셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

기본 종양 microenvironment의, 생화학, 세포 및 생물이 하지 성장 불멸 하 게 암 세포 선을 사용 하 여 기존의 2 차원 (2D) 세포 배양 하 여 지는. 다른 종류의 세포에 의하여 포함 된 다른 유형의 3 차원 (3D) 종양 모델을 만들 bioprinting 기술을 사용 하 여 이러한 문제를 극복할 수 있습니다. Alginate와 젤라틴은 bioprinting 그들의 생체 적합성, biomimicry, 및 기계적 특성 때문에 가장 일반적인 생체 재료의 두. 두 고분자를 결합해 서, 우리는 네이티브 종양 stroma의 미세한 구조 유사성과 bioprintable 복합 하이드로 겔을 달성. 우리는 유동성을 통해 복합 하이드로 겔의 전이성 공부 하 고 얻은 최적의 인쇄 창. 유방암 세포 및 섬유 아 세포는 hydrogels에 포함 되었고 vivo에서 microenvironment를 흉내 낸 3D 모델을 형성 하. Bioprinted 이종 모델 장기 세포 배양 (> 30 일)에 대 한 높은 생존 능력을 달성 하 고 추진 하 고 있는 다세포 종양 spheroids (MCTS)으로 유방암 세포의 자기 조립. 마이그레이션 및 암 관련 fibroblast 세포 (CAFs)의이 모델에는 MCTS 상호 작용 관찰합니다. Bioprinted 셀 문화 플랫폼, 공동 문화 시스템을 사용 하 여 기질 구성 tumorigenesis의 의존도 공부 하는 독특한 도구를 제공 합니다. 이 기술은 높은 처리량, 저렴 한 비용, 및 높은 재현성, 기능 그리고 그것은 또한 기존의 세포 단층 배양을 다른 모델 및 암 생물학 연구를 동물 종양 모델을 제공할 수 있습니다.

2 차원 세포 배양은 암 연구에서 널리 이용 된다, 비록 제한 영양분과 산소의 동일한 농도로 단층 형태로 재배 되 고 세포 존재 합니다. 이러한 문화는 중요 한 셀 부족과 상호 작용 세포-매트릭스 네이티브 종양 microenvironment (TME)에 제시. 따라서, 이러한 모델 제대로 탈 셀 동작, 등 부자연 스러운 형태학, 불규칙 한 수용 체 조직, 막 분극, 다른 비정상적인 유전자 발현의 결과로 생리 조건 정리 조건^1,2,,34. 다른 한편으로, 3 차원 세포 배양, 어디 집계, spheroids, 또는 organoids로 체적 공간에서 세포를 확장 수 더 정확한 생체 외에서 근본적인 세포 생물학과 생리학을 공부 하는 대안 기술을 제공 합니다. 3D 세포 배양 모델 수 또한 네이티브 TME 생체 외에서^1,,45의 중요 한 생리 적 특성은 세포-ECM 상호 작용을 격려 한다. 신흥 3D bioprinting 기술은 이기종 TME를 모방 하는 모델을 만들 가능성을 제공 합니다.

3D bioprinting 신속한 프로토 타입에서 파생 되 고 생활의 복잡 한의 일부를 흉내 낸 수 있는 3 차원 마이크로 구조 제조 조직 샘플^6,7. 현재 bioprinting 방법 등 잉크젯, 압출 성형, 레이저를 이용한 인쇄⁸. 그 중, 압출 메서드는 정확 하 게 다른 초기 위치에서 다른 유형의 자료를 배치 하 여 인쇄 된 매트릭스 내에서 제어 하려면이 수 있습니다. 따라서, 모델 유형이 다른 시험관에 관련 된 여러 종류의 셀 이나 행렬 조작 하 가장 좋은 접근 이다. 압출 bioprinting는 성공적으로 구축 하는 귀의 모양된 건설 기계⁹, 혈관 구조^10,,1112, 및 조직¹³, 높은 인쇄 충실도 셀에 결과 피부 사용 되었습니다. 생존 능력입니다. 기술 또한 다양 한 소재 선택, 알려진된 밀도와 높은 재현성^{14,,1516,17 포함 하는 셀 자료를 예금 하는 능력을 갖추고} . 천연 및 합성 hydrogels 자주 그들의 생체 적합성, bioactivity, 및 그들의 친수성 네트워크 ECM^{7,18 를 구조적으로 설계 될 수 있다 3D bioprinting bioinks로 사용 된다 19,20,21,,2223}. 이후 그들은 셀, 구조 요소, 영양소 및 가스, 침투성 접착 사이트를 포함할 수 있습니다 및 장려 하기 위해 적절 한 기계적 속성 셀 개발²⁴Hydrogels 유리한도 있습니다. 예를 들어, 콜라겐 hydrogels 세포를 연결 하는 데 사용할 수 있는 앵커리지 사이트 integrin를 제공 합니다. 젤라틴, 변성된 콜라겐, 유사한 세포 접착 사이트를 유지합니다. 반면, alginate bioinert 이지만 divalent 이온^25,26,,2728와 crosslinks를 형성 하 여 기계적 무결성을 제공 합니다.

이 작품에서는, 우리는 bioink, alginate과 젤라틴, 네이티브 종양 stroma의 미세한 구조 유사성으로 이루어진 복합 하이드로 겔 개발. 유방암 세포 및 섬유 아 세포는 hydrogels에 포함 했다 그리고 vivo에서 microenvironment을 모방 하는 3D 모델을 만드는 입체 기반 bioprinter 통해 인쇄. 설계 된 3D 환경 세포 배양 (> 30 일)의 오랜 기간 동안 높은 생존 능력으로 다세포 종양 spheroids (MCTS)를 암 세포 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 복합 hydrogels 합성, 재료의 미세 및 전이성, bioprinting 세포 유형이 다른 모델, 특성화 고 MCTS 형성 관찰의 방법론을 보여 줍니다. 이러한 방법론은 약물 검사, 셀 마이그레이션 분석 실험, 및 기본적인 셀에 집중 하는 연구에서 잠재적인 응용 프로그램 뿐만 아니라 다른 유형의 조직 모델의 다른 디자인으로 압출 bioprinting에 다른 bioinks에 적용 될 수 있습니다. 생리 적 기능입니다.

