Kantitatif analiz Drosophila nöronal dendritik Arborization karmaşıklığı

Bu iletişim kuralı dendritik morfogenez çalışmaları için kullanılan Drosophila, nöronal dendritik arborization karmaşıklık (NDAC) kantitatif analiz üzerinde duruluyor.

Dendrites bir nöron dallı projeksiyonları vardır ve sinir sisteminin gelişimi sırasında sinaptik kuruluşunda dendritik morfoloji yansıtır. Drosophila larva nöronal dendritik arborization (da) morfogenez sinir dendrites ve gen fonksiyon sinir sisteminin gelişiminde eğitim için ideal bir modeldir. Da nöronların dört sınıflardır. Sınıf IV en neredeyse larva beden Duvarı'nın tüm alanı kaplamaktadır dallanma desenli karmaşıktır. Daha önce SOX5 Drosophila ortholog Sınıf IV nöronal dendritik arborization karmaşıklık (NDAC) dört parametre kullanarak susturmak etkisini nitelendirmiştir: dendrites uzunluğu, dendrite kapsama, yüzey alanı Şube ve dallanma yapısı toplam sayısı. Bu iletişim kuralı NDAC kantitatif analiz, larva diseksiyon, confocal mikroskobu ve görüntü analiz prosedürleri ImageJ yazılımını kullanarak iş akışı sunar. Da nöronal gelişim ve onun temel mekanizmaları içine daha fazla fikir nöronal fonksiyon anlayış geliştirmek ve nörolojik temel nedenleri hakkında ipuçları sağlayabilir ve nörogelişimsel bozukluklar.

Dendrites, bir nöron dallı projeksiyonlar olan nöron'ın duyusal ve sinaptik girişleri diğer neurons^1,2kapsar alan kapak. Dendrites sinaps oluşumu önemli bir bileşenidir ve sinaptik girişleri entegre yanı sıra bir nöron elektrokimyasal stimülasyon yayılıyor kritik bir rol oynamaktadır. Dendritik arborization (da) hangi nöronlar yeni dendritik ağaçlar ve dalları yeni sinapslar oluşturmak için formu bir süreçtir. Geliştirme ve morfoloji da şube yoğunluğu ve gruplandırma desenleri, gibi çok adımlı biyolojik süreçlerden neden ve son derece için nöronal fonksiyonu ilişkili. Bu iletişim kuralının amacı nöronal dendritric arborization karmaşıklık içinde Nicel analiz için bir yöntem sağlamaktır Drosophila.

Dendrites karmaşıklığını ortak neurons girdileri, bağlantı ve sinaptik türünü belirler. Dendrites yoğunluğu ve dallanma desenleri dendritik alanı^3,4yakınsama sinyal işleme içinde söz konusu. Dendrites geliştirme ayarı için esnekliğe sahip olursunuz. Örneğin, sinaptik sinyal gelişim aşamasında somatosensor nöron ve olgun sinir sistemi⁵dendrite organizasyon üzerinde bir etkisi yoktur. Nöronal bağlantısı kurulması morfogenez ve olgunlaşma dendrites dayanmaktadır. Dendrites malformasyon Engelli nöronal fonksiyon ile ilişkilidir. Çalışmalar da nöron morfogenez anormallik Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), dahil olmak üzere birden çok nörodejeneratif hastalıklar ve Lou Gehrig hastalığı etiologies katkıda göstermiştir / Amyotrofik lateral skleroz (ALS)^6,7,8. Sinaptik değişiklikler reklam, erken dönemde gerileme ve nöron işlev^7,8bozulma ile uyum içinde görünür. Ancak, nasıl bu nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde dendrite patoloji katkıda özelliklerini zor kalır.

