Análise quantitativa da arborização dendrítica Neuronal complexidade em Drosophila

Este protocolo centra-se na análise quantitativa de complexidade arborização dendrítica neuronal (NDAC) em Drosophila, que pode ser usado para estudos da morfogênese dendrítica.

Dentritos são as projeções ramificadas de um neurônio, e morfologia dendrítica reflete organização sináptica durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Drosófila larval neuronal dendrítica arborização (da) é um modelo ideal para o estudo de morfogênese de dendrites neurais e função dos genes no desenvolvimento do sistema nervoso. Existem quatro classes de neurônios da. Classe IV é a mais complexa, com um padrão de ramificação que cobre quase toda a área da parede do corpo larval. Nós anteriormente têm caracterizado o efeito de silenciamento da Drosophila ortholog de SOX5 na classe de complexidade de arborização dendrítica neuronal de IV (NDAC) usando quatro parâmetros: o comprimento de dendrites, a área de superfície de cobertura dendrito, o número total de galhos e a estrutura de ramificação. Este protocolo apresenta o fluxo de trabalho de análise quantitativa NDAC, consistindo de dissecação larval, microscopia confocal e procedimentos de análise de imagem usando o software ImageJ. Mais introspecção da desenvolvimento neuronal e seus mecanismos subjacentes irá melhorar a compreensão da função neuronal e fornecem pistas sobre as causas fundamentais da neurológicas e transtornos do desenvolvimento neurológico.

Dendrites, que são as projeções ramificadas de um neurônio, cobrem o campo que engloba do neurônio sensorial e sináptica insumos de outros neurônios^1,2. Dendritos são um componente importante da formação de sinapse e desempenham um papel fundamental na integração de entradas synaptic, bem como a propagação do estímulo eletroquímico em um neurônio. Arborização dendrítica (da) é um processo pelo qual os neurônios formam novas árvores dendríticas e galhos para criar novas sinapses. O desenvolvimento e a morfologia da da, tais como a densidade de ramo e padrões de agrupamento, resultam de processos biológicos de várias etapas e estão altamente correlacionados com a função neuronal. O objetivo do presente protocolo é fornecer um método de análise quantitativa de complexidade de arborização dendritric neuronal em drosófila.

A complexidade dos dendritos determina os tipos sinápticos, conectividade e entradas de neurônios do parceiro. Padrões de ramificação e a densidade dos dendritos estão envolvidos no processamento dos sinais que convergem para o campo dendríticas^3,4. Dendrites têm a flexibilidade para o ajuste no desenvolvimento. Por exemplo, sinalização sináptica tem um efeito sobre a organização do dendrito no neurônio somatossensorial durante a fase de desenvolvimento e no sistema nervoso maduro⁵. O estabelecimento de conectividade neuronal baseia-se na morfogênese e maturação dos dendritos. Malformação de dendrites está associada com compromisso da função neuronal. Estudos têm mostrado que a anormalidade da morfogênese de neurônio da pode contribuir para as etiologias de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e doença de Gehrig / Esclerose lateral amiotrófica (ela)^6,7,8. Sinápticas alterações aparecem na fase inicial do AD, em concerto com o declínio e o comprometimento da função de neurônio^7,8. No entanto, os detalhes de como patologia dendrito contribui para a patogênese nestas doenças neurodegenerativas continua elusiva.

O desenvolvimento dos dendritos é regulado por genes que codificam uma complexa rede de reguladores, como a família de Wnt de proteínas^9,10, fatores de transcrição e ligantes de receptores de superfície de célula^11,12 . Neurônios da drosófila consistem em quatro classes (classe I, II, III, IV), de qual classe IV da neurônios têm os padrões mais complexos de ramificação e têm sido empregados como um poderoso sistema experimental para melhor compreensão morfogênese^{13, 14}. Durante a morfogênese cedo, superexpressão e/ou RNAi silenciamento de genes nos neurônios da classe IV resulta em alterações nos padrões de ramificação e dendrito poda¹³. É importante desenvolver um método prático de análise quantitativa da arborização dendrítica neuronal.