1. 재료, 하이드로 겔, 셀 문화 자료의 준비

1. 소재와 솔루션 준비
   1. 세척 하 고 건조 한 250 mL 및 100 mL 유리 비 커, 자석 교 반기, 주걱, 10 mL 카트리지, 25 G (0.5의 길이)와 250 µ m의 내경 원통 노즐. 압력가 마로 소독 하 여 자료를 소독 그들에서 121 ° C/15 분/1 atm. 사용까지 무 균 조건 하에서 재료를 유지.
      참고: 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   2. (여기서 부터는 A3G7로 표기) 3 세대 alginate (3 %w / v)과 젤라틴 (7 %w / v)의 7 g 무게.
   3. 4 h: alginate와 젤라틴 분말, 파라핀 필름, 알루미늄 호 일 조각 5 cm², 및 1 mL와 5 mL 주사기에 대 한 자외선 아래에서 다음 항목을 소독. 적어도 4 h 70% 에탄올에 그들을 immersing 하 여 끝 모자, 팁 모자, 및 피스톤을 소독 하 고 그들을 씻어 소독된 울트라 순수 물으로 2 배.
      참고: 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   4. 4g 울트라 순수 물 agarose 녹이 고 압력가 마로 소독 하 여 소독.
      참고:는 agarose는 완전히 압력가 마로 소독 과정 후 해산 된다.
   5. 사용 전에 100 m m 솔루션 무수 칼슘 염화 물 (CaCl₂) 멸 균된 초 순수한 물에 살 균 필터의 (0.22 μ m의 기 공 크기)를 준비 합니다.
   6. Agarose 코팅 6-잘 접시, 녹아 액체 솔루션;를 전자 레인지에 살 균 agarose 그런 다음, Biosafety 내각 (BSC) 및 1 mL micropipette를 사용 하 여, 잘 당 2 mL를 추가 하 고 부드럽게 만들려고 유니폼 레이어 우물의 바닥에 그것을 혼합 키를 누릅니다. 진정 하 고 인감 파라핀 영화와 잘 둬. 실 온 (RT)에서 사용 될 때까지 계속.
2. A3G7 히드로 전조의 준비
   1. BSC 내에서 250 mL 비 커에 3 세대 alginate와 젤라틴 파우더 7 g을 혼합. 자력 및 DPBS의 100 mL를 추가 합니다. 살 균 파라핀 필름 및 알루미늄 호 일 (5 c m²) 오염 방지와 비 커를 봉인.
   2. 1 시간 60 ° C에서와 RT는 추가 2 h 600 rpm으로 자석/핫 플레이트에 지속적인 동요에서 분말을 디졸브.
   3. 젤은 액체 상태로 상전이 겪 습 때까지 37 ° C에 있는 자료를 열 (재고 젤 솔루션의 100 mL에 대 한이 약 45 분 소요). 살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 솔루션을 전송 하 고, 그들을 봉인 834 x g 자료에서 어떤 가스 거품을 제거 하 5 분에 튜브 원심.
   4. 10 mL 주사기로 히드로 전조를 발음. 모자와 파라핀 영화 주사기 인감입니다. 4 ° C에서 사용까지 그들을 저장 합니다.
3. 세포 배양
   참고:이 섹션의 단계는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
   1. 대비 기저 DMEM 매체 다음과 같습니다 (1 L): BSC, 혼합 소 태아 혈 청 (FBS)의 100 mL의 항생제/antimycotic 솔루션 (안정화 솔루션 x 100) 10 mL 플러스 신선한 멸 균 용기에. DMEM 매체 혼합물을 조정에 추가 최대 1000 mL. 컨테이너를 봉인 하 고 4 ° c.에 그것을 유지합니다
   2. 이전 따뜻하게 물 탕 (37 ° C)에서 서 리 없애다 MDA-MB-231-GFP (인간 유 방 암 세포 선 GFP 표시, 핵 지역화)의 1 유리병 및 IMR-90-mCherry (암 관련 된 섬유 셀 라인 mCherry-분류, 세포질 지 방화의 1 유리병 )는 물에 부드럽게 이동 하 여 액체 질소 저장에서 셀. 셀 라인, 그리고 GFP와 mCherry 라벨, 플라스 미드를 상업적으로 사용할 수 있습니다.
   3. 6 잘 플레이트에 셀 솔루션 (3 x 10⁶ 셀/mL)의 160 µ L/잘 전송 하 고 따뜻하게 (37 ° C) 기저 DMEM 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 80% 합류를 도달할 때까지 24-48 h에 대 한 37 °C/5% CO₂ 접시를 품 어.
   4. 셀 도착 합류, 매체를 삭제 하 고 DPBS; 두 번 셀 린스 500 µ L의 트립 신-EDTA 솔루션/셀을 품 어 (0.25%, 1 x 이전 예 열 37 ° C에서) 6 분 동안 37 ° C에서. 다음, FBS의 500 µ L을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 하 고 셀 솔루션 복구 T-75 플라스 크를 전송. 품 어 그들 다시 37 °C/5% CO₂ 셀 80% 합류를 도달할 때까지.
      참고: 트립 신-EDTA 솔루션의 볼륨 세포 성장 선박에 따라 달라질 수 있습니다.
   5. 그 때 세포가 더 많은 신진 대사 활동 및 안정성에 3-4 세포와 함께 작동 하도록 이전 단계를 반복 합니다.
   6. 히드로와 혼합 되는 셀의 초기 농도 결정 하는 trypan 블루 분석 결과 (0.4%)를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.

