Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila

Este protocolo se centra en el análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila, que puede ser utilizado para estudios de morfogénesis dendríticas.

Las dendritas son las proyecciones ramificadas de la neurona, y morfología dendrítica refleja organización sináptica durante el desarrollo del sistema nervioso. Arborización dendrítica neuronal (da) de larvas de Drosophila es un modelo ideal para el estudio de morfogénesis de las dendritas neuronales y funciones de los genes en el desarrollo del sistema nervioso. Hay cuatro clases de neuronas da. Clase IV es el más complejo con un patrón de ramificación que cubre casi toda la zona de la pared del cuerpo larval. Anteriormente hemos caracterizado el efecto de silenciar el ortólogo de Drosophila de SOX5 en clase de complejidad de la arborización dendrítica neuronal del IV (NDAC) utilizando cuatro parámetros: la longitud de las dendritas, la superficie de la cobertura de la dendrita, el número total de ramas y la estructura de ramificación. Este protocolo presenta el flujo de trabajo de análisis cuantitativo NDAC, consisten en larvas disección, microscopia confocal y procedimientos de análisis de imagen usando el software ImageJ. Más penetración en el desarrollo neuronal de da y sus mecanismos subyacentes mejorará la comprensión de la función neuronal y proporcionar pistas sobre las causas fundamentales de neurológico y trastornos del neurodesarrollo.

Las dendritas, que son las proyecciones ramificadas de la neurona, cubren el campo que abarca entradas sensoriales y sinápticas de la neurona de otras neuronas^1,2. Las dendritas son un componente importante de la formación de sinapsis y juegan un papel crítico en la integración de entradas sinápticas, así como propagar el estímulo electroquímico en una neurona. Arborización dendrítica (da) es un proceso por el cual las neuronas forman nuevos árboles dendríticos y ramas para crear nuevas sinapsis. El desarrollo y la morfología de la da, como rama densidad y patrones de agrupación, resultan de procesos biológicos de múltiples pasos y están altamente correlacionados con la función neuronal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método para el análisis cuantitativo de la complejidad de arborización neuronal dendritric en Drosophila.

La complejidad de las dendritas determina los tipos sinápticos, conectividad y entradas de las neuronas de la pareja. Patrones de ramificación y la densidad de las dendritas están involucrados en el procesamiento de las señales que convergen en el campo dendrítico^3,4. Las dendritas tienen la flexibilidad para el ajuste en el desarrollo. Por ejemplo, señalización sináptica tiene un efecto en la organización de la dendrita en las neuronas somatosensoriales durante la fase de desarrollo y en el sistema nervioso maduro⁵. El establecimiento de la conectividad neuronal se basa en la morfogénesis y maduración de las dendritas. Malformación de las dendritas se asocia con deterioro de la función neuronal. Los estudios han demostrado que la anormalidad de la morfogénesis de la neurona da podría contribuir a las etiologías múltiples enfermedades neurodegenerative, incluyendo enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), y enfermedad de Lou Gehrig / Esclerosis lateral amiotrófica (ELA)^6,7,8. Alteraciones sinápticas aparecen en la etapa temprana de la EA, en concierto con la decadencia y la debilitación de la neurona función^7,8. Sin embargo, los detalles de cómo patología dendrita contribuye a la patogénesis de estas enfermedades neurodegenerativas sigue siendo elusiva.

El desarrollo de las dendritas está regulado por los genes que codifican una compleja red de reguladores, como la familia Wnt de proteínas^9,10, factores de transcripción y ligandos de receptores de superficie celular^11,12 . Drosophila da las neuronas consisten en cuatro clases (clase I, II III, IV), de que clase IV da neuronas tienen los patrones de ramificación más complejos y han sido utilizadas como un potente sistema experimental para la mejor comprensión morfogénesis^{13, 14}. Durante la morfogénesis temprana, sobreexpresión o ARNi silenciamiento de genes en neuronas de clase IV da como resultado cambios en los patrones de ramificación y poda de dendrita¹³. Es importante desarrollar un método práctico para el análisis cuantitativo de la arborización dendrítica neuronal.

Previamente hemos demostrado que silenciar el ortólogo de Drosophila de SOX5, Sox102F, condujo a más cortas dendritas de las neuronas de da y menor complejidad en clase IV da neuronas¹⁵. Aquí, presentamos el procedimiento de análisis cuantitativo para la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila. Este protocolo, adaptado de la metodología anterior descrita, proporciona un método breve para analizar el desarrollo de las neuronas sensoriales da. Ilustra la imagen robusta de etiquetado y de las neuronas da en el tercer estadio larval de cuerpo de pared^16,17,18,19. Es un protocolo de valioso para los investigadores que deseen investigar la NDAC y diferencias del desarrollo en vivo.