Anteriormente mostramos que silenciar da Drosophila ortholog de SOX5, Sox102F, levou a menores dendritos de neurônios da e complexidade reduzida em classe IV de neurônios da¹⁵. Aqui, apresentamos o procedimento de análise quantitativa para a complexidade de arborização dendrítica neuronal (NDAC) em Drosophila. Este protocolo, adaptado a partir da metodologia descrita anterior, fornece um método breve para ensaiar o desenvolvimento de neurônios sensoriais da. Ele ilustra a imagem robusta a rotulagem e o neurônio no terceiro ínstar larval parede corporal^16,17,18,19. É um protocolo valioso para pesquisadores que desejam investigar o NDAC as diferenças no desenvolvimento e na vivo.

1. preparação experimental

1. Preparem-se os seguintes reagentes: tampão fosfato de Dulbecco salino (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldeído (PFA), diluído em 4% antes do uso; base de elastômero de silicone e agente de cura; meio de montagem antidesgaste (por exemplo, prolongar a ouro); e unha polonês.
2. Preparar os seguintes equipamentos: microscópio de dissecação, dois afiada fórceps e um par de tesouras para microdissection, um número de pinos para microdissection, uma placa de Petri para fazer o prato de dissecação, corrediças do microscópio e lamelas, um microscópio confocal e um computador com software ImageJ Fiji instalado.

2. larvas coleção

1. Mate moscas UAS-Sox102F-RNAi com UAS-GFP, ppk-GAL4 ou W¹¹¹⁸ selvagem tipo moscas, respectivamente. Moscas de cultura em condições padrão a 25 ° C.
2. ~ 5-6 dias, recolher as terceiro ínstar larvas de RNAi-Sox102F-UAS / ppk-GAL4, UAS-GFP ou UAS-GFP e ppk-GAL4 / + controle cuidadosamente com a pinça para dissecação.

3. dissecação de larvas

Nota: Todos os procedimentos nesta seção são operados sob um microscópio microdissection. A ampliação é até os investigadores. Tente ajustar para o modo de exibição de visão ideal. Recomenda-se a ampliação de X ~ 4-6.

1. Coloque uma larva em um prato de dissecação feito de elastômero de silicone base e uma placa de Petri de cultura de tecidos.
2. Pin o gancho de boca de larva para permitir que o lado dorsal de face para cima, e em seguida coloque o rabo de larva. Coloque o lado dorsal no meio tanto quanto possível para expor a linha média, que será o marco de abertura-alto.
3. Adicione 200 µ l de PBS para a larva para manter a umidade do corpo.
4. Fazer um corte com uma tesoura ao longo da linha média dorsal entre os dois tracheas, de caudal para rostral. Faça um pequeno corte em cada um dos quatro cantos do corpo da larva.
5. Coloque um alfinete em cada um dos quatro cantos do corpo para que o corpo encontra-se plana.
6. Consertar a parede do corpo de larva em 4% PFA para 25 min à temperatura ambiente.
7. Lavar em PBST 5 min. repetir mais duas vezes.
8. Remova os pinos do tecido. Em seguida, transferir o tecido numa lâmina de vidro, cobrir com meio de montagem antidesgaste e montar com uma lamela. Ar seco por 1 h e selar as bordas com esmalte de unha.

4. processamento de imagens

Nota: Imagens foram tiradas usando um sistema de microscópio confocal invertido. O usuário pode fotografar a amostra usando um objectivo de X 20 (recomendado).

1. Capture imagens de Z-series. Abra a caixa de diálogo "Capturar Z-series" no software do microscópio confocal. Determine o intervalo para capturar as imagens da série Z.
   1. Clique no botão "Superior e inferior". Determinar a parte superior e inferior posição e os valores de entrada "inferior:" e "Top:" caixas. Defina o "passo" na caixa de diálogo "Capturar Z-series" como 0.5 µm. Clique no botão "Executar agora" para adquirir as imagens de Z-series.
2. Salve as imagens obtidas como arquivos *.tiff ou *.nd2.
3. Armazene os slides em um suporte escuro a 4 ° C, após a imagem.

5. dendrito avaliação

Nota: A proteína GFP foi co-overexpressed em UAS-GFP e ppk-GAL4 voa nos neurônios para fluorescência de GFP, análise de imagem. O comprimento, ramificação e estrutura dos neurônios no terceiro ínstar larvas foram quantificados. Parâmetros de análise incluem comprimento de dendrites (µm), área de superfície (µm²), número total de galhos e estrutura de ramificação (%). A Figura 1 mostra os parâmetros de análise em detalhe.