2입니다. Hydrogels의 유 변 학적 특성의 측정

1. 1.2 단계에서 설명한 대로 alginate/젤라틴 히드로 전조를 준비 합니다.
   참고: 살 균 조건 기계 테스트 및 분석을 위한 생성 된 샘플에 대 한 필요 하지 않습니다. 모든 유 변 학적 테스트 3 중에 수행 됩니다.
2. 히드로 전조의 주사기를가지고 고 1 시간에 대 한 37 ° C 물 목욕에서 따뜻하게.
3. 고분자를 켜고 다음 단계에 따라 시스템을 초기화.
   1. 제가 30 분, 고분자에 대 한 온도 제어 상자에 스위치 자체, 고분자에 전환 하 고 컴퓨터에 스위치를 실행 하는 공기 압축기는 고분자에 연결 하자에 연결 하는 공기 압축기를 켭니다.
   2. 제가 소프트웨어, 컨트롤 패널에서 초기화 를 클릭 열고 초기화 프로세스를 완료 합니다. 컨트롤 패널에서 37 ° C를 플랫폼 온도 설정 합니다.
   3. 측정 설정 탭을 클릭 하 고 서비스 기능을 시작으로 이동, 조정 드라이버 관성 드롭-다운 메뉴에서 선택한 팝업 창에서 조정 시작 을 클릭 합니다.
   4. 측정 도구는 고분자에 병렬을 탑재 합니다. 여기에 수행 하는 모든 실험 접시 사이 1mm 간격으로 25 m m 직경 접시를 사용 합니다.
   5. 컨트롤 패널에 0-간격 설정 를 클릭 하 고 완료 하는 절차에 대 한 대기. 이 과정에서 정상적인 힘에 주목.
      참고:이 절차 후 정상적인 힘은 0 이어야 합니다.
   6. 측정 설정 탭을 클릭 하 고 서비스 기능을 시작으로 이동, 조정 위 측정 시스템 관성을 선택한 팝업 창에서 조정 시작 을 클릭 합니다. 완료 되 면, 위로 이동 하려면 측정 도구를 허용 하려면 제어판에 있는 삼각형 버튼을 클릭 합니다.
4. 진폭 청소를 실시 합니다.
   1. 시작을 클릭 한 다음 선택 기다릴 드롭-다운 메뉴에서 상단 메뉴에서 삽입 을 클릭 합니다. 설정 윈도우를 당겨 하 고 대기 시간 2 시간을 설정.
      참고:이 테스트 하기 전에 대기 단계를 추가 합니다.
   2. 시작, 다시, 삽입 단추를 클릭 하 고 드롭-다운 메뉴에서 장치를 선택. 설치 창 위로 당깁니다, 그리고 온도를 선택한 25 ° c.로 값에 도달할 때까지 기다립니다의 상자를 선택 취소 합니다.
   3. 클릭 측정단계, 다음 변수 진동 스트레인, 설정 윈도우를 올려, 램프 로그수를 프로필 을 설정 하 고 클릭 초기 변형 및 최종 변형으로 0.001% 및 100% 값을 변경 각각. 0.01 Hz에서 주파수를 설정 합니다.
   4. 온도 변수를 추가 하려면 추가 단추를 클릭 합니다. 가변 온도 클릭 하 고 25 ° c.로 풀업 창에서 계산기를 확장 하, 10 포인트/decade로 포인트 밀도 설정 합니다.
   5. 물 목욕에서 주사기를가지고 고 약 0.5 mL 고분자 플랫폼에 전조의 돌출.
   6. 클릭은 아래쪽 삼각형 컨트롤 패널에서 단추. 조정 위치를 아래로 이동 하려면 측정 도구를 기다립니다.
   7. 주걱을 사용 하 여 측정 도구의 가장자리에서 탈출 모든 초과 전 트림 하 고 불필요 한 자료를 삭제.
   8. 미네랄 오일 측정 도구의 가장자리에 플라스틱 하 고 기름을 완전히 물개 경계 될 때까지 기다립니다.
   9. 컨트롤 패널에서 계속 을 클릭 합니다. 그런 다음 아래 화면에서 계속 단추를 클릭 하 여 다음 시작 버튼 (녹색 삼각형)를 클릭 합니다.
   10. 테스트가 완료 되 면, 측정 도구를 놓고 클릭은 위쪽 삼각형 컨트롤 패널에서 단추. 측정 도구를 제거 하 고 70% 에탄올으로 청소. 70% 에탄올과 플랫폼을 청소.
   11. 현재 프로젝트에서 측정 단계를 클릭 하 고 설정 윈도우를 올려. 자, 설정 주파수 100 Hz.에 다른 모든 매개 변수를 변경 하지 않고 유지.
   12. 2.4.10 2.4.5-단계를 반복 합니다.
   13. 다이어그램을 클릭 합니다. G의 곡선을 관찰 ', G " 대 발진 스트레인. G의 편향 포인트를 찾아 ' 두 주파수 (0.01 Hz, 100 Hz). 모두 편향 포인트에 대 한 해당 발진 종자를 찾아.
   14. 작은 진동 스트레인을 선택 하 고 나중에 실시 하는 모든 진동 테스트에 대 한이 긴장의 1/10을 사용 하 여.
       참고: G의 발병 ' 편향 궁극적인 선형 탄성 변형 (ULES) 하지 후속 테스트에서 초과 해야 하는 것으로 간주 됩니다. 비율 1/10으로 안전 상의 이유로 공학에 사용 됩니다. 이 계산 스트레인 g_C로 표시 됩니다.
   15. 테스트가 완료 되 면, 테이블을 클릭 하 고 모든 데이터를 복사 한 텍스트 파일에 붙여 넣습니다.
5. 온도 청소를 실시 합니다.
   1. 내 애플 리 케이 션 을 클릭 하 고 템플릿을 선택 온도 램프, 진동 전단: 겔 화.
