초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

이 프로토콜에서 초파리, 수지상 morphogenesis의 연구를 위해 사용 될 수 있는 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)의 정량 분석에 집중 한다.

모 수석 신경의 분기 예측 이며 수지상 형태학 반영 시 냅 스 조직 신경 시스템의 개발. 초파리 애벌레 신경 돌기 arborization (다) 공부 morphogenesis dendrites 신경 및 신경 시스템의 개발에 유전자 기능에 대 한 이상적인 모델입니다. Da 뉴런의 4 개의 클래스가 있습니다. 클래스 IV는 거의 전체 면적 애벌레 몸 벽의 분기 패턴으로 가장 복잡 한입니다. 우리는 이전 클래스 IV 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC) 4 개의 매개 변수를 사용 하 여 SOX5 의 초파리 ortholog 침묵의 효과 특징: dendrites의 길이, 모 수석 검사의 표면적은 지점과 분기 구조의 총 수입니다. 이 프로토콜의 NDAC 정량 분석, 애벌레 해 부, confocal 현미경 검사 법 및 이미지 분석 절차 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 구성 된 워크플로 제공 합니다. 다 신경 개발 및 그것의 근본적인 메커니즘에 더 통찰력 신경 기능에 대 한 이해를 개선 하 고 신경의 근본적인 원인에 대 한 단서를 제공 및 neurodevelopmental 장애.

모 수석 신경의 분기 예상치는 다른 뉴런^1,2에서 신경의 감각 및 시 냅 시스 입력을 포함 하는 필드를 커버. Dendrites 시 냅 스 형성의 중요 한 요소 이며, 시 냅 시스 입력의 통합 신경에 전기 자극을 전파에 중요 한 역할. 수지상 arborization (다)는 신경 형성 새로운 수지상 나무와 가지를 새로운 시 냅 스를 만드는 과정 이다. 개발 및 다 지점 밀도 및 그룹화 패턴 등의 형태 다단계 생물학 과정에서 발생 하 고 매우 신경 기능에 상관. 이 프로토콜의 목표 arborization 복잡 한 신경 dendritric의 정량 분석에 대 한 메서드를 제공 하는 초파리.

모 수석의 복잡 시 냅 스 종류, 연결 및 파트너 뉴런에서 입력을 결정합니다. 분기 패턴 및 모 수석의 밀도 수지상 필드^3,4에 수렴 하는 신호 처리에서 포함 된다. 모 수석 개발 조정에 대 한 유연성 있습니다. 예를 들어, 발달 단계 somatosensory 신경 및 성숙한 신 경계⁵모 수석 조직에 영향이 있다 시 냅 스 신호. 신경 연결의 설립 morphogenesis 및 모 수석의 성숙에 의존합니다. 모 수석의 기형 장애 신경 기능으로 연결 됩니다. 연구 다 신경 morphogenesis의 이상은 여러 신경 퇴행 성 질병, Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 게 릭 병의 etiologies에 기여할 수 있습니다 / 루 경화 증 (ALS)^6,,78. 시 냅 스 변경 감소와 장애 신경 기능^7,8의 콘서트에서 광고의 초기 단계에 나타납니다. 그러나, 모 수석 병리학이 신경 퇴행 성 질환 병 인에 기여 하는 방법의 구체적인 애매 남아 있습니다.

모 수석의 개발은 레 귤 레이 터, 단백질^9,10, 녹음 방송 요인과 세포 표면 수용 체^{11,12에 ligands의 Wnt 제품군 등의 복잡 한 네트워크 부호화 하는 유전자에 의해 규제} . 4 클래스 (클래스 I, II III, IV), 클래스 4의 다 신경 가장 복잡 한 분기 패턴을가지고 더 나은 이해 morphogenesis^{13, 강력한 실험 시스템으로 고용 되어 이루어져 초파리 다 신경 14}. 초기 morphogenesis 동안 overexpression 및 RNAi 클래스 IV 다 신경 세포에서 유전자의 입을 분기 패턴 및 모 수석 정리¹³변경 될. 그것은 신경 돌기 arborization의 정량 분석을 위한 실용적인 방법을 개발 해야 합니다.

