioprinting 3D é derivado de prototipagem rápida e permite a fabricação de microestruturas 3D que são capazes de imitar as complexidades da vida6,7amostras de tecido. Os atuais métodos de bioprinting incluem jato de tinta, extrusão e assistida por laser impressão8. Entre eles, o método de extrusão permite a heterogeneidade ser controlado dentro de matrizes de impressos por precisamente posicionamento distintos tipos de materiais em locais diferentes do iniciais. Portanto, é a melhor abordagem para fabricar modelos heterogêneos em vitro envolvendo vários tipos de células ou matrizes. Bioprinting de extrusão tem sido usada com sucesso para construir andaimes de forma auricular9, estruturas vasculares de11,10,12e tecidos13, resultando em células e alta fidelidade de impressão de pele viabilidade. A tecnologia também possui seleções materiais versátil, a capacidade de depositar materiais com células incorporado com um conhecido de densidade e alta reprodutibilidade14,15,16,17 . Hidrogel natural e sintética é usadas frequentemente como bioinks para bioprinting 3D, devido à sua biocompatibilidade, Bioatividade e suas redes hidrofílicos que podem ser projetados para assemelhar-se estruturalmente o ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hidrogel também é vantajosos, já que podem incluir sites adesivos para células, elementos estruturais, permeabilidade de nutrientes e gases, e as propriedades mecânicas adequadas para incentivar desenvolvimento24da pilha. Por exemplo, o colágeno hidrogel oferece integrina locais de ancoragem que células podem usar para conectar para a matriz. Gelatina, colágeno desnaturado, mantém sites semelhantes de adesão celular. Em contraste, o alginato é bioinert mas fornece integridade mecânica, formando ligações cruzadas com íons divalentes25,26,,27,28.
Neste trabalho, desenvolvemos um hidrogel composto como um bioink, composto de alginato e gelatina, com semelhanças com a arquitetura microscópica de uma estroma do tumor nativo. Fibroblastos e células de câncer de mama foram incorporados o hidrogel e impresso através de uma bioprinter baseada em extrusão para criar um modelo 3D que imita o microambiente no vivo . O ambiente 3D projetado permite que as células cancerosas formar esferoides tumor multicelulares (MCTS) com uma alta viabilidade por longos períodos de cultura celular (> 30 dias). Este protocolo demonstra as metodologias de sintetizar compostos hidrogel, caracterizando a microestrutura dos materiais e qualidade de impressão, bioprinting celular modelos heterogêneos e observar a formação de MCTS. Essas metodologias podem ser aplicadas a outros bioinks em extrusão bioprinting, bem como para diferentes projetos de modelos de tecidos heterogêneos com aplicações potenciais na despistagem de drogas, ensaios de migração celular e estudos que se concentram em célula fundamental funções fisiológicas.
1. preparação dos materiais, hidrogel e materiais de cultura celular
2. medições das propriedades reológicas de hidrogel
3. modelos de impressão 3D, hidrogel célula-carregado e Design do andaime
4. viabilidade e experiências de formação esferoide sobre os discos de hidrogel.
5. microscopia eletrônica (SEM)
A varredura de temperatura mostra uma diferença distinta do precursor A3G7 a 25 ° C e 37 ° C. O precursor é líquido a 37 ° C e tem uma viscosidade complexa de 1938.1 ± 84,0 mPa x s, o que é validado por um G maior "sobre G'. Como a temperatura diminui, o precursor sofre física gelificação devido o emaranhamento física espontânea das moléculas de gelatina em uma formação de tri-hélice29,30. Ambos o G' e a G "aumentar e convergem a 30,6 ° C, indicando uma transição sol-gel. Os módulos continuam a aumentar, com a diminuição da temperatura, atingindo 468.5 ± 34,2 Pa de G' e 140.7 ± 9,3 Pa de G "a 25 ° C (Figura 1a). Baseado nos resultados da varredura da temperatura, a 25 ° C como a temperatura da impressão. O experimento de cinética de gelificação simula a mudança de temperatura que ocorre durante a preparação das amostras e manipulação (ou seja, retirar a amostra a 37 ° C da água banho e colocá-lo na câmara de bioprinter de 25 ° C). G', G ", e | η * | aumentar com o tempo, a temperatura baixou, e a transição sol-gel acontece no ~ 17 min a 25 ° C, quando G' ≈ G "≈ 64,3 Pa e o fator de perda é igual a 1 (Figura 1b e 1C). O precursor continua a endurecer e atinge uma janela de impressão após 50-90 min de gelificação. Dentro desta janela de impressão, o precursor pode ser suavemente extrudado usando um bocal cilíndrico G25 com uma pressão de 200 kPa. A existência de elasticidade implica um comportamento do material sólido e aumenta a integridade estrutural após a extrusão para suportar seu próprio peso31. A rampa de stress reconhece o stress de rendimento em momentos diferentes da gelificação. Os resultados mostram que o stress de rendimento aumenta com o tempo de gelificação crescente. À 50 min de gelificação, o stress de rendimento atinge 325.9 Pa, assegurando que o modelo é estável após a extrusão.