   2. 프로젝트 이름입니다.
   3. 워크플로의 단계 측정 을 클릭 합니다. 변수 온도, 올려 설치 창 고 초기와 최종 온도 37 ° C와 25 ° C, 각각 수를 설정.
   4. 풀업 창에서 0.1%, 1 Hz를 발진 주파수에 진동 긴장을 설정 합니다. 61 되도록 데이터 포인트의 수를 설정 합니다. 1 포인트/분 클릭 계산기 를 데이터 컬렉션 빈도 설정 하 고 설정 가리킨 밀도 0.2 ° C/포인트.
      참고:이 0.2 ° C/min의 속도로 변경 하려면 온도 허용할 것 이다.
   5. 제가 플랫폼에 샘플을 로드 하 고 다음 단계 2.4.5-2.4.10 여 테스트를 수행.
   6. G 관찰 다이어그램을 클릭 ', G " 대 온도. G의 크로스 오버 포인트를 찾아 '와 G ". 크로스 오버 포인트에서 온도 찾아.
      참고: 이것은 히드로 전조의 솔/젤 전이 온도 이다.
   7. 2.4.15 단계를 반복 합니다.
6. 등온선 시간 청소를 실시 합니다.
   1. 내 애플 리 케이 션 및 찾을 고 등온 시간-온도 테스트하는 서식 파일을 클릭 합니다. 고 진동 변형변수를 클릭, 0.1%, 발진 스트레인을 설정 하 고 1 Hz로 진동 주파수를 설정 설치 창 올려 워크플로에서 단계 측정 을 클릭 합니다. 풀업 창에서 120 데이터 포인트의 수를 설정 합니다. 1 포인트/분 데이터 컬렉션 빈도 설정 합니다.
      참고:이 긴장의 값은 진폭 청소 결과에 기반.
   2. 온도 변수를 추가 하려면 추가 단추를 클릭 합니다. 가변 온도 중간 창에서를 클릭 하 고 25 ° c.에 설정
      1. 워크플로의 포인트 측정 장치 이동 단계를 클릭 마우스 오른쪽, 삭제를 클릭 합니다. 장치 값을 설정하는 단계, 값에 도달할 때까지 기다립니다, 확인란의 선택을 취소 하 고 25 ° c 값을 설정 계속취소, 사진, 잡담, 하단 화면에 버튼 을 클릭 합니다. 다음 단계 시작, 프로젝트 이름을 클릭 하 고 저장.
   3. 제가 플랫폼에 샘플을 로드 하 고 다음 단계로 2.4.5-2.4.10 테스트를 시작 합니다.
   4. G을 관찰 ', G " 대 시간. G의 크로스 오버 포인트를 찾아 '와 G ". 크로스 오버 포인트에서 시간을 찾아. 테스트가 완료 되 면, 테이블을 클릭 하 고 모든 데이터를 복사 한 텍스트 파일에 붙여 넣습니다.
      참고: 이것은 25 ° c.에 히드로 전조의 솔/젤 전환 시간
7. 다양 한 고 시간에 항복 강도 측정 합니다.
   1. 내 애플 리 케이 션 을 클릭 하 고 찾기 서식 파일을 클릭 수율 및 흐름 스트레스, 젤 같은. 프로젝트 이름입니다. 워크플로의 시작 단계를 클릭 합니다. 상단 메뉴에서 삽입 을 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 대기하는 것을 선택. 설정 윈도우를 당겨 하 고 대기 시간 20 분을 설정 합니다.
      참고:이 테스트 하기 전에 대기 단계를 추가 합니다.
   2. 클릭 시작, 다음 삽입 다시 클릭 하 고, 드롭 다운 메뉴에서 장치를 선택 합니다. 설치 창 올려 온도 선택 하 고 25 ° c.에 설정 값에 도달할 때까지 기다려야하는 상자를 선택 취소 합니다.
   3. 워크플로의 단계 측정 , 변수 전단 응력을 선택 하 고 설정 윈도우를 올려 한 준비가 초기 및 최종 전단 응력 0 및 10000 Pa, 각각.  계산기를 클릭 합니다, 그리고 설정 포인트 밀도 0.2 포인트/실바 왼쪽에 있는 데이터 요소 탭에서 1 포인트/초 설정 합니다.
      참고: 5 Pa/s의 스트레스 램프 속도에 따라서 됩니다.
   4. 풀업 창의 맨 아래에 있는 이벤트 제어 탭을 클릭 하 고 중지 기준 설정: 전단 > 100의^-1을 평가 하는 경우는 측정을 중지.
      자료 열매를 산출 하는 경우 참고:이 자동으로 측정을 중지 합니다.
   5. 제가 플랫폼에 샘플을 로드 하 고 다음 단계로 2.4.5-2.4.10 테스트를 시작 합니다.
   6. 다이어그램을 클릭 합니다. 긴장 스트레스 곡선을 관찰 합니다. 긴장과 해당 스트레스의 편향 포인트를 찾아. 반복 단계 2.7.2-2.7.6, 하지만 30, 40, 및 각 복제;에 대 일 분 대기 시간을 변경 이 항복 강도 고 다른 시간에 발생 합니다.
      참고:이 스트레스는 명백한 항복 강도로 간주 됩니다.
      참고: 소프트웨어 클릭 제가 모델 및 소프트웨어 버전에서 달라질 수 있습니다. 우리가 제공 하는 테스트 매개 변수 참조를 독자 것이 좋습니다 동안 실제 사용에서 특정 고분자/소프트웨어의 설명서를 참조 하십시오.
       