1. Comprimento de Dendrites
   Nota: O comprimento dos dendritos é a soma de todos os dendritos rotulado no plugin de traçador.
   1. Configurar e executar o software de²⁰ Fiji ImageJ (https://fiji.sc/). Em seguida, dividi imagens em canais separados, se existem vários canais de imagens.
      Nota: A imagem no presente protocolo só tem um canal de GFP.
   2. Executar "imagem | Pilhas | Projeto Z"para obter uma projeção de Z; uma nova janela aparecerá com o nome 'Z-projeção.' Clique em "intensidade máxima" para o tipo de projeção e organizar números entre fatia de arranque e paragem fatia dependendo em cima de preferências individuais. Clique em "Okey". Uma imagem de Z-projeção aparecerá apresentando a projeção dendrito claramente.
   3. Rastrear os neuritos.
      1. Selecione "Plugins | Segmentação | Simples Tracer neuritos"na janela para rastrear os dendritos. Encontrar o soma do neurônio e em seguida, clique em um ponto em um dendrito a partir do corpo celular e outro ponto na ponta deste dendrito.
         Nota: O programa irá se conectar os dois pontos com uma linha azul.
      2. Pressione "Y" na janela do plug-in, se o caminho está livre; o caminho do dendrito é rastreado até os pontos de extremidade do caminho selecionado nas imagens visíveis. Clique em "caminho completo" na mesma janela do plugin; o segmento está concluído (Figura 2).
         Nota: Alguns dendritos terminaram mais longe os pontos de partida, a via foi dividida em segmentos menores. Os segmentos foram combinados para fornecer um caminho completo para o tracer.
   4. Depois que um caminho é concluído, volte-se para um novo ponto de onde são os ramos. O novo caminho pode ser construído em; caixa de janela "Todos os caminhos" mostrará os valores de comprimento de todos os caminhos (Figura 3). Salve o arquivo de rastreamento e continuar com traços inacabados, como mostrado na Figura 2.
   5. Exportar os dados de comprimento dendrito clicando, "arquivo | Exportar como CVS"na janela 'Plugin'. Então resumir todos os comprimentos de caminho e exportar os dados para um software de análise/planilha de dados. (Figura 3).
2. Área de superfície dos neurônios da
   1. Selecione a ferramenta de desenho à mão livre na janela 'Fiji ImageJ'. Rastrear o caminho e em seguida, ligue os pontos de extremidade. No menu 'Analisar', selecione "Set medições | Área." Clique em "medida" do menu 'Analisar'. O resultado é exibido em uma nova caixa com o valor para a área selecionada (Figura 4). Copie-o para o software de análise de dados.
3. Total do número de filiais e estrutura de ramificação dos neurônios da
   1. Calcular o número total de filiais através da abertura de "Análise" e depois "Render | Analisar Skeletonized caminhos"na janela do plugin de rastreamento (Figura 5).
      Nota: A estrutura do caramanchão é a soma dos níveis dos ramos. O caminho foi definido entre o corpo da célula e as dicas do dendrito, e um caminho pode incluir vários ramos, tais como os mandris primários são os dendritos do neurônio corpo celular. Os mandris secundários são ramos do primário e assim por diante com os mandris de terciário, quaternário e quinário. A estrutura de ramificação dendrito é separada dependendo dos níveis dos ramos. Por exemplo, o principal % é o número de ramos, divididos pelo número total de ramificação e assim por diante.

Os dendritos dos neurônios da foram rotulados por co-superexpressão GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) no da soma neural e dendríticas mandris para fluorescência de GFP, análise de imagem. A morfologia dos dendritos do neurônio da foi fotografada por um microscópio confocal invertido (Figura 2).

Os dendritos dos neurônios da foram rastreados usando software ImageJ Fiji. O arquivo foi usado para estimar o comprimento de dendrito (Figura 3). Silenciamento de Sox102F nos neurônios da (N = 21) (UAS-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; UAS-GFP) levou a uma redução significativa do número de dendritos e um menor comprimento do ramo, com uma estrutura mais simples em comparação aos controles (N = 20) (UAS-GFP; ppk-GAL4 / +) o terceiro ínstar de larva (Figura 6). Especificamente, moscas em que Sox102F foi silenciado exibiram uma redução no tempo médio dendrito para 127 µm, em comparação com 249 µm em controles (p = 0,02), e tinha uma área de superfície menor média da árvore de 552.476 µm² em comparação com 847.571 µm² em controles (p = 0,04). Além disso, silenciamento de Sox102F resultou em um número menor de ramos e uma estrutura de ramificação mais simples dos mandris com ramos totais de 17 (17,3 ± 6,7), em comparação com 28 (28,4 ± 9,5) nos controles (p = 0,04). Estudante t-testes foram realizados para comparar as diferenças entre os grupos, e o nível de significância foi definido como 0,05.