O modelo de impresso da hélice é mostrado na Figura 2a. Microscopia confocal confirma os locais de extrusão inicial de ambos o MDA-MB-231-GFP e as células de IMR-90-mCherry (Figura 2b). As células de MDA-MB-231-GFP começam a desenvolver esferoides 15 dias o período de cultura, seguido pelo aumento de tamanho e números de esferoides até dia 30 (Figura 2C - 2f). Algumas das células IMR-90-mCherry também formam aglomerações (Figura 2 g - 2j). Visivelmente, após 30 dias de cultura, IMR-90-mCherry células são observadas na região inicialmente ocupada pelas células MDA-MB-231-GFP (Figura 2f), implicando a eventos de migração possível no modelo. Da mesma forma, migrados MDA-MB-231-GFP de células também podem ser observadas na região de Gir-90-mCherry dominado no dia 30 (Figura 2j).
O modelo de disco é mostrado na Figura 3a. Microscopia confocal confirma a distribuição homogênea de células dentro do disco (Figura 3b). As células de MDA-MB-231-GFP se comportam da mesma forma no modelo de disco como fizeram quando impresso como um modelo de hélice. Imagens representativas são exibidas na Figura 3C - 3f. Imagem SEM revela um hidrogel de esferoide-carregado do MDA-MB-231-GFP após 21 dias da cultura (figura 4a). A geração e a presença, do spheroid é validado comparando as imagens SEM com hidrogel sem célula (figura 4b).
A viabilidade celular de ambos os tipos de célula é demonstrada na Figura 4C. MDA-MB-231-GFP células expressam uma maior viabilidade celular, em comparação com células IMR-90-mCherry. Curiosamente, as células de MDA-MB-231-GFP apresentam uma tendência aumentada de viabilidade antes do dia 15, com o triplo do número de células viáveis em relação ao dia 0. Isto é seguido por uma diminuição no dia 21, antes de recuperar novamente no dia 30. Em contraste, as células do IMR-90-mCherry têm flutuações mínimas de viabilidade durante a totalidade do período de cultura. Os valores decrescentes na viabilidade das células MDA-MB-231-GFP no dia 21 correspondem a uma grande formação de MTCSs, que desenvolveu núcleos necróticos.