3. 발판 디자인, 셀-라덴 하이드로 겔 및 3D 인쇄 모델

1. 비 계 디자인
   1. 종이에 프로 펠 러 같은 모델을 그립니다.
      참고: 프로 펠 러 같은 모델은 다음과 같은 고려 사항에 따라 설계: (a) 암 세포 CAFs;에 의해 포위 된다 vivo에서 시나리오 시뮬레이션 (b) 그것은 스트레스를 통해 원형 형상;의 사용의 농도 최소화 (c) 그것은 더 많은 분야는 기존 형상;를 변경 하지 않고 나중에 모델에 추가 될 수 있도록 유연한 그리고 (d)에 평평 하 게 영양 보급을 촉진 하기 위하여 그것의 수직 규모.
   2. 기원 고 기호 R₀와 R₁, R₂ 를 사용 하 여 내부 원, 중간 분야, 및 외부 분야의 최대 반지름을 각각 대표 하는 프로 펠 러의 센터를 보자. 기호 m 과 n 사용 하 여 내부 호 및 분야 지역 안에 쐐기의 수를 각각 나타냅니다.
   3. 프로 펠 러 같은 모델에 각 노드의 좌표를 계산 하 고 R₀, R₁, R₂, m, n의 상징적인 표현에 그들을 쓰기.
   4. 프로그램 스크립트 시작 변수, R₀, R₁, R₂, m및 n 을 설정 하 고 각 키 노드의 상징적인 표현 입력.
      참고: 어떤 소프트웨어 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   5. 노드를 연결 하는 경로 준비 하 고 측근, 중간 분야 및 외부 분야에 대 한 카트리지를 할당 합니다. 레이어 두께 150 µ m와 레이어 4를의 수를 설정 합니다.
   6. G-코드 형식에 bioprinter에서 인식할 수 있는 텍스트 파일을 출력 하는 프로그램을 보자.
   7. R₀ 를 설정 = 3.85, R₁ 6.85, R₂ = 8.65, m = 2, n = = 5. 스크립트를 실행 하 고 생성 된 G 코드 파일을 검색 합니다. 복사 하 고 bioprinter의 전용된 G-코드 폴더에 파일을 붙여 넣습니다.
   8. bioprinter 및 제어 소프트웨어를 켭니다. 프린터를 초기화 합니다. 그냥 만들고 0으로 설정 하는 모든 압력 G-코드 스크립트를 엽니다. 제어 소프트웨어 돌아갑니다 Scaffolder 생성기, 탭 누르고 오른쪽 하단 코너에 있는 실행 단추를 클릭 합니다. 프린터의 이동 경로 관찰 합니다.
      참고:이 테스트는 생성 된 G-코드의 정밀도. bioprinter와 관련 된 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   9. 이 단계는 선택 사항입니다. 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 통해 위의 매개 변수를 기반으로 실증 3D 모델을 빌드하십시오.
      참고: 공급 업체 소프트웨어 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
2. 게 셀-라덴 A3G7 히드로 전조
   참고:이 섹션의 단계는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다. BSC 내부 bioprinter를 유지.
   1. bioprinter 70% 에탄올을 철저 하 게 살포 하 여 소독 하 고 하룻밤 자외선에 노출.
   2. (4 ° C)에서 히드로 전조의 주사기를 꺼내와 1 시간 동안 37 ° C에서 물 욕조에 따뜻한.
   3. CO에서 (단계 1.3 참조) 하는 세포로 T-플라스 크₂ 인큐베이터 고 BSC 안으로 배치. 문화 매체를 삭제 하 고 DPBS 셀을 두 번 씻어. 따뜻하게 트립 신-EDTA 솔루션 (3.0 mL)을 추가 하 고 6 분 비활성화 FBS의 동일한 양으로 트립 신에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어. Trypan 블루 분석 결과 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
   4. 물 탕에서 히드로 전조의 주사기를가지고, 그것은, 깨끗 하 고 70% 에탄올으로 소독. BSC에 주사기를 넣어.
   5. 인쇄 카트리지를 10 mL에 히드로 전조의 약 3 mL를 압출 성형. 천천히 pipetting, 거품의 생산을 피하 여 1 x 10⁶ 셀/mL에서 MDA-MB-231-GFP 세포 선구자 믹스. 살 균 끝 및 최고 모자 카트리지 커버와 파라핀 영화와 함께 인감. 생산 하는 모든 가스 거품을 제거 하기 위해 1 분 834 x g에서 원심.
   6. 단계 3.2.3-3.2.5 IMR-90-mCherry 셀-라덴 전조 하 고 셀 무료 전조에 대 한 반복 합니다.
   7. 모든 3 카트리지 70% 에탄올으로 소독 하 고는 bioprinter의 약 실에 그들을 로드. 프린터의 제어 소프트웨어에서 카트리지 온도 25 ° c.를 설정 인쇄 조건에 도달 하는 전조를 있도록 35 분을 기다립니다.
      참고:이 이번은 히드로에 포함 된 셀의 영향을 주지 않습니다.
3. 3D 인쇄 모델
   1. 프린터의 제어 소프트웨어, 프린터의 제어 소프트웨어 도구 머리 탭을 확장 하 한 1 카트리지, 왼쪽에 그래픽 인터페이스에서 클릭 다음 노즐 팁의 위치를 측정 하기 위해 짧은 측정 버튼을 클릭 합니다. 다른 2 카트리지를 위해 이것을 반복 합니다.
   2. 분명 폴리스 티 렌 미 판 배치 G 코드 파일을 열고 모든 카트리지 200 kPa에 압력을 변경. 제어 소프트웨어 돌아갑니다 Scaffolder 발전기탭을 클릭 합니다, 그리고 인쇄, 시작을 선택한 다음 오른쪽 하단 코너에 있는 실행 단추를 클릭 합니다. 3 더 많은 복제를 얻으려면이 단계를 반복 합니다.
   3. 프로 펠 러 모델의 모든 복제 인쇄 후 추가 1 분에 대 한 모델을 상호 링크 하 여 그것을 씻어 CaCl₂ 솔루션 100 m m +⁺ Ca 이온의 과잉을 제거 하는 DPBS 2 x.
   4. 조심 스럽게 주걱을 사용 하 여 하는 agarose 코팅 6 잘 플레이트에 모델 전송. 각 잘을 DMEM 미디어의 5 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO₂인큐베이터에 접시를 품 어.
      참고: 모델은 우물에 떠 있는 다는 것을 확인 하십시오.
   5. 3 일 마다 신선한 매체와 세포 배양 매체를 대체, 총에서 30 일 동안 그것을 문화.

4. 생존 그리고 히드로 디스크에 회전 타원 체 형성 실험.