1. experimental Preparación

1. Preparar los reactivos siguientes: fosfato de Dulbecco tamponada con solución salina (PBS); Triton X-100; 0.2% SAFT (PBS + 0,2% Tritón X-100); 32% paraformaldehido (PFA), diluido en 4% antes de su uso; base de elastómero de silicona y agente de curado; medio de montaje Antifade (por ejemplo, prolongar la oro); y esmalte de uñas.
2. Preparar los siguientes equipos: microscopio de disección, dos afiladas pinzas y un par de tijeras para microdisección, un número de pernos para microdisección, una placa de Petri para la fabricación de la placa de disección, portaobjetos y cubreobjetos, microscopio confocal y un computadora con software ImageJ de Fiji.

2. larvas colección

1. Compañero de UAS-Sox102F-ARNi moscas con UAS-GFP, ppk-GAL4 o moscas de tipo salvaje de¹¹¹⁸ W, respectivamente. Cultura vuela en condiciones estándar a 25 ° C.
2. En ~ 5-6 días, recoger las larvas de tercer estadio de UAS-Sox102F-RNAi / ppk-GAL4, UAS-GFP o UAS-GFP y ppk-GAL4 / + control cuidadosamente con pinzas para la disección.

3. disección de larvas

Nota: Todos los procedimientos en esta sección son operados bajo un microscopio de microdisección. La magnificación depende de los investigadores. Trate de ajustar a la vista de vista óptima. Se recomiendan ~ 4-6 aumentos.

1. Coloque una larva en un disección plato de elastómero de silicona base y un cultivo de tejidos de Petri.
2. Fijar el gancho de la boca de la larva para permitir que el lado dorsal hacia, y luego prender la cola de la larva. Coloque el lado dorsal en el medio tanto como sea posible para exponer la línea media, que será el marcador de abren-para arriba.
3. Añadir 200 μL de PBS a la larva para mantener la humedad del cuerpo.
4. Hacer un corte con tijeras a lo largo de la línea media dorsal entre el dos traquear, de caudal a rostral. Hacer un pequeño corte en cada una de las cuatro esquinas del cuerpo de la larva.
5. Coloque un alfiler en cada una de las cuatro esquinas del cuerpo, por lo que el cuerpo quede plano.
6. Fijar a la pared del cuerpo de la larva en el 4% PFA 25 min a temperatura ambiente.
7. Lavado en SAFT 5 minutos repetir dos veces más.
8. Quite los pernos del tejido. Luego transferir el tejido en un portaobjetos de vidrio, tapa con medio de montaje antifade y montar con un cubreobjetos. Secar durante 1 hora al aire y sellar los bordes con esmalte de uñas.

4. procesamiento de imágenes

Nota: La imágenes fueron tomadas con un sistema de microscopio confocal invertido. El usuario puede fotografiar la muestra utilizando un objetivo de 20 X (recomendado).

1. Capturar imágenes de la serie Z. Abra el cuadro de diálogo "Capturar serie Z" en el software del microscopio confocal. Determinar el rango para la captura de las imágenes de la serie Z.
   1. Haga clic en el botón "Arriba y abajo". Determinar la parte superior e inferior posición y los valores para la entrada "fondo:" y "Top:" cajas. Establecer el "paso" en el cuadro de diálogo "Capturar serie Z" como 0,5 μm. Haga clic en el botón "Ejecutar ahora" para adquirir las imágenes de la serie Z.
2. Guardar las imágenes obtenidas como ficheros *.tiff o *.nd2.
3. Almacenar las diapositivas en un soporte oscuro a 4 ° C después de la proyección de imagen.

5. dendrita evaluación

Nota: La proteína GFP fue co-overexpressed en UAS-GFP y ppk-GAL4 vuela en las neuronas de da para análisis de imagen de la fluorescencia de GFP. La longitud, ramificación y estructura de las neuronas da en las larvas de tercer estadio fueron cuantificados. Parámetros de análisis incluyen la longitud de las dendritas (μm), superficie (μm²), número total de ramas y la estructura de ramificación (%). La figura 1 muestra los parámetros de análisis en detalle.