Figura 1: caracterização reológica do precursor hidrogel. (um) A temperatura varredura mostra a transição sol-gel 30,6 ° c. (b-c) A cinética de gelificação do precursor A3G7 mostra um aumento de G', G ", e | η*| no tempo de gelificação, o sol-gel e transição acontece em aproximadamente 17 min a 25 ° C. (d) este painel mostra a elasticidade de precursor versus o tempo de gelificação. Observa-se um aumento da elasticidade com um tempo de mais coagulação. Os resultados são apresentados em média ± DP, n≥ 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Formação de MCTS dentro de um modelo in vitro de bioprinted 3D consistindo de Miofibroblasto IMR-90-mCherry e células de câncer de mama MDA-MB-231-GFP. (um) essas fotografias mostram o bioprinted em vitro amostra (à esquerda) e o modelo do CAD (à direita). (b) esta imagem representativa de lapso de tempo confocal mostra o MDA-MB-231-GFP (verde) e IMR-90-mCherry (vermelho) células bioprinted dentro do modelo. (c - f) Esses zoom-ins mostrar as regiões de célula de MDA-MB-231-GFP (caixas brancas pontilhadas). (g - j) esses zoom-ins mostrar as regiões de célula IMR-90-mCherry (amarelas caixas pontilhadas). As barras de escala são 2 mm no painel 2a, 1 mm no painel 2be 500 µm em painéis 2C - 2j para áreas selecionadas, e a ampliação é de 10 X. "D" maiusculo nas imagens significa "dias da cultura". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: formação MCTS dentro de um disco de hidrogel MDA-MB-231-GFP-carregado 3D. (um) esta fotografia mostra um disco de hidrogel. (b) esta imagem confocal representativa mostra células de MDA-MB-231-GFP incorporado em resina composta. (c-f) Esses zoom-ins mostrar a região da célula MDA-MB-231-GFP (caixa branca pontilhada no painel 3b) a (c) 0, (d) 7, (e) 15 e (f), 21 dias de cultura. As barras de escala são 2 mm no painel 3a, 1 mm no painel 3be 500 µm em painéis 3C - 3f para áreas selecionadas, e a ampliação é de 10 X. "D" maiusculo nas imagens significa "dias da cultura". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: viabilidade de morfologia e célula de MTCSs. (um) SEM esta imagem mostra um MCTS MDA-MB-231-GFP dentro do gel após 21 dias da cultura, mostrando pequeno MCTS (pontas de seta). (b), SEM esta imagem mostra um hidrogel de alginato/gelatina sem células. A ampliação é de 350 X. (c) este painel mostra a viabilidade celular de MDA-MB-231-GFP e IMR-90-mCherry durante 30 dias de cultura dentro do hidrogel. Os resultados foram analisados como a média ± DP e analisaram estatisticamente usando uma ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni um. p (*) < 0.05, n ≥ 3. Os dados foi normalizados para a densidade de células usada para criar as amostras no dia 0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Estruturas celulares-carregado podem ser comprometidas se a contaminação (química ou biológica) ocorre em qualquer ponto no processo. Geralmente, contaminação biológica é vista após dois ou três dias da cultura como uma cor mudar os meios de cultura ou a estrutura de bioprinted. Portanto, a esterilização (desinfecção química e física) é um passo fundamental para todos os processos relacionados à célula. Notável, gelatina de autoclavagem altera suas propriedades de coagulação, que tornou mais lento do gel nos ensaios conduzidos. Portanto, estamos esterilizados o alginato e gelatina poder através de UV exposição. Devido a capacidade muito limitada de penetração de luz UV, uma camada muito fina (< 0.5 mm) deve ser usada. A concentração de alginato e gelatina pode ser arbitrariamente alterada para ajustar as propriedades mecânicas e biológicas de32. No presente trabalho, optamos por A3G7, porque ele fornece printabilidade desejável durante a janela de impressão, e o hidrogel de quitosana proporciona uma estabilidade elevada através da experiência de 30 dias. Aquecimento a 60 ° C enquanto dissolvendo o pó DPBS ajuda a realçar a liquefação da gelatina, que facilita a agitação. Uma temperatura mais baixa também pode ser usada; no entanto, uma vez mais agitação será necessária.
A varredura de temperatura reológicas dá um ponto de sol-gel em 30,6 ° C, que é compatível com outras publicações33. Teoricamente, qualquer temperatura acima de 30,6 ° C pode liquefazer o precursor. Escolhemos a 37 ° C para simplificar o trabalho, como meio de cultura celular é previamente aquecido em banho maria a 37 ° C. Baseia-se a cinética de gelificação (antes os géis de precursor), há aproximadamente 17 min para célula de mistura; Após esse tempo, misturar as células e o precursor de hidrogel é difícil devido ao aumento da viscosidade e modulares, causando uma bioink célula-carregado não homogéneo. Portanto, sugerimos que lidar com o trabalho de célula-mistura dentro o primeiro 10 min de gelificação. O stress de rendimento não é considerado para ser um atributo material que afeta a qualidade de impressão até recentemente34; de qualquer maneira, foi amplamente reconhecido pelos cientistas do polímero como um marcador de fluido pastoso/granulado31,35,36,37. A existência de elasticidade ajuda a construir uma integridade estrutural para suportar seu próprio peso. Um rendimento elevado stress também pode exigir uma pressão aumentada de inicialização na extrusão; assim, isso pode resultar em danos às células devido à excessiva tensão de cisalhamento32. A fidelidade do modelo pode ser comprometida se o processo de extrusão ocorre fora da janela de impressão ideal. Indicadores comuns deste problema são mostradas na estrutura de bioprinted final: isso será muito difícil ou muito líquido nas bordas. O precursor de A3G7 exibe uma janela de impressão ideal durante 50-90 min de coagulação que satisfaça tanto a estabilidade estrutural e a sobrevivência da célula e pode ser usado como o meio para construir tumor heterogêneo modelos14.