1. 하이드로 겔 디스크 준비
   1. 3.2.6 3.2.1-단계를 반복 합니다.
      참고: 작은 살 균 컨테이너와 카트리지를 대체 가능 하다.
   2. 살 균 졸업된 1 mL 주사기를 사용 하 고 노즐 (구멍은 주사기 튜브의 나머지로 동일한 직경) 주사기에 큰 구멍을 만들고에 잘라. 70% 에탄올으로 깨끗 하 고 건조까지 그것을 두고.
      참고: 살 균 BSC에 이렇게 합니다.
   3. 잘 접시 뚜껑을 사용 하 여, 표면 덮여 있다; 때까지 100mm CaCl₂ 추가 그런 다음 주사기; 채울 셀 라덴 히드로 걸릴 교수형을 사용 하 여 100 µ L를 돌출 방법을 드롭. 1 분 동안 하이드로 겔을 두고 과도 한 DPBS로 그것을 씻어. Agarose-코팅 6 잘 플레이트에 히드로 디스크 전송 기저 DMEM의 5 mL을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO₂ 에서 최대 30 일 동안 그들을 품 어. 3 일 마다 매체를 새로 고칩니다.
2. 셀 및 회전 타원 체 생존
   1. MTS 분석 결과 사용 하 여 세포 생존 능력을 결정 하. 각 디스크 DPBS 세척 하 고 잘 메 마른 잎을 가진 4 개 부품으로 그것을 잘라. 전체 디스크의 부분을 수집 하 고 96 잘 접시에 그들을 전송. 그리고, 각 잘 DMEM의 100 μ 플러스 20 μ MTS 시 약의 추가 2 h 37 ° C에서 혼합물을 품 어.
   2. MTS 반응 후에 상쾌한 복구 하 고 깨끗 한 96 잘 접시에 그것을 전송. 490에서 샘플의 흡 광도 측정 nm.
3. 회전 타원 체 형성
   1. 0, 7, 15, 21, 그리고 30 일 문화의 인큐베이터에서 incubated 프로 펠 러 또는 디스크 모델을 꺼내와 깨끗 한 6 잘 플레이트에 그들을 전송.
   2. Confocal 회전 디스크 거꾸로 현미경을 사용 하 여 시각화 하는 spheroids 고 여러 위치 및 z-스택을 사용 하 여 이미지. 각 프로 펠 러, 또는 그것의 수평 직경 500 µ m 간격으로 마우스 오른쪽 z-스택 아래에서 각 수평 위치에 최고의 초점 평면에 취득을 왼쪽에서 따라 디스크 모델 이미지.
      참고: 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   3. 회전 타원 체 분석에 사용 되는 2D 이미지를 만드는 프로그램 ImageJ, 제공 최대 스택 산술 도구를 사용 하 여 이미지를 재구성 합니다.

5. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)

1. 1.2 단계에서 설명한 대로 alginate/젤라틴 하이드로 겔을 준비 합니다.
   참고: 살 균 조건 필요 하지 않습니다.
   주의: 액체 질소 paraformaldehyde 위험 하 고 신중 하 게 처리 되어야 합니다.
2. 박격포로 하이드로 겔의 1 mL를 넣어 액체 질소를 추가 하 고는 방 앗 공이 사용 하 여 그것을 갈기. 계속 녹 이기에서 하이드로 겔을 피하기 위해 액체 질소를 추가 합니다. 분말 1.5 mL 원심 분리기 관으로 전송 하 고, 인감 2 h. Freeze-dry 24 h에 대 한 샘플에 대 한-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
3. 회전 타원 체 이미징, 세척 DPBS 2와 부드럽게 히드로 x, 37 ° C에서 30 분 동안 4 %paraformaldehyde 침수에 의해 셀 수정 DPBS로 그들을 씻어 하 고 액체 질소 그들을 동결. 마지막으로, freeze-dry 24 h에 대 한 샘플.
4. 하이드로 겔/회전 타원 체 구조와 25.0에서 스캐닝 전자 현미경 (SEM)과 형태 분석 kV, 아래 70 최대 5 X 40의 확대와 함께 Pa (압력 챔버) 000 X.

온도 스윕 25 ° C와 37 ° C에서 A3G7 전조의 뚜렷한 차이 보여줍니다. 전조는 37 ° C에 액체 있으며 1938.1 ± 84.0 mPa의 복잡 한 점도 큰 G에 의해 유효성이 검사 되는 s, x "G 이상 '. 으로 온도 감소, 전조 트라이-나선 형성^29,30에 젤라틴 분자의 자발적인 물리적 녹 채 인해 실제 겔 화를 겪 습. 모두 G'는 g "증가 하 고 솔-젤 전환을 나타내는 30.6 ° C에 수렴. 계수 468.5 ± 34.2 도달 감소 온도 증가를 계속 Pa의 G'와 140.7 ± 9.3 G의 Pa "25 ° C (그림 1a)에서. 우리는 인쇄 온도 25 ° C를 선택 온도 청소의 결과에 따라. 겔 화 속도 론 실험 시뮬레이션 샘플 준비 및 처리 하는 동안 발생 하는 온도 변화 (즉, 37 ° C에서 샘플을 제거 물 목욕과 25 ° C bioprinter 챔버에 배치). G', G ", 및 | η * | 낮아진된 온도에서 시간과 함께 증가 하 고 솔-젤 전환 발생 ~ 25 ° C에서 17 분 때 G' ≈ G "≈ 64.3 Pa와 손실 계수와 1 (그림 1b 및 1 c). 전조는 계속 완고 하 고 겔의 50-90 분 후 인쇄 창에 도달. 이 인쇄 창에서 전조 수 있습니다 원활 하 게 돌출 될 200 kPa의 압력으로 G25 원통형 노즐을 사용 하 여. 항복 응력의 존재 물자의 고체 처럼 행동을 의미 하 고 그것의 자신의 무게³¹견딜 압출 후 구조적 무결성을 발생 시킵니다. 스트레스 램프는 겔의 서로 다른 시간에 항복 응력을 인식합니다. 결과 항복 응력 증가 겔 화 시간이 증가 보여 줍니다. 겔의 50 분, 항복 응력에 도달 하면 325.9 펜 실바 니 아, 그 모델을 확보는 돌출 후 안정.

인쇄 된 프로 펠 러 모델 그림 2a에 표시 됩니다. Confocal 현미경 검사 법 MDA-MB-231-GFP의 IMR-90-mCherry 셀 (그림 2b) 초기 압출 위치를 확인합니다. MDA-MB-231-GFP 세포 개발 spheroids 문화 기간으로 15 일 날 30 (그림 2 c - 2 층)까지 증가 크기와 spheroids의 숫자에 의해 뒤에 시작 합니다. IMR-90-mCherry 세포의 일부는 또한 제조 (그림 2 g - 2j)를 형성 한다. 눈에 띄게, 30 일 후 문화, IMR-90-mCherry 셀 암시 하는 모델에서 가능한 마이그레이션 이벤트 처음 MDA-MB-231-GFP 셀 (그림 2f)에 의해 점령 지역에서 관찰 된다. 마찬가지로, 마이그레이션된 MDA-MB-231-GFP 세포도 관찰할 수 있습니다 IMR-90-mCherry 지배 지역에서 하루 30 (그림 2j)에.