1. Longitud de las dendritas
   Nota: La longitud de las dendritas es la suma de todas las dendritas en plugin del rastreador.
   1. Configurar y ejecutar software de Fiji ImageJ (https://fiji.sc/)²⁰ . Luego dividir imágenes en canales separados, si hay varios canales de imágenes.
      Nota: La imagen en este protocolo solamente tiene un canal de GFP.
   2. Ejecutar "imagen | Pilas | Proyecto Z"para obtener una proyección de Z; aparecerá una nueva ventana con el nombre de 'Proyección de Z.' Haga clic en "máxima intensidad" para el tipo de proyección y organizar números entre rebanada de inicio y parada de slice dependiendo en las preferencias individuales. Haga clic en "Aceptar". Una imagen de proyección Z aparece presentando claramente la proyección de la dendrita.
   3. Seguimiento de las neuritas.
      1. Seleccione "Plugins | Segmentación | Simple Neurites Tracer"en la ventana a las dendritas. Encuentra el soma de la neurona y haga clic en un punto en una dendrita desde el cuerpo celular y otro punto en la punta de esta dendrita.
         Nota: El programa Conecte los dos puntos con una línea azul.
      2. Pulse "Y" en la ventana del plugin si el camino está claro; el camino de la dendrita se remonta hasta los extremos de la ruta seleccionada en las imágenes visibles. Haga clic en "ruta completa" en la ventana del plugin mismo; se completa el segmento (figura 2).
         Nota: Algunas dendritas terminaron lejos de los puntos de partida, en el que el camino se dividió en segmentos más pequeños. Los segmentos se combinaron para proporcionar una ruta completa para el palpador.
   4. Después de un camino, regresar a un nuevo punto donde las ramas son. El nuevo camino puede construirse la caja de la ventana de "Todos los caminos" se muestran los valores de longitud de todos los caminos (figura 3). Guarde el archivo de seguimiento y continuar con los rastros sin terminar como se muestra en la figura 2.
   5. Exportar los datos de longitud de la dendrita pulsando, "archivo | Exportar como *.cvs"en la ventana de 'Plugin'. Luego suma todas las longitudes de trayectoria y exportar los datos a un software de hoja de cálculo/análisis de datos. (Figura 3).
2. Superficie de las neuronas de da
   1. Seleccione la herramienta de dibujo a mano alzada en la ventana de 'Fiji ImageJ'. Trazar el camino y luego conecte los extremos. En el menú de 'Analizar', seleccione "Set medidas | Área". Haga clic en "medida" en el menú de 'Analizar'. El resultado aparece en un nuevo cuadro con el valor para el área seleccionada (figura 4). Copiar el software de análisis de datos.
3. Total número de ramas y la estructura de ramificación de las neuronas de da
   1. Calcular el número total de ramas mediante la apertura de "Análisis" y luego "Render | Analizar rutas Skeletonized"en la ventana del plugin de seguimiento (figura 5).
      Nota: La estructura del eje es la suma de los niveles de las ramas. La ruta fue definida entre el cuerpo celular y las puntas de la dendrita, y una ruta de acceso puede incluir múltiples ramas, como la herramienta principal es las dendritas desde el cuerpo celular de la neurona. Los cenadores del secundarios son ramas de la primaria y así sucesivamente con los cenadores terciario, cuaternario y quinario. La estructura de la dendrita ramificación se separa según los niveles de las ramas. Por ejemplo, el % primario es el número de ramas divididas por el número total de ramificación y así sucesivamente.

Las dendritas de las neuronas de da fueron etiquetadas por co-overexpressing GFP (GFP UAS; ppk-GAL4) en el soma neural da y cenadores dendríticos para análisis de imagen de la fluorescencia de GFP. La morfología de las dendritas de la neurona da era reflejada por un microscopio confocal invertido (figura 2).

Las dendritas de las neuronas da se trazaron utilizando el software ImageJ de Fiji. El archivo se utilizó para estimar la longitud de la dendrita (figura 3). Silenciamiento de Sox102F en las neuronas de da (N = 21) (UAS-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; UAS-GFP) condujo a una reducción significativa en el número de dendritas y una longitud más corta de la rama con una estructura más simple en comparación con los controles (N = 20) (UAS-GFP, ppk-GAL4 / +) en la larva de tercer estadio (figura 6). Específicamente, moscas en la que fue silenciado Sox102F exhibieron una reducción en la longitud de la dendrita promedio 127 μm comparado con 249 μm en los controles (p = 0,02), y tenía una superficie menor promedio arbor de 552.476 μm² en comparación con 847.571 μm² en los controles (p = 0,04). Además, silenciamiento de Sox102F dio lugar a un menor número de ramas y una estructura más simple de la ramificación de árboles con ramas total de 17 (17.3 ± 6.7), en comparación con 28 (28,4 ± 9,5) en los controles (p = 0,04). Se realizaron pruebas t de Student para comparar las diferencias entre los grupos, y el nivel de significación se estableció en 0.05.