Dendrites gelişimini düzenleyiciler, proteinler^9,10, transkripsiyon faktörleri ve hücre yüzey reseptörlerinin^{11,12 ligandlar Wnt aile gibi karmaşık bir ağ kodlamak genler tarafından düzenlenmiştir} . Hangi Sınıf IV da nöronların en karmaşık dallanma desenleri var ve daha iyi anlama morfogenez^{13için güçlü bir deneysel sistem olarak istihdam edilmiştir (sınıf ı, II III, IV) dört sınıf, Drosophila da nöronların oluşur, 14}. Sırasında erken morfogenez, overexpression ve/veya Sınıf IV da nöronların genlerin RNAi susturmak dallanma desen ve dendrite budama¹³değiştirilmesine neden. Nöronal dendritik arborization kantitatif analiz için pratik bir yöntem geliştirmek önemlidir.

Biz daha önce SOX5 Drosophila ortholog susturmak, Sox102F, daha kısa dendrites da nöronların ve Sınıf IV da nöronların¹⁵Azaltılan karmaşıklık neden olduğunu göstermiştir. Burada, kantitatif analiz (NDAC) nöronal dendritik arborization karmaşıklığı için yordam Drosophilaiçinde mevcut. Bu iletişim kuralı, önceki açıklanan yöntemi adapte da duyusal sinir hücreleri gelişimi tahlil için kısa bir yöntem sağlar. Sağlam resim etiketleme ve üçüncü INSTAR larva vücut duvar^16,17,18,'¹⁹da nöron gösterilmektedir. NDAC ve gelişimsel farklılıkları vivo içindearaştırmak isteyen araştırmacılar için değerli bir protokoldür.

1. deneysel hazırlık

1. Aşağıdaki reaktifler hazırlamak: Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (PBS); Triton X-100; %0,2 PBST (PBS + % 0,2 Triton X-100); % 32 paraformaldehyde (PFA), %4 kullanmadan önce içine seyreltilmiş; silikon elastomer Bankası ve kür Ajan; antifade montaj Orta (Örneğin, uzatmak altın); ve tırnak Lehçe.
2. Aşağıdaki donanımları hazırlamak: diseksiyon mikroskop, iki keskin forseps ve makas mikrodiseksiyon, pins mikrodiseksiyon, diseksiyon çanak, mikroskop slaytlar ve coverslips, confocal mikroskop yapmak için bir petri için bir dizi için ve bir Fiji ImageJ yazılımı yüklü bilgisayar.

2. larvalar koleksiyonu

1. UAS-Sox102F-RNAi sinekler UAS GFP, ppk-GAL4 veya W¹¹¹⁸ vahşi türü sinekler, sırasıyla dostum. 25 ° C'de standart koşullar sinekli kültür
2. ~ 5-6 gün içinde UAS-Sox102F-RNAi üçüncü INSTAR larvaları toplamak / ppk-GAL4, UAS GFP veya UAS GFP ve ppk-GAL4 / + diseksiyon için forseps ile dikkatli bir şekilde kontrol.

3. larvalar diseksiyon

Not: Bu bölümdeki tüm yordamlar mikrodiseksiyon mikroskop altında çalışır. Büyütme oranını müfettişler kadar var. En iyi görüş görüntülemek için ayarlamak deneyin. ~ 4-6 X büyütme tavsiye edilir.

1. Bir larva silikon elastomer temel yapılan bir diseksiyon yemek ve doku kültürü Petri kabına yerleştirin.
2. Dorsal yan yüzleri yukarıya için izin vermek için larva ağız kanca pin ve larva kuyruk pin. Dorsal tarafta ortada açık-up işaret olacak midline ortaya çıkarmak mümkün olduğu kadar yerleştirin.
3. PBS 200 µL vücut nemi korumak için larva ekleyin.
4. Kaudal rostral için gelen iki tracheas arasında dorsal orta çizgi boyunca makas ile bir kesim yapmak. Her larva vücut dört bir yanına küçük bir kesim yapmak.
5. Bir PIN her vücut dört köşesine de vücudu düz yatıyor yerleştirin.
6. Larva vücut duvar %4 oranında tamir PFA oda sıcaklığında 25 dk için.
7. PBST içinde 5 dk. tekrar iki kez daha fazla yıkamak.
8. Dokudan çıkarın. O zaman doku transferi bir cam slayt antifade montaj orta ile kapak ve montaj kapak notu ile. 1s için kurutma ve tırnak Lehçe kenarları mühür.