디스크 모델 그림 3a에 표시 됩니다. Confocal 현미경 검사 법 (그림 3b) 디스크에서 균질 셀 배포를 확인합니다. MDA-MB-231-GFP 셀 프로 펠 러 모델 인쇄 때 디스크 모델에서 유사 하 게 동작 합니다. 대표 이미지는 그림 3 c - 3 층에 표시 됩니다. Sem의 영상 문화 (그림 4a)의 21 일 후는 MDA-MB-231-GFP 회전 타원 체-라덴 하이드로 겔을 보여준다. 생성 및 존재는 회전 타원 체의 셀 무료 hydrogels (그림 4b)와 SEM 이미지를 비교 하 여 유효성이 검사 됩니다.

두 종류의 세포 세포 생존 능력은 그림 4 c에 설명 했다. MDA-MB-231-GFP 셀 IMR-90-mCherry 세포에 비해 더 높은 세포 생존 능력을 표현 한다. 흥미롭게도, MDA-MB-231-GFP 셀의 가능한 셀 0에 비해 수 배로 15, 하루 전에 생존의 증가 추세를 전시 한다. 이것은 전날 21, 30 일에 다시 복구에 감소 옵니다. 반면, IMR-90-mCherry 셀 문화 기간 전체 동안 최소한의 변동 가능성에 있다. 하루 21에서 MDA-MB-231-GFP 세포의 생존 능력에 감소 값 괴 코어를 개발 했다 큰 MTCSs 형성에 해당 합니다.

그림 1: 히드로 전조의 유 변 학적 특성. (한) A 온도 스윕 30.6 ° c.에 sol 젤 전환 표시 (b-c) A3G7 선구자의 겔 화 속도 론에서는 G의 증가 ', G ", 및 | η^*| 겔 화, 시간과 솔-젤에서 전환 25 ° c.에서 약 17 분 발생 (d)이이 패널 대 전조의 항복 응력의 겔 화 시간 표시합니다. 항복 응력의 증가 더 이상 고 시간 관찰 됩니다. 결과 평균 ± SD, n≥ 3에에서 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

IMR-90-mCherry myofibroblast 및 MDA-MB-231-GFP 유방암 세포의 구성 된 3D bioprinted에 체 외 모델 내에서 그림 2: MCTS 형성. (한)이이 사진 표시 샘플 생체 외에서 bioprinted (왼쪽)와 CAD 모델 (오른쪽). (b)이 대표적인 confocal 시간 경과 이미지 표시는 MDA-MB-231-GFP (녹색) 그리고 IMR-90-mCherry (레드) 세포 모델 내에서 bioprinted. (c - f) 이러한 확대/축소 기능 MDA-MB-231-GFP 셀 영역 (흰색 점선된 상자)를 표시 합니다. (g - j)이 줌 기능 표시 IMR-90-mCherry 셀 영역 (노란색 점선된 상자). 눈금 막대는 패널 2a, 패널 2b, 1mm 및 패널 2 c - 2j 선택된 영역, 500 µ m에서 2 m m 이며 배율 10 배. 이미지에서 주요한 "D" "문화의 일"을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 3D MDA-MB-231-GFP-라덴 히드로 디스크에서 MCTS 형성. (는)이 사진은 히드로 디스크입니다. (b)이 대표적인 confocal 이미지 MDA-MB-231-GFP 세포 합성에 포함 된 보여줍니다. (c f) 이러한 확대/축소 기능 표시 (c) (d) 7, (e) 15, 0에서 MDA-MB-231-GFP 셀 영역 (패널 3b에서 흰색 점선된 상자)와 (f) 문화의 21 일. 눈금 막대는 패널 3a, 패널 3b, 1 mm 및 패널 3 c -선택 된 영역에 대 한 3 층 500 µ m에서 2 m m 이며 배율 10 배. 이미지에서 주요한 "D" "문화의 일"을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: MTCSs의 형태 및 세포 생존. (한)이 SEM 이미지 문화를 보여주는 작은 MCTS (화살표 지적)의 21 일 후 젤 내 MDA-MB-231-GFP MCTS를 보여 줍니다. (b)이 SEM 이미지 셀 없이 alginate/젤라틴 하이드로 겔을 보여 줍니다. 배율을 350 X입니다. (c)이이 패널은 히드로 내 문화의 30 일 동안 MDA-MB-231-GFP IMR-90-mCherry의 세포 생존 능력을 보여줍니다. 결과 평균 ± SD로 분석 되었다 하 고 통계적으로 양방향 ANOVA를 사용 하 여 테스트 후 Bonferroni의 분석. p (*) < 0.05, n ≥ 3 데이터는 0에서 샘플을 만드는 데 사용 하는 셀 밀도로 정규화 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

셀-라덴 구조 오염 (생물학 또는 화학) 과정에서 어느 시점에 발생 하는 경우 손상 될 수 있습니다. 일반적으로, 생물 학적 오염 2 후 본 또는 색 문화의 3 일 문화 미디어 또는 bioprinted 구조 변경. 따라서, 살 균 (물리적, 화학적 소독) 모든 셀 관련 프로세스에 대 한 중요 한 단계 이다. 주목할 만한, 압력가 마로 소독 젤라틴 우리가 실시 하는 시험에서 느리게 젤 만든 고 속성을 변경 합니다. 따라서, 우리는 노출을 통해 UV alginate와 젤라틴 전원 살 균. UV 빛의 아주 한정 된 침투 능력으로 인해 매우 얇은 층 (< 0.5 m m)를 사용 해야 합니다. ³²기계 및 생물 학적 속성 조정 하 alginate과 젤라틴의 농도 임의로 바뀔 수 있다. 현재 작업에서 우리 A3G7, 및 30 일 실험을 통해 높은 안정성을 제공 하는 가교 된 하이드로 겔의 인쇄 창 동안 바람직한 전이성 제공 하므로 선택. 젤라틴의 liquefication를 강화 하는 데 도움이 DPBS에 분말을 용 해 하는 동안 60 ° C에 난방, 하는 교 질 때. 낮은 온도 사용할 수 있습니다; 그러나, 더 이상 교 반 시간 후 하셔야 합니다.