Figura 1 : Esquemas de parâmetros de análise dendrito do neurônio da drosófila . Painel (A) é a imagem original de um neurônio da. (B) comprimento dendrito foi a média de todos os comprimentos de dendrito em todos os neurônios da medida. (C) a área de superfície do dendrito do neurônio da manualmente foi definida pela ferramenta mão livre ImageJ. (D) este esquema mostra como contar o número total de balcões e analisar a estrutura de ramificação de um neurônio da. 1: arbor primário. 2: eixo secundário. 3: arbor terciária. 4: arbor quaternário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Representante rastreamento dos dendritos de um neurônio da. Um neurônio da foi fotografado com um sistema de microscópio de fluorescência confocal. (A) o primeiro rastreamento foi criado com um ponto de partida do corpo celular e o ponto final de um dendrite usando a ferramenta de segmentação/plugin. A linha azul (seta branca) representa o caminho definido. Depois de clicar em "Sim" (seta vermelha), a linha muda cor de azul para vermelho. (B) clicando em "Terminar o caminho" irá aparecer o roxo (C). (A-C) Mostra o processo de rastreamento de um único dendrite; (D) imagem traçada a completa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Medição de rastreados caminhos. A imagem à esquerda mostra como medir os caminhos de rastreamento após a execução do "análise | Medir caminhos." Exportar os valores de comprimento de caminho para um arquivo de planilha e calcular a soma do comprimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Um exemplo de definição da área de superfície do dendrito manualmente. Foi obtida uma imagem definida usando a ferramenta mão livre no menu de janela do ImageJ (mostrado pela seta vermelha). Defina as medições, selecionando a área. Execute a função de "Medida" para obter a área mostrada na caixa vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Um exemplo de análise de ramificação. Execute "Analysis_Render | Analisar Skeletonized caminhos"na janela do plugin"Segmentação". Obtiveram-se os caminhos processados e seu número, selecionando "processar todos os caminhos | Obter Resumo". O caminho foi definido entre o corpo da célula e as dicas do dendrito, e um caminho pode incluir várias ramificações; por exemplo, os mandris principais eram os dendritos do neurônio corpo celular; Os mandris secundários foram ramos do primário e assim por diante com os mandris de terciário, quaternário e quinário. A estrutura do dendrito ramificação foi separada dependendo dos níveis dos ramos. Por exemplo, % primário foi o número de ramos, divididos pelo número total de ramificação e assim por diante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Resultados representativos de silenciamento de Sox102F nos neurônios da. Silenciamento de Sox102F nos neurônios da (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ppk-GAL4) levou a significativamente reduzido comprimento dendrito e menor ramificação com estrutura mais simples, o terceiro ínstar larva comparados aos controles. As diferenças entre moscas Sox102F-RNAi (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ppk-GAL4, N = 21) e controle (UAS-GFP; ppk-GAL4 / +, N = 20) moscas foram (A) dendrito comprimento (B) arbor área de superfície (C) número total de galhos e (D, E ) estrutura de ramificação dos neurónios da. Teste-T de Student foi realizado para a análise estatística. * indica significância estatística (p < 0,05). As barras de erro são média ± desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dendritos que inervam a epiderme são as regiões de entrada dos neurônios, e suas morfologias determinam como a informação é recebida e processada pelos neurônios individuais. Morfologia do dendrito de desenvolvimento reflete a modulação de gene da organização dendrito. Larval da drosófila neurônio do sistema nervoso periférico é um modelo importante para estudar o desenvolvimento dendrito por causa de: 1) a similaridade funcional com mamíferos^11,12; 2) quatro distinções de classe, com base no dendrito estrutura^11,12; e 3) os fatores genéticos que regulam a morfogênese. Neste protocolo, apresentamos o trabalho de preparação de larvas a análise de imagem de neurônios da drosófila . Os métodos descrevem os quatro parâmetros importantes para a análise de dendritos nos neurônios da detalhes, que são o comprimento de dendrites, a área de superfície, o número total de ramos e a estrutura de ramificação. O passo crítico era remover como muitos tecidos da parede do corpo da larva possível expor totalmente os neurônios da imagiologia e análises. Pode haver alguns ramos curtos cortados devido ao número limitado de imagens Z-projeção. Como esse método é a medição relativa de comprimento de dendrites, em comparação com os controles, um grande número de imagens para cada grupo de neurônios da deve ser tomado para aumentar as áreas de cobertura de imagens Z-projeção.