우리는 이전을 SOX5의 초파리 ortholog의 입을, Sox102F, 주도 다 신경 및 클래스 IV 다 신경¹⁵에서 감소 된 복잡성의 짧은 dendrites 나타났습니다. 여기, 우리는 초파리에서 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)에 대 한 정량 분석의 절차를 제시. 이전 설명한 방법론에서 적응이 프로토콜 다 감각 신경의 개발 시험 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 그것은 강력한 이미지 라벨 및 세 번째 탈피 애벌레 몸 벽^16,17,,1819에 다 신경 보여 줍니다. 그것은 NDAC 및 발달 차이 vivo에서조사 하고자 하는 연구자에 대 한 귀중 한 프로토콜입니다.

1. 실험 준비

1. 다음 시 약 준비: Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS); 트라이 톤 X-100. 0.2 %PBST (PBS + 0.2% 트라이 톤 X-100); 32 %paraformaldehyde (PFA), 사용; 하기 전에 4%로 희석 실리콘 고무 베이스와 치료 대리인; antifade 장착 매체 (예를 들어, 연장 금); 그리고 손톱 폴란드어입니다.
2. 다음 장비 준비: 해 부 현미경, 2 개의 날카로운 집게와가 위 서, 기정, 해 부 접시, 현미경 슬라이드 및 coverslips, confocal 현미경을 만들기 위한 배양 접시 핀의 수에 대 한 고 피지 ImageJ 소프트웨어가 설치 된 컴퓨터.

2. 애벌레 컬렉션

1. 각각 UAS GFP, ppk 권총 GAL4 또는 W¹¹¹⁸ 야생 타입 파리, UAS-Sox102F-RNAi 파리 친구. 25 ° c.에 표준 조건에서 문화 파리
2. 5 ~ 6 일, UAS-Sox102F-RNAi의 세 번째 탈피 애벌레를 수집 / ppk 권총 GAL4, UAS GFP 또는 UAS-GFP와 ppk 권총 GAL4 / + 집게 해 부에 대 한 신중 하 게 제어.

3입니다. 애벌레의 해 부

참고:이 섹션의 모든 절차 서 현미경으로 운영 한다. 배율을 조사입니다. 최적의 광경 보기를 조정 하려고 합니다. 4 ~ 6 배 확대 것이 좋습니다.

1. 실리콘 엘라 스토 머로 만든 기본 해 부 접시와 조직 문화 배양 접시에 유 충을 놓습니다.
2. 등 면, 얼굴을 수 있도록 유 충 입 고리를 고정 하 고 유 충의 꼬리를 핀 다음. 장소 가능한 노출 오픈 업 표시 됩니다 중간 중간에 등 쪽 쪽.
3. 몸에 수 분을 유지 하기 위해 유 충을 PBS의 200 µ L를 추가 합니다.
4. Rostral에 꼬리에서 2 개의 tracheas 사이 등 쪽 정중 선 따라가 위로 잘라 만들. 각 유 충 시체의 네 모퉁이에 작은 상처를 확인 하십시오.
5. 그래서 본문 거짓말 플랫 핀 각 본문의 네 모퉁이에 배치 합니다.
6. 4%에서 유 충 몸 벽을 수정 PFA 실 온에서 25 분.
7. 5 분 두 번 더 반복에 대 한 PBST에서 씻어.
8. 조직에서 핀을 제거 합니다. 조직 전송 유리 슬라이드에 antifade 설치 매체와 함께 커버 하 고 커버 슬립을 탑재. 1 h 동안 건조 공기와 손톱 폴란드어로 가장자리를 밀봉.

4. 영상 처리

참고: 이미지를 거꾸로 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 찍은. 사용자는 20 X 목표 (권장)를 사용 하 여 샘플을 사진 수 있습니다.