4. görüntü işleme

Not: Bir ters confocal mikroskop sistemi kullanarak görüntüleri alındı. Kullanıcı bir 20 X amaç (önerilen) kullanarak örnek fotoğraf.

1. Z-serisi çekim. Confocal mikroskop yazılımında "Z-serisi çekim" iletişim kutusunu açın. Z serisi görüntüleri yakalamak için aralığı belirleyin.
   1. "İlk ve son" düğmesini tıklatın. Alt ve üst pozisyon ve giriş için değerleri belirlemek "alt:" ve "üst:" kutuları. "Adım" 0.5 µm "Z-Serisi yakalamak" iletişim kutusunda ayarlayın. Z-serisi görüntüleri için "Şimdi Çalıştır" düğmesini tıklatın.
2. Elde edilen görüntüler *.tiff veya *.nd2 dosyası olarak kaydedin.
3. Slaytları 4 ° C'de karanlık bir tutucu görüntüleme sonra depolama.

5. dendrite değerlendirme

Not: Co-UAS-GFP içinde overexpressed GFP protein ve ppk-GAL4 da nöronların GFP floresans analiz görüntüleme için uçar. Uzunluk, dallanma ve üçüncü INSTAR larvaları da nöronların yapısını sayısal. Analiz parametrelerini uzunluğu dendrites (µm), yüzey alanı (µm²), dalları ve dallanma yapısı (%) toplam sayısını içerir. Şekil 1 ayrıntılı olarak analiz parametrelerini gösterir.

1. Dendrites uzunluğu
   Not: Tüm dendrites izleyici eklenti etiketli toplamı dendrites uzunluğudur.
   1. Kurulum ve Fiji ImageJ (https://fiji.sc/)²⁰ yazılımı çalıştırın. Görüntülerin çeşitli kanallar varsa görüntüleri ayrı kanal içine bölünmüş.
      Not: Bu protokol görüntüde yalnızca GFP bir kanal vardır.
   2. Koşmak "görüntü | Yığınlar | Z Projesi"Z projeksiyon; almak için Yeni pencere-ecek gözükmek adıyla 'Z-projeksiyon.' "En fazla yoğunluk" projeksiyon türü için'i tıklatın ve başlangıç dilim ile stop dilim bağlı olarak arasındaki sayıları organize bireysel tercihleri üzerine. "Tamam" ı tıklayın. Bir Z-projeksiyon görüntü dendrite projeksiyon açıkça sunma görünür.
   3. Neurites takip et.
      1. Seçin "eklentileri | Segmentasyon | Basit Neurites dendrites izlemek için izleme"penceresinde. Nöron soma bulun ve sonra hücre gövdesi ve bu dendrite başka bir nokta uç başlayan bir dendrite bir noktada tıklatın.
         Not: Program iki nokta mavi çizgi ile bağlanır.
      2. Basın "Y" eklentisi penceresinde yol boşsa; dendrite yolu görünür görüntüleri seçilen yolun bitiş noktaları kadar izini sürdüm. "Tam yolu" aynı eklenti penceresini tıklatın; segment tamamladı (Şekil 2).
         Not: Bazı dendrites yolu daha küçük parçalara bölündü başlangıç noktaları uzak sona erdi. Segmentleri izleyici için tam bir yol sağlamak için kombine edilmiştir.
   4. Bir yol tamamlandıktan sonra yeni bir noktasına nerede dallar dön. Yeni yol inşa; "Bütün yollar" pencere kutusu tüm yolları (Şekil 3) uzunluğu değerini gösterir. İzleme dosyasını kaydedin ve Şekil 2' de gösterildiği gibi yarım kalmış izleri ile devam.
   5. Birini tıklatarak, dendrite uzunluğu veri verme "dosya | *.CVS 'Eklenti' penceresinde vermek". Kadar tüm yol uzunlukları toplamı ve verileri bir veri analizi/elektronik tablo yazılımı için verin. (Şekil 3).
2. Da nöronların yüzey alanı
   1. Serbest çizim aracı 'Fiji ImageJ' penceresinde seçin. Yolu izlemek ve bitiş noktaları bağlayın. 'Analiz et' menüde "Set ölçümleri | Alanı." "Ölçü" 'Analiz et' menüsünden'ı tıklatın. Sonuç seçili alanı (Şekil 4) için değer ile yeni bir kutu görünür. Veri analiz yazılımı için kopyalayın.
3. Toplam şube sayısı ve dallanma yapısı da nöronların
   1. "Analiz" açarak toplam şube sayısını hesaplamak ve sonra "Render | Skeletonized yolları eklentisi penceresinde (Şekil 5) izleme analiz".
      Not: Arbor yapısını dalları düzeyde toplamıdır. Yolun hücre vücut ve dendrite ipuçları arasında tanımlanmış olan ve birincil arbors nöron hücre vücuttan dendrites gibi bir yol birden çok dalları, içerebilir. İkincil arbors birincil ve benzeri Tersiyer, Kuvaterner ve beşli arbors ile gelen dallar. Dendrite dallanma yapısı dalları düzeylerine bağlı olarak ayrılır. Örneğin, birincil % dalları dallanma toplam numarasına göre bölünmüş ve vb. sayısıdır.