Figura 1 : Esquemas de parámetros de análisis dendrita de la neurona da Drosophila . El panel (A) es la imagen original de la neurona da. (B) longitud de la dendrita fue el promedio de todas las longitudes de todas las neuronas de da medida dendrita. (C) la superficie de la dendrita de la neurona da manualmente fue definida por la herramienta a mano alzada de ImageJ. (D) este esquema muestra cómo contar el número total de ramas y analizar la estructura de ramificación de una neurona da. 1: eje primario. 2: eje secundario. 3: eje terciario. 4: eje cuaternario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Trazo representativo de las dendritas de una neurona da. Una neurona da fue fotografiada con un sistema de microscopio de fluorescencia confocal. (A) el primer trazo fue creado con un punto de partida desde el cuerpo celular y el punto final de una dendrita mediante la herramienta plugin/segmentación. La línea azul (flecha blanca) representa la ruta definida. Después de hacer clic en "sí" (flecha roja), la línea cambia de color de azul a rojo. (B) haciendo clic en"terminar" aparece púrpura (C). (A-C) Muestra el proceso de trazar una sola dendrita; (D) el trazado de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Medición de trazado caminos. La imagen de la izquierda muestra cómo medir los caminos de traza después de ejecutar el "Análisis | Medida de caminos". Exportar valores de longitud de ruta de acceso a un archivo de hoja de cálculo y calcular la suma de la longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Un ejemplo de definición de la superficie de la dendrita manualmente. Se obtuvo una imagen definida mediante la herramienta freehand en el menú de ventana de ImageJ (indicado por flecha roja). Establecer las mediciones seleccionando zona. Ejecute la función de "Medida" para obtener el área que se muestra en el cuadro rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Un ejemplo de análisis de ramificación de. Ejecutar "Analysis_Render | Analizar rutas Skeletonized"en la ventana del plugin"Segmentación". Las rutas de procesado y su número se obtuvieron mediante la selección de "hacer que todos los caminos | Obtener extracto". La ruta fue definida entre el cuerpo celular y las puntas de la dendrita, y una ruta de acceso puede incluir varias ramas; por ejemplo, la herramienta principal era las dendritas de la neurona cuerpo celular; los cenadores secundarias eran ramas del primario y así sucesivamente con los cenadores terciario, cuaternario y quinario. La estructura de la dendrita ramificación fue separada según los niveles de las ramas. Por ejemplo, % primaria fue el número de ramas divididas por el número total de ramificación y así sucesivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Resultados representativos de silenciamiento de Sox102F en las neuronas da. Silenciamiento de Sox102F en las neuronas de da (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP, ppk-GAL4) condujo a significativamente reducida Longitud de la dendrita y menor ramificación con estructura más simple en la tercera larva instar comparado con controles. Las diferencias entre Sox102F-ARNi moscas (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP, ppk-GAL4, N = 21) y control (UAS-GFP, ppk-GAL4 / +, N = 20) moscas estaban en (A) dendrita longitud (B) eje superficie (C) número total de ramas y (D, E ) estructura de ramificación de las neuronas de da. Prueba T de Student fue realizadas para el análisis estadístico. * indica significancia estadística (p < 0,05). Las barras de error son media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las dendritas que inervan la epidermis son las regiones de entrada de las neuronas y sus morfologías determinan cómo la información es recibida y procesada por neuronas individuales. Morfología de dendrita de desarrollo refleja la modulación genética de la organización de la dendrita. La Drosophila larvas da neurona del sistema nervioso periférico es un importante modelo para el estudio de desarrollo de la dendrita debido: 1) la similitud funcional con mamíferos^11,12; 2) cuatro distinciones de clase basadas en dendrita estructura^11,12; y 3) los factores genéticos que regulan la morfogénesis. En este protocolo, se presenta el flujo de trabajo desde la preparación de las larvas para análisis de imagen de las neuronas da de Drosophila . Los métodos describen los cuatro parámetros importantes para el análisis de las dendritas de las neuronas da de detalle, que son la longitud de las dendritas, la superficie, el número total de ramas y la estructura de ramificación. El paso crítico fue al quite como muchos tejidos de la pared del cuerpo de la larva como sea posible para exponer completamente las neuronas da para análisis y proyección de imagen. Puede haber algunas ramas cortas cortadas debido al número limitado de imágenes Z-proyección. Como este método es la medida relativa de la longitud de las dendritas en comparación con los controles, una gran cantidad de imágenes para cada grupo de neuronas da se debe aumentar el área de cobertura de imágenes Z-proyección.