A altura total do modelo da hélice é 600 µm como ele é gerado de quatro camadas de 150 µm de filamentos. Esse design permite que nutrientes e gás trocar como as células são, no máximo, 300 µm da superfície de contato com a mídia durante a incubação. Modelos mais são realizáveis em fabricação, mas são um gargalo pela distância limitada difusão dos nutrientes no hidrogel38, que pode resultar em uma sobrevivência da pilha baixa na região do núcleo.
Diferentes estratégias foram desenvolvidas para formulário MCTS em vitro, tais como a gota de enforcamento, microfluidic microplaqueta, assembly e bioprinting39. No entanto, algumas dessas metodologias podem alterar a fisiologia celular e bioquímica, gerando comportamentos diferentes células que ocorrem no tecido normal do tumor. Por exemplo, a suspensão drop método único de forças células para permanecer como agregados de células através de de confinamento físico40. Também, a indução química para formar MCTS por uma adição de peptídeo pode alterar a bioquímica do de esferoides41. O hidrogel composto descrito aqui permite uma formação MCTS, criando um ambiente biomimético sem estressores externos. Começando como únicas pilhas bem dispersas, após 7 dias de culturas, reorganizar as células como MCTS pequenas (mais de 6 células por esferoide), aumentando seu tamanho e quantidade durante 30 dias de cultura.
Os resultados desta pesquisa, descobrimos que esferoides MDA-MB-231-GFP diminuem a viabilidade celular no dia 21, correlacionando este fenômeno com a formação de esferoides grandes. Um tumor sólido é composto de três camadas diferentes, segundo a qual a camada externa apresenta uma taxa de proliferação elevada em comparação com a camada média e o núcleo interno de necrótico ou senescente do esferoide18. Isto poderia explicar a diminuição de viabilidade nos resultados.
Esta limitações do presente protocolo são (1) bioink dinâmica e compatibilidade do tipo de célula (2). Bioink dinâmica refere-se as diferentes propriedades de material durante o processo de gelificação, resultando em uma janela de impressão ideal para além do qual a estrutura impressa está com defeito. Compatibilidade do tipo de célula refere-se a incapacidade de certos tipos de células (linha celular ou cultura primária) exibem um comportamento nativo na vivo .
O hidrogel de A3G7 atinge uma elevada estabilidade e célula viabilidade. Bioprinting 3D pode ser usado para construir modelos 3D doença heterogênea com alta produtividade, baixo custo e alta reprodutibilidade como uma alternativa mais realista para cultura celular tradicional e modelos de tumor de animais pequenos.
Os autores não têm nada para divulgar.
Tao Jiang graças a China Scholarship Council (201403170354) e prêmio de doutorado engenharia de McGill (90025) para o financiamento de bolsas de estudo. Jose G. Munguia-Lopez Obrigado CONACYT (250279, 290936 e 291168) e FRQNT (258421) para o financiamento de bolsas de estudo. Salvador Flores-Torres Obrigado CONACYT para sua bolsa de financiamento (751540). Joseph M. Kinsella graças a ciência nacional e Engineering Research Council, a Fundação Canadense para a inovação, a Fundação da família de Townshend-Lamarre e McGill University para seu financiamento. Gostaríamos de agradecer a Allen Ehrlicher que nos permite usar seu rheometer, Dan Nicolau nos permitir usar seu microscópio confocal e Morag Park para conceder-nos acesso a linhas de célula fluorescente etiquetadas.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
MilliQ water | Millipore | N/A | |
Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
Water bath | VWR | N/A | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
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