1. 부터 Z-시리즈 이미지를 캡처하십시오. 공초점 현미경 소프트웨어에서 "캡처부터 Z-시리즈" 대화 상자를 엽니다. Z 시리즈 이미지 캡처에 대 한 범위를 결정 합니다.
   1. "상단 및 하단" 버튼을 클릭 합니다. 위쪽 및 아래쪽 위치와 입력 값을 확인 "아래:" 및 "위쪽:" 상자. 0.5 µ m로 "부터 Z-시리즈 캡처" 대화 상자에서 "단계"를 설정 합니다. 다음부터 Z-시리즈 이미지 "지금 실행" 버튼을 클릭 합니다.
2. *.Tiff 또는 *.nd2 파일으로 얻은 이미지를 저장 합니다.
3. 영상 후 4 ° C에서 어두운 홀더에 슬라이드를 저장 합니다.

5. 모 수석 평가

참고: GFP 단백질 UAS GFP에 공동 overexpressed 이었고 ppk 권총 GAL4 GFP 형광 이미징 분석에 대 한 da 뉴런에 파리. 길이, 분기, 및 세 번째 탈피 애벌레에 da 뉴런의 구조를 측정할 수 있었다. 분석 매개 변수 길이 dendrites (µ m), 면적 (µ m²), 분기, 및 분기 구조 (%)의 총 수를 포함합니다. 그림 1 에서는 자세히 분석 매개 변수를 보여 줍니다.

1. 모 수석의 길이
   참고: dendrites의 길이 추적 플러그인에 표시 된 모든 모 수석의 합계입니다.
   1. 설치 하 고 피지 ImageJ (https://fiji.sc/)²⁰ 소프트웨어를 실행 합니다. 다음 분할 이미지 별도 채널, 여러 채널 이미지의 경우.
      참고:이 프로토콜에 이미지 GFP의 한 채널에만 있다.
   2. 실행 "이미지 | 스택 | Z 프로젝트"Z 프로젝션;를 새 창 이름 ' Z 프로젝션 '으로 나타납니다. "최대 강도" 투영 유형을 클릭 하 고 시작 조각과 중지 슬라이스 따라 사이의 구성 개별 환경 설정에 따라. "확인"을 클릭 합니다 Z-프로젝션 이미지를 명확 하 게 제시 하는 모 수석 투영 표시 됩니다.
   3. neurites 추적.
      1. 선택 "플러그인 | 세그먼트화 | 간단한 Neurites 추적 프로그램 "창에는 dendrites 추적. 신경 소마를 찾아서 다음에 모 수석 세포 몸, 그리고이 모 수석의 끝에 또 다른 지점에서 출발 한 시점을 클릭 합니다.
         참고: 프로그램 두 점 파란색 선으로 연결 됩니다.
      2. 경로가 분명; 경우 플러그인 창에서 "Y"를 누릅니다 모 수석 경로 표시 이미지에서 선택 된 경로의 끝점까지 추적 됩니다. 같은 플러그인 창;에 "전체 경로"를 클릭 세그먼트가 완료 되 면 (그림 2).
         참고: 일부 dendrites 통로 더 작은 세그먼트로 분할 되었다 시작 포인트에서 끝났다. 세그먼트는 추적기에 대 한 전체 경로 제공 하기 위해 결합 했다.
   4. 경로 완료 한 후 가지는 새로운 위치로 다시 이동 합니다. 새로운 경로; 건축 될 수 있다 "모든 경로" 창 상자 모든 경로 (그림 3)의 길이 값을 표시 됩니다. 추적 파일을 저장 하 고 그림 2와 같이 미완성된 추적 계속.
   5. 클릭 하 여, 모 수석 길이 데이터를 내보내기 "파일 | 로 수출 *.cvs "'플러그인' 창에서. 다음 모든 경로 길이, 요약 하 고 데이터 분석/스프레드시트 소프트웨어를 데이터를 내보냅니다. (그림 3)입니다.
2. 다 신경 세포의 표면적
   1. ' 피지 ImageJ' 창에서 프리 핸드 그리기 도구를 선택 합니다. 경로 추적 하 고 끝점을 연결 합니다. '분석' 메뉴에서 선택 "설정된 측정 | 지역입니다. " '분석' 메뉴에서 "측정"을 클릭 합니다. 결과 (그림 4) 선정 지역에 대 한 값으로 새로운 상자에 나타납니다. 데이터 분석 소프트웨어에 그것을 복사 합니다.
3. 총 수의 지점과 다 신경의 분기 구조
   1. "분석"을 열어 분기의 총 수를 계산 그리고 "렌더링 | 분석 Skeletonized 경로 "플러그인 창에서 (그림 5)를 추적 합니다.
      참고:는 식 목의 구조 분 지의 레벨의 합계입니다. 경로 셀 바디와 모 수석 팁 사이의 정의 된 그리고 주 버는 dendrites 신경 세포 체에서와 같은 하나의 경로 포함할 수 있습니다. 보조 아 버 등 3 차, 4 급, 그리고 오진법 아 버와 기본에서 있습니다. 모 수석 분기의 구조 분 지의 수준에 따라 구분 됩니다. 예를 들어, 기본 % 분기, 분기의 총 수로 나누어 고 수입니다.