Neuronas de da de Drosophila clase IV han sido el foco de la investigación sobre la dendrita arbor morfología^15,21,22,23. Morfogénesis del desarrollo dendrítico cenador pueden interrumpirse por pérdida o ganancia de función del gene, demostrando que el desarrollo de la neurona da es sensible a cambios genéticos²⁴. Para los estudios genéticos, es importante analizar morfología precisa para comprender su impacto en las neuronas de da. Clase IV da neuronas son complejas pero todavía accesible de alta calidad de imagen porque se encuentran justo debajo de la pared del cuerpo semitransparente y rama, casi en su totalidad en dos dimensiones espaciales. La fluorescencia de GFP dinámica marcado da neuronas (ppk-GAL4; UAS-GFP) proporcionan un modelo fácilmente visualizado para investigar el desarrollo neuronal. La dirección del cambio de la morfología varía, cenadores pueden overbranched o simplificados. Aquí, clasifican estos morfológicos cambios parámetros de cuantitativo, por ejemplo, la longitud de la dendrita, el área de superficie, el número total de ramas y la estructura de ramificación de las neuronas de da. Los resultados reflejan la respuesta en la expresión de Sox102F regulación de desarrollo neuronal, como se muestra en este estudio.

Nuestro protocolo se utiliza para mostrar los cambios morfológicos de las neuronas da de clase IV en moscas en que el ortólogo de Drosophila de SOX5, Sox102F, fue silenciado, lo que indica un papel funcional importante de SOX5 en el desarrollo de la dendrita y morfogénesis. Las proteínas Wnt son una familia de glicoproteínas secretadas que han sido implicados en la regulación morphogeneis de la dendrita. Wnt2 y Wnt7b promueven da y complejidad neuronal^9,10. En el camino canónico de Wnt, esta activación es seguida por la activación de GSK3β, una serina-treonina quinasa, que a su vez activa mediada por β-catenina transcripción^10,25. Previamente hemos encontrado que silenciamiento de SOX5 en células de neuroblastoma SH-SY5Y humanas dio lugar a una importante represión de la actividad de señalización de Wnt y regula la expresión de un número de genes Wnt incluyendo una sobreexpresión de GSK3β ¹⁵. Aumento de la expresión de GSK3β se ha asociado con las características del sello de DC, incluyendo pérdida de memoria, plagas de β-amiloide y la hiperfosforilación anormal de la tau²⁶. Silenciamiento de SOX5 mayor expresión de GSK3β, que pudiera indicar un vínculo funcional entre SOX5 y GSK3β.

Las neuronas de da clase IV tienen las dendritas más complejas de todas las neuronas sensoriales. En este protocolo, hemos desarrollado un método para analizar la complejidad del eje y ramas para abstraer las propiedades de da de IV clase neuronas en Drosophila basadas en software y plugins disponibles convencionalmente. Se analizaron imágenes que fueron tomadas de un microscopio confocal y la segmentación de plugin de un trazador de neurita simple proporciona una herramienta ideal para trace la dendrita ramas^27,28. Además, este método de cuantificación permite el análisis detallado de la complejidad de la dendrita presenta los cocientes de varios niveles de ramificación desde el soma a la dendrita más distante. Además, este método podría utilizarse para analizar otras clases de neuronas da. Por ejemplo, la clase da neuronas extienden dendritas secundarias a un lado de la pared del cuerpo; clase II tiene ramas bifurca simétricamente; y neuronas de clase III da más complejidad de ramificación y picos. En Resumen, hemos incluido un protocolo de la proyección de imagen y análisis de las neuronas de da de IV clase para análisis de dendrita neuronal en Drosophila.

Los autores no tienen nada que revelar.

Nos gustaría agradecer a William A. Eimer por proyección de imagen de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por fondo el cura de Alzheimer [R.E.T], el Instituto Nacional de salud [R01AG014713 y R01MH60009 en la R.E.T; R03AR063271 y R15EB019704 a A.L. y la Fundación Nacional de ciencia [NSF1455613 a A.L.].