Neurônios da drosófila classe IV foram o foco de investigação relativo à dendrito arbor morfologia^15,21,22,23. Morfogênese de desenvolvimento arbor dendríticas pode ser interrompida por perda ou ganho de função do gene, demonstrando que o desenvolvimento de neurônio da é sensível a alterações genéticas²⁴. Para estudos genéticos, é importante analisar a morfologia com precisão a fim de compreender seu impacto sobre os neurônios da. Neurônios da classe IV são complexas, mas ainda acessível para alta qualidade de imagem, porque eles estão localizados logo abaixo a parede semi transparente do corpo e ramo, quase inteiramente em duas dimensões espaciais. A fluorescência de GFP dinâmica rotulada da neurônios (ppk-GAL4; UAS-GFP) fornecem um modelo facilmente visualizado para investigar o desenvolvimento neuronal. A direção da mudança da morfologia varia, mandris podem tornar-se overbranched ou simplificados. Aqui, nós Categorizado estas morfológicas muda por parâmetros quantitativas, por exemplo, o comprimento do dendrito, a área de superfície, o número total de ramos e a estrutura de ramificação dos neurónios da. Os resultados reflectem a resposta em Sox102F expressão regular desenvolvimento neuronal, como mostrado neste estudo.

Nosso protocolo foi usado para mostrar as mudanças morfológicas dos neurônios da classe IV em moscas em que a Drosophila ortholog de SOX5, Sox102F, foi silenciado, indicando um importante papel funcional de SOX5 no desenvolvimento de dendrito e morfogênese. As proteínas Wnt são uma família de glicoproteínas secretadas que têm sido implicados na regulação morphogeneis dendrito. Wnt2 e Wnt7b promovem da e complexidade neuronal^9,10. Na via Wnt canônica, essa ativação é seguida pela ativação da GSK3β, uma quinase serina-treonina, que por sua vez ativa a transcrição de β-catenina mediada^10,25. Encontramos anteriormente que silenciar de SOX5 em células SH-SY5Y de neuroblastoma resultou em uma repressão significativa da atividade de sinalização Wnt e regulada a expressão de vários genes Wnt, incluindo uma superexpressão de GSK3β ¹⁵. Aumento da expressão de GSK3β tem sido associado com as características de marca do anúncio, incluindo perda de memória, pragas de β-amiloide e hyperphosphorylation anormal de tau²⁶. Silenciamento de SOX5 aumentou a expressão de GSK3β, que poderia indicar uma ligação funcional entre SOX5 e GSK3β.

Os neurônios da classe IV tem os maioria dos dendritos altamente complexos de todos os neurônios sensoriais. Neste protocolo, nós desenvolvemos um método para analisar a complexidade da arbor e ramos para abstrair as propriedades de classe IV neurônios em Drosophila baseados em software e plugins disponíveis convencionalmente. Analisaram-se imagens que foram tiradas de um microscópio confocal, e a segmentação de plugin do tracer axônio simples fornecido uma ferramenta ideal para rastrear o dendrito ramos^27,28. Além disso, este método de quantificação permite a análise detalhada de complexidade dendrito apresentando as proporções dos vários níveis de ramificação do soma para o dendrito mais distante. Além disso, este método pode ser usado para analisar outras classes de neurônios da. Por exemplo, classe I da neurônios estender dendritos secundários a um lado da parede do corpo; classe II tem ramos bifurcating simetricamente; e neurônios da classe III tem mais complexidade de ramificação e picos. Em resumo, nós fornecemos um protocolo de imagem e análise de neurônios da classe IV para análises dendrito neuronal em Drosophila.

Os autores não têm nada para divulgar.

Gostaríamos de agradecer William A. Eimer para assistência técnica de imagem. Este trabalho foi financiado pelo fundo a cura a doença de Alzheimer [a R.E.T], o Instituto Nacional de saúde [R01AG014713 e R01MH60009 para R.E.T; R03AR063271 e R15EB019704 para A.L.] e a National Science Foundation [NSF1455613 para A.L.].