Da 뉴런의 dendrites 했다 공동 overexpressing GFP (UAS GFP, ppk 권총 GAL4) 다 신경 소마에 GFP 형광 이미징 분석에 대 한 수지상 아 버에 표시 됩니다. 다 신경 dendrites의 형태는 거꾸로 confocal 현미경 (그림 2)에 의해 몇 군데.

Da 뉴런의 dendrites 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 추적 했다. 파일 모 수석 길이 (그림 3) 추정에 사용 되었다. 다 신경 (N = 21) (UAS-Sox102F-RNAi/ppk 권총-GAL4;에서 Sox102F 의 입을 UAS-GFP) 컨트롤에 비해 단순한 구조와 모 수석 및 짧은 분기 길이 수에 있는 뜻깊은 감소를 주도 (N = 20) (UAS GFP; ppk 권총 GAL4 / +) 세 번째 탈피 유 충 (그림 6)에서. 특히, Sox102F 침묵 했다 파리 전시 평균 모 수석 컨트롤에서 249 µ m에 비해 127 µ m 길이에서 감소 (p = 0.02), 552,476 µ m² 의 작은 평균 아 버 표면적 847,571 µ m² 에 비교 했다 컨트롤 (p = 0.04). 또한, Sox102F 의 입을 결과 분기의 더 작은 수와 총 17 (17.3 ± 6.7), 28 (28.4 ± 9.5) 컨트롤에 비해의 아 버의 간단한 분기 구조 (p = 0.04). 그룹 간의 차이 비교 학생 t-테스트를 수행한 그리고 의미 수준 0.05로 설정 했다.