유 변 학적 온도 스윕 30.6 ° c, 다른 간행물³³와 호환이 되는 솔-젤 포인트를 제공 합니다. 이론적으로, 어떤 온도 보다 30.6 ° C 전조를 녹 일 수 있습니다. 우리는 선택 하는 37 ° C 세포 배양 매체는 37 ° C 물 욕조에 미리 데워 진에 작업을 단순화 하기 위해. 셀 혼합; 약 17 분입니다 (전에 전조 젤) 겔 화 속도 론을 바탕으로, 이 시간 후, 셀과 하이드로 겔 전 구체 혼합은 증가 점도 및 계수, 비 균질 셀-라덴 bioink를 일으키는 어렵습니다. 따라서, 고의 첫 번째 10 분 내에 셀 혼합 작업을 처리 하는 것이 좋습니다. 항복 응력 최근³⁴;까지 전이성에 영향을 미치는 소재 특성으로 간주 되지 어쨌든, 그것은 광범위 하 게 인정 폴리머 과학자 가루 반죽/세분화 된 유체^31,35,,3637의 감 적으로. 항복 응력의 존재 자체의 무게를 견딜 수 있도록 구조적 무결성을 구축 하는 데 도움이 됩니다. 높은 항복 응력 또한 압출; 증가 시작 압력을 요구할 수 있습니다. 따라서,이 때문에 과도 한 전단 응력³²셀 손상에서 될 수 있습니다. 모델 충실도 압출 과정 최적의 인쇄 창 밖에 서 발생 하는 경우 손상 될 수 있습니다. 이 문제의 일반적인 지표는 최종 bioprinted 구조에 표시 됩니다: 그것은 너무 거칠거나 너무 가장자리에 액체 일 것 이다. A3G7 선구자 구조적 안정성과 세포 생존에 만족 하 고 다른 유형의 종양을 만들려고 중간 모델¹⁴로 사용할 수 있습니다 고의 50-90 분 동안 최적의 인쇄 창 전시.

프로 펠 러 모델의 총 높이 600 µ m 4에서 생성 되는 계층 150 µ m 필 라 멘 트입니다. 이 설계 수 있습니다 영양소 및 가스 셀은 대부분 미디어는 인큐베이션 기간 동안 접촉 하는 표면에서 300 µ m으로 교환. 높은 모델 제조에서 달성 하지만 하이드로 겔³⁸, 핵심 지역에서 낮은 세포 생존에 발생할 수 있는 영양소의 제한 확산 거리의 병목 현상이 발생.

다른 전략 양식 MCTS에 생체 외에서교수형 드롭 등 미세 칩, 조립, 및 bioprinting³⁹개발 되었습니다. 그러나,이 방법론의 일부 세포 생리학, 생화학, 일반 종양 조직에서 발생 하는 다른 셀 동작을 생성을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 교수형 드롭 세력 단일 물리적 감 금⁴⁰통해 셀 집계로 남아 세포 방법. 또한, 펩 티 드의 추가 의해 양식 MCTS 화학 유도 spheroids⁴¹의 생화학을 변경할 수 있습니다. 여기에 설명 된 하이드로 겔 합성 외부 스트레스 없이 biomimetic 환경 만들어 MCTS 형성을 수 있습니다. 문화, 작은 MCTS로 다시 구성 세포의 7 일 후에 잘 분산 된 단일 셀으로 밖으로 시작 (회전 타원 체 당 이상의 6 셀), 증가 하 고 그들의 크기와 수량 문화의 30 일 동안.

이 연구의 결과에서 우리는 발견 MDA-MB-231-GFP spheroids 하루 21, 세포 생존 능력을 감소 큰 spheroids의 형성으로이 현상을 연관. 단단한 종양 외부 계층 중간 계층 및 회전 타원 체¹⁸의 내부 괴 사 성 또는 노화 코어에 비해 높은 확산 속도 선물 하는 그것에 의하여 3 개의 다른 층 구성 되어 있습니다. 이 결과에 생존 능력 감소를 설명할 수 있었다.

이 프로토콜의이 한계는 bioink (1) 역학 (2) 셀 형식 호환성. Bioink 역학 있는 인쇄 된 구조는 결함이 있는 최적의 인쇄 창에 따른 겔 화 과정 다양 한 물성을 나타냅니다. 셀 형식 호환성 동작 네이티브 vivo에서 특정 종류의 세포 (세포 선 또는 주 문화) 무 능력을 말합니다.

A3G7 히드로 높은 안정성 및 세포 생존을 달성 한다. 3D bioprinting 전통적인 세포 배양 및 작은 동물 종양 모델에 보다 현실적인 대 안으로 높은 처리량, 저렴 한 비용, 및 높은 재현성 3D 이질적인 질병 모델을 구축 사용할 수 있습니다.

저자는 공개 없다.

타오 장 그들의 장학금 지원에 대 한 중국 장학금 위원회 (201403170354)와 맥 길 엔지니어링 박사 수상 (90025) 감사합니다. 호세 G. Munguia-로페즈 CONACYT (250279와 290936 291168) 및 FRQNT (258421) 그들의 장학금 지원에 대 한 감사. 살바도르 플로레스-토레스 CONACYT을 자금 (751540) 그들의 장학금 감사 합니다. 조셉 M. Kinsella 주셔서 국가 과학 및 공학 연구 위원회, 캐나다 재단 혁신, 타운센드 Lamarre 가족 재단, 그리고 맥 길 대학에 대 한 자신의 자금. 우리는 Allen Ehrlicher 그의 고분자, 우리 우리에 게 붙일 레이블된 셀 라인에 대 한 액세스를 부여에 대 한 그의 confocal 현미경, Morag 공원 사용 하 수 있도록 댄 Nicolau 사용 하 수 있도록 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.