Dendrites da nöronların co-overexpressing GFP (UAS GFP; ppk-GAL4) tarafından da sinirsel soma ve dendritik arbors GFP floresans analiz görüntüleme için etiketli. Da nöron dendrites morfoloji bir ters confocal mikroskobu (Şekil 2) tarafından görüntüsü.

Dendrites da nöronların Fiji ImageJ yazılımını kullanarak takip edildi. Dosyayı dendrite uzunluğu (Şekil 3) tahmin etmek için kullanıldı. Sox102F susturmak da nöronların (N = 21) (UAS-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; UAS-GFP) kontrollere göre daha basit bir yapıya sahip dendrites ve kısa bir dal uzunluğu sayısında belirgin bir şekilde azaltılmasına yol açtı (N = 20) (UAS GFP; ppk-GAL4 / +) içinde üçüncü INSTAR larva (Şekil 6). Özellikle, hangi Sox102F susturulması sinekler 127 µm denetimlerde 249 µm göre ortalama dendrite uzunlukta bir azalma sergilenen (p = 0.02), ve bir daha küçük ortalama arbor yüzölçümü 552,476 µm² ile karşılaştırıldığında 847,571 µm² ' e vardı denetimleri (p = 0.04). Buna ek olarak, Sox102F susturmak dalları daha az sayıda ve arbors 17 (17,3 ± 6,7), 28 (28,4 ± 9.5) denetimleri ile karşılaştırıldığında toplam dalları ile basit bir dallanma yapısı sonuçlandı (p = 0.04). Öğrenci t-testleri gruplar arasındaki farkları karşılaştırmak için gerçekleştirilen ve önem düzeyi 0.05 ayarlamak.