그림 1 : 초파리 다 신경의 모 수석 분석 매개 변수의 설계도. 패널 (A) da 뉴런의 원래 이미지입니다. (B) 모 수석 길이 모든 측정된 다 신경에 있는 모든 모 수석 길이의 평균 했다. (C) 다 신경 모 수석의 표면적은 수동으로 ImageJ 자유형 도구에 의해 정의 됩니다. (D)이 이 회로도 분기의 총 수를 계산 하 고 다 신경의 분기 구조를 분석 하는 방법을 보여 줍니다. 1: 주 아 버. 2: 보조 아 버. 3: 3 차 아 버. 4: 제 사기 아 버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : Da 뉴런의 dendrites의 대표적인 추적. 다 신경은 공초점 형광 현미경 시스템으로 몇 군데. (A) 첫 번째 추적 플러그인/분할 도구를 사용 하 여 셀 바디와는 모 수석의 끝점에서 시작점을 창조 되었다. 블루 라인 (흰색 화살표) 정의 된 경로 나타냅니다. 클릭 "예" (빨간색 화살표), 후 선 빨강 파랑에서 컬러를 변경 합니다. (B) "완료 경로"에 클릭 하면 보라색 (C)표시 됩니다. (A-C) 단 하나 모 수석;을 추적 하는 과정을 보여 줍니다. (D)는 완전 한 추적 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 추적 경로 측정. 왼쪽에 이미지 실행 후 추적 경로 측정 하는 방법을 보여 줍니다 있는 "분석 | 측정 경로입니다. " 스프레드시트 파일에 경로 길이 값을 내보내고 길이의 합계를 계산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 모 수석 표면 영역을 수동으로 정의의 예. 정의 된 이미지는 (빨간 화살표 표시) ImageJ 창 메뉴에서 자유형 도구를 사용 하 여 얻은 했다. 영역을 선택 하 여 측정을 설정 합니다. 빨간 상자에 표시 된 영역을 얻을 "측정" 기능을 실행 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 분기의 분석의 예. 실행 "Analysis_Render | "분할" 플러그인 창에서 분석 Skeletonized 경로 ". 렌더링 된 경로 그들의 수를 선택 하 여 가져온 "모든 경로 렌더링 | 요약 얻을. " 경로 셀 바디와 모 수석 팁 사이의 정의 된 하 고 하나의 경로; 여러 분기를 포함할 수 있습니다. 예를 들어 기본 버는 했다 모 수석 신경 세포 몸에서; 보조 아 버 등 3 차, 4 급, 그리고 오진법 아 버와 기본에서 분기 했다. 모 수석 분기의 구조 분 지의 수준에 따라 분리 되었다. 예를 들어, 기본 % 분기, 분기의 총 수로 나누어 고 수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6 : 다 신경에 있는 Sox102F 의 침묵의 대표적인 결과. 모 수석 길이 감소 크게 이끌어 다 신경 (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP, ppk 권총 GAL4)에 있는 Sox102F 의 입을 하 고 컨트롤에 비해 세 번째 탈피 유 충에서 간단한 구조와 분기 짧은. Sox102F-RNAi 파리의 차이점 (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ppk 권총-GAL4, N = 21) 및 제어 (UAS-GFP; ppk 권총-GAL4 / +, N = 20) 파리 분 지, 및 (D, E의 (A) 모 수석 길이 (B) 아 버 표면 영역 (C) 총 수에 있었다 ) 다 신경의 분기 구조. 학생 T-검정 perfomed 통계 분석 했다. 통계적 의미를 나타냅니다 (p < 0.05). 오차 막대는 평균 ± 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Dendrites 표 피를 자극 하는 뉴런의 입력된 영역 하 고 그들의 형태학 정보 접수 및 개별 뉴런에 의해 처리 방법을 결정 합니다. 개발 모 수석 형태 모 수석 조직의 유전자 변조를 반영합니다. 초파리 애벌레 다 신경의 말 초 신 경계는 모 수석 개발 때문에 공부에 대 한 중요 한 모델: 1) 포유류^11,12; 기능적 유사성 모 수석 구조^11,12;에 따라 2) 4 개의 클래스 구분 그리고 3) 규제 morphogenesis 유전 요인. 이 프로토콜에서 선물이 초파리 다 뉴런의 이미지 분석에 애벌레 준비에서 워크플로. 메서드는 dendrites, 표면적, 분 지의 총 숫자와 분기 구조 길이 세부 사항에, da 뉴런의 dendrites을 분석 하기 위한 4 개의 중요 한 매개 변수를 설명 합니다. 완벽 하 게 다 신경 세포 이미징 및 분석에 대 한 노출 가능한 유 충 체 벽에서 많은 조직을 제거 하는 중요 한 단계가 이었다. Z-프로젝션 이미지의 한정 된 수 때문에 잘라 몇 가지 짧은 분기를 있을 수 있습니다. 이 메서드는 컨트롤에 비해 dendrites 길이의 상대 측정, Z-프로젝션 이미지의 적용 영역을 증가 da 뉴런의 각 그룹에 대 한 이미지의 큰 숫자를 취해야 한다.