Resim 1 : Dendrite analiz parametrelerini Drosophila da nöron şemaları. (A) da nöron orijinal görüntü paneldir. (B) Dendrite uzunluğu ortalama tüm ölçülen da nöronlar içinde tüm dendrite uzunlukları oldu. (C) da nöron dendrite yüzey alanı el ile ImageJ serbest aracı tarafından tanımlanmıştır. (D) bu şematik toplam şube sayısını ve dallanma yapısı da nöron çözümlemek gösterilmiştir. 1: birincil ağaç dikme. 2: ikincil ağaç dikme. 3: üçüncül ağaç dikme. 4: Kuvaterner ağaç dikme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Temsilcisi izlemeyi da nöron dendrites. Da nöron bir confocal floresan mikroskop sistem görüntüsü. (A) ilk izleme hücre vücut ve bir dendrite bitiş noktası başlangıç noktasından ile eklenti/bölümleme aracı kullanılarak oluşturuldu. Mavi çizgili (beyaz ok) tanımlanan yolu temsil eder. Tıkırtı "Evet sonra" (kırmızı ok), çizgi renk maviden kırmızıya değiştirir. (B) "Yolda" bitirmek tıkladıktan mor (C)görünecektir. (A-C) Tek bir dendrite izleme işlemini gösterir; (D) tam görüntü tespit ettik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Ölçüm izlenen yolları. Soldaki görüntü izleme yolları çalıştırdıktan sonra ölçmek nasıl gösterir "analiz | Ölçü yolları." Yol uzunluğu değerleri bir elektronik tablo dosyasına verin ve uzunluğu toplamı hesaplayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Dendrite yüzey alanı el ile tanımlayan bir örnek. Tanımlanmış bir görüntü (kırmızı okla gösterilen) ImageJ window menüsü içinde serbest el aracıyla da elde edildi. Ölçümler alanı seçerek ayarlayın. Kırmızı kutusunda gösterilen alanı elde etmek için "Ölçü" işlevini çalıştırın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : Dallanma analizi örneği. Koşmak "Analysis_Render | Skeletonized yolları "Segmentasyon" eklentisi penceresinde analiz". İşlenmiş yolları ve onların sayısını seçerek elde edilmiştir "tüm yolları Render | Özeti edinin." Yolun hücre vücut ve dendrite ipuçları arasında tanımlanmış olan ve bir yol birden çok dalları içerebilir; Örneğin, birincil arbors nöron hücre vücuttan dendrites vardı; ikincil arbors dalları birincil ve benzeri Tersiyer, Kuvaterner ve beşli arbors ile gelen edildi. Dendrite dallanma yapısı dalları düzeylerine bağlı olarak ayrıldı. Örneğin, birincil % dalları dallanma toplam numarasına göre bölünmüş vb. sayısı oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 : Temsilcisi sonuçları da nöronların Sox102F damping. Önemli ölçüde yol açtı da nöronların (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ppk-GAL4) Sox102F susturmak dendrite uzunluğu azaltılmış ve daha kısa üçüncü INSTAR larva basit yapısı ile dallanma kontrollere göre. Sox102F-RNAi sinekler arasındaki farklar (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ppk-GAL4, N = 21) ve kontrol (UAS GFP; ppk-GAL4 / +, N = 20) sinekler vardı(a)dendrite uzunluğu (B) arbor yüzey alanı (C) toplam sayısına şube ve (D, E ) da nöronların dallanma yapısı. Öğrenci T-testi perfomed istatistiksel analiz için yapıldı. * istatistiksel anlamlılık gösterir (p < 0,05). Hata çubukları ortalama ± standart sapma vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Epidermis innervate dendrites nöronların giriş bölgeleridir ve onların türleri morfoloji nasıl bilgi alınır ve bireysel nöronlar tarafından işlenen belirler. Geliştirme dendrite morfoloji gen modülasyon dendrite organizasyon yansıtır. Drosophila larva da nöron periferik sinir sisteminin dendrite geliştirme eğitimi için önemli bir model olduğunu: 1) memeliler^11,12ile; fonksiyonel benzerlik 2) dört sınıf ayrımlar dendrite yapısı^11,12tarihinde göre; ve 3) morfogenez düzenleyen genetik faktörler. Bu protokol için biz Larva hazırlık akışından Drosophila da nöronların görüntü analizi için mevcut. Yöntemleri dendrites, yüzey alanı, dalları toplam sayısına ve dallanma yapısı uzunluğu olan da nöronların ayrıntılı, dendrites analiz etmek için dört önemli parametreler açıklanmaktadır. Kritik adım tam da nöronların görüntüleme ve analizler için ortaya çıkarmak için mümkün olduğunca larva vücut duvardan gibi birçok doku kaldırmak oldu. Bazı kısa dalları Z-projeksiyon görüntüleri sınırlı sayıda nedeniyle kesilmiş olabilir. Bu yöntem dendrites uzunluğu kontrolleri ile karşılaştırıldığında göreceli ölçüm olduğundan, çok sayıda resim da nöronların her grup için Z-projeksiyon görüntü kapsama alanlarında artırmak için alınmalıdır.