Drosophila 클래스 IV 다 신경 모 수석 아 버 형태학^15,21,,2223에 관한 연구의 초점이 되었습니다. Morphogenesis 수지상 아 버 개발의 손실 또는 다 신경 발달은 유전 변경²⁴에 민감한 보여주는 유전자 기능의 이득에 의해 중단 될 수 있습니다. 유전자 연구에 대 한 그것은 정확 하 게 다 신경 세포에 미치는 영향을 이해 하기 위하여 형태를 분석 하는 것이 중요입니다. 클래스 4 다 신경 복잡 하지만 여전히 높은-품질 이미징 반투명 체 벽 및 2 차원 공간에 거의 전적으로 지점 바로 아래에 위치 하기 때문에 액세스할 수 있습니다. 동적 GFP 형광 표시 다 신경 (ppk 권총-GAL4; UAS-GFP) 신경 개발 조사를 쉽게 시각화 된 모델을 제공. 형태 변경의 방향 변화, arbors overbranched 또는 간단 하 게 될 수 있습니다. 여기, 우리는 이러한 형태학 분류 quantitive 매개 변수, 예를 들면 모 수석 길이, 표면적, 분 지의 총 숫자와 da 뉴런의 분기 구조 변경. 결과이 연구와 같이 Sox102F 식 신경 개발 규제에 대 한 응답을 반영 합니다.

우리의 프로토콜 파리에서 클래스 IV 다 신경 세포의 형태학 적 변화를 표시 하는 데 사용 했다에 있는 SOX5, Sox102F 의 초파리 ortholog 했다 침묵, 모 수석 개발에 SOX5 의 중요 한 기능 역할을 나타내는 그리고 morphogenesis입니다. Wnt 단백질 모 수석 morphogeneis 조절에 연루 되어 분 비 glycoproteins의 가족입니다. Wnt2 및 Wnt7b 홍보 다 고 신경 복잡성^9,10. Wnt 정식 경로에서이 활성화 GSK3β, 떠들고 트레오닌 키 니 아 제, β-catenin 중재 전사^10,25차례 차례로 활성화의 활성화에 선행 된다. 우리는 이전 발견 인간의 SH SY5Y 신경 세포에서 SOX5 의 입을 결과 Wnt 신호 활동의 중요 한 억압에 GSK3β의 overexpression를 포함 하 여 Wnt 유전자의 수의 표현 규제 ¹⁵. GSK3β의 증가 식 광고, 기억 상실, 타우²⁶의 비정상적인 hyperphosphorylation, β 아 밀 로이드 재앙 등의 전형적인 특성을 가진 연결 되었습니다. SOX5 의 입을 증가 GSK3β 식, SOX5 및 GSK3β 사이 기능적인 연결을 나타낼 수 있습니다.

클래스 4 다 신경 세포는 모든 감각 신경 세포의 대부분 매우 복잡 한 모 수석. 이 프로토콜에서 아 버 및 클래스 IV 다 평범 하 게 사용 가능한 플러그인 소프트웨어 기반으로 초파리 에서 신경 세포의 속성을 추상화 하는 분기의 복잡성을 분석 하는 방법을 개발 했습니다. Confocal 현미경에서 찍은 이미지 분석 되었다, 그리고 간단한 neurite 추적 프로그램의 플러그인 세그먼트 제공 하는 이상적인 도구를 추적 하는 모 수석 분기^27,28. 또한,이 정량화 방법은 더 먼 모 수석에 있는 소마에서 분기의 다양 한 레벨의 비율을 제시 하 여 모 수석 복잡성의 상세한 분석에 대 한 수 있습니다. 또한,이 방법은 분석 다 신경의 다른 클래스를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 클래스 I을 다 신경; 체 벽의 1 개의 측에 보조 dendrites을 연장 클래스 II는 bifurcating 대칭; 그리고 클래스 III 다 뉴런 분기 및 스파이크의 복잡성이 더. 요약 하자면, 우리는 제공 이미징의 프로토콜 분석 클래스 IV da 뉴런의 초파리에서 신경 모 수석 분석에 대 한.

저자는 공개 없다.

우리는 윌리엄 A. Eimer 이미징 기술 지원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 [하 R.E.T], 치료 질병의 기금에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 건강 [R01AG014713 및 R01MH60009 R.E.T;에 R03AR063271 및 R15EB019704 앨 러 배 마에], 그리고 국립 과학 재단 [앨 러 배 마에 NSF1455613].