Drosophila Sınıf IV da nöronların dendrite arbor morfoloji^15,21,22,23ile ilgili araştırma odak noktası olmuştur. Morfogenez dendritik arbor gelişiminin kaybı veya kilo alma da nöron geliştirme genetik değişiklikler²⁴için hassas olduğunu gösteren gen işlevinin tarafından kesilmiş. Genetik çalışmalar için morfoloji doğru da nöronların üzerindeki etkisini anlamak için analiz etmek önemlidir. Sınıf IV da nöronların karmaşık ama sadece yarı saydam vücut duvar ve şube, iki boyutlu uzayda neredeyse tamamen altında bulunması nedeniyle yüksek kaliteli görüntüleme için hala erişilebilir. Dinamik GFP floresans etiketli da nöronların (ppk-GAL4; UAS-GFP) nöronal gelişim araştırmak için kolayca görüntülenmeyecektir bir modeli sağlar. Morfoloji değişim yönüne değişir, arbors overbranched veya Basitleştirilmiş olur. Burada, biz bu morfolojik kategorize niceliksel parametrelerini tarafından Örneğin dendrite uzunluğu, yüzey alanı, dalları toplam sayısına ve da nöronların dallanma yapısını değiştirir. Sonuçlar Sox102F ifade nöronal gelişim, düzenleyen yanıtta Bu çalışmada gösterildiği gibi yansıtacak.

Bizim iletişim kuralı sinekli Sınıf IV da nöronların morfolojik değişiklikleri göstermek için kullanılan hangi SOX5, Sox102F, Drosophila ortholog, SOX5 önemli bir işlevsel rol dendrite gelişme gösteren sustu içinde ve morfogenetik. Wnt proteinler dendrite morphogeneis düzenlenmesinde karıştığı salgılanan glikoproteinlerin bir aileyiz. Wnt2 ve Wnt7b da ve nöronal karmaşıklık^9,10teşvik. Wnt kurallı yolu bu harekete geçirmek GSK3β, β-catenin aracılı transkripsiyon^10,25sırayla etkinleştirir bir serin-treonin kinaz aktivasyonu tarafından takip edilir. Biz daha önce SOX5 insan SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinde, susturmak Wnt sinyal faaliyetinin önemli bir baskı sonuçlandı ve ifade Wnt genlerin GSK3β bir overexpression de dahil olmak üzere çok sayıda düzenlenir bulduk ¹⁵. GSK3β artan ifade AD, hafıza kaybı, β-amiloid veba ve tau²⁶anormal hyperphosphorylation gibi hallmark özellikleri ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. SOX5 susturmak SOX5 ve GSK3β arasında işlevsel bir bağlantı olduğunu gösterebilir GSK3β ifade arttı.

Sınıf IV da nöronların tüm duyusal nöronların çoğu son derece karmaşık dendrites var. Bu protokol için ağaç dikme ve dalları Sınıf IV da geleneksel mevcut eklentileri ve yazılım Drosophila nöronlarda temel özelliklerini soyut analiz etmek için bir yöntem geliştirdik. Confocal mikroskop--dan alınmıştır görüntüleri analiz edildi ve^27,28dendrite izlemek için ideal bir araç dalları basit neurite izleme eklentisi ayrılmasını sağladı. Buna ek olarak, bu miktar Yöntem soma daha uzak dendrite dallanma, çeşitli düzeylerde oranları sunarak dendrite karmaşıklık ayrıntılı bir analiz için izin verir. Ayrıca, bu yöntem diğer sınıflar da nöronların analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, sınıf ı da nöronların gövde duvar; bir yana ikincil dendrites genişletmek Sınıf II simetrik olarak bifurcating dalı vardır; ve Sınıf III da nöronların dallanma ve sivri daha fazla karmaşa. Özet olarak, biz bir protokol, görüntüleme ve analiz Sınıf IV da nöronların Drosophilanöronal dendrite analizleri sağladı.

Yazarlar ifşa gerek yok.

William A. Eimer görüntüleme teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser tedavisi Alzheimer Fonu'na [R.E.T], tarafından desteklenen Ulusal Enstitüsü Sağlık [R01AG014713 ve R01MH60009 için R.E.T; R03AR063271 ve Al R15EB019704] ve Ulusal Bilim Vakfı [NSF1455613 için al].