Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

Questo protocollo è centrato sull'analisi quantitativa della complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila, che può essere utilizzato per gli studi della morfogenesi dendritica.

Dendriti sono le proiezioni ramificate di un neurone e morfologia dentritica riflette l'organizzazione sinaptica durante lo sviluppo del sistema nervoso. Drosophila larvale arborization dentritico neuronale (da) è un modello ideale per studiare la morfogenesi di dendriti neurali e funzione del gene nello sviluppo del sistema nervoso. Ci sono quattro classi di neuroni da. Classe IV è la più complessa con un modello di ramificazione che copre quasi l'intera superficie della parete del corpo larvale. Precedentemente abbiamo caratterizzato l'effetto di mettere a tacere l'ortologo di Drosophila di SOX5 classe di complessità di un neurone arborization dentritico IV (NDAC) utilizzando quattro parametri: la lunghezza dei dendriti, l'area della superficie di copertura dendrite, il numero totale di rami e la struttura ad albero. Questo protocollo presenta il flusso di lavoro di analisi quantitativa NDAC, composto da dissezione larvale, microscopia confocale e procedure di analisi di immagine utilizzando il software ImageJ. Ulteriore comprensione da sviluppo neuronale e dei suoi meccanismi sottostanti migliorerà la comprensione della funzione di un neurone e fornire indizi circa le cause fondamentali di neurologici e disturbi dello sviluppo neurologico.

Dendriti, che sono le proiezioni ramificate di un neurone, coprono il settore che comprende ingressi di neurone sensoriale sinaptica da altri neuroni^1,2. Dendriti sono una componente importante della formazione della sinapsi e svolgono un ruolo critico nella integrazione sinaptici ingressi, così come la stimolazione elettrochimica in un neurone di moltiplicazione. Arborization dentritico (da) è un processo mediante il quale i neuroni formano nuovi alberi dendritiche e rami per creare nuove sinapsi. Lo sviluppo e la morfologia da, come la densità di ramo e modelli di raggruppamento, risultato di processi biologici multi-step e sono altamente correlati alla funzione di un neurone. L'obiettivo del presente protocollo è fornire un metodo per l'analisi quantitativa di complessità arborization neuronale dendritric in Drosophila.

La complessità dei dendrites determina i tipi di sinaptici, connettività e gli input dai neuroni di partner. Modelli di ramificazione e la densità dei dendriti sono coinvolti nell'elaborazione dei segnali che convergono sul campo dendritiche^3,4. Dendriti hanno la flessibilità per la regolazione in fase di sviluppo. Per esempio, segnalazione sinaptica ha un effetto sull'organizzazione di dendrite nel neurone somatosensory durante la fase di sviluppo e nel sistema nervoso maturo⁵. L'istituzione di un neurone connettività si basa sulla morfogenesi e la maturazione dei dendrites. Malformazione dei dendriti è associato con alterata funzione di un neurone. Gli studi hanno indicato che l'anomalia della morfogenesi del neurone da potrebbe contribuire alle eziologie multiple malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), e morbo di Gehrig / Sclerosi laterale amiotrofica (ALS)^6,7,8. Le alterazioni sinaptiche appaiono nella fase iniziale dell'annuncio, in concerto con il declino ed il danno del neurone funzione^7,8. Tuttavia, le specifiche di come patologia dendrite contribuisce alla patogenesi di queste malattie neurodegenerative resta sfuggente.

Lo sviluppo dei dendriti è regolato da geni che codificano una complessa rete di autorità di regolamentazione, come la famiglia di Wnt di proteine^9,10, fattori di trascrizione e ligandi su cellule recettori di superficie^11,12 . Neuroni da Drosophila sono costituiti da quattro classi (classe I, II, III, IV), del quale classe IV da neuroni sono i più complessi modelli di ramificazioni e sono stati impiegati come un potente sistema sperimentale per migliore comprensione morfogenesi^{13, 14}. Durante la morfogenesi precoce, overespressione o RNAi silenziamento di geni in neuroni di classe IV da provocare i cambiamenti nei modelli di ramificazione e dendrite potatura¹³. È importante sviluppare un metodo pratico per l'analisi quantitativa del arborization dentritico neuronale.

Precedentemente abbiamo indicato che il silenziamento dell'ortologo di Drosophila di SOX5, Sox102F, ha portato alla più brevi dendriti dei neuroni da e ridurre la complessità in classe IV da neuroni¹⁵. Qui, presentiamo la procedura di analisi quantitativa per la complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila. Questo protocollo, adattato dalla precedente metodologia descritta, fornisce un metodo breve per analizzare lo sviluppo dei neuroni sensoriali da. Illustra l'etichettatura immagine robusta e il neurone nel terzo instar larvale corpo muro^16,17,18,19. È un protocollo prezioso per i ricercatori che desiderano studiare la NDAC e differenze inerenti allo sviluppo in vivo.

1. preparazione sperimentale

1. Preparare i seguenti reagenti: tampone fosfato di Dulbecco (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldeide (PFA), diluita in 4% prima dell'uso; base di elastomero di silicone e dell'agente indurente; mezzo di montaggio Antifade (ad es., prolungare oro); e smalto per unghie.
2. Preparare la seguente attrezzatura: microscopio di dissezione, due taglienti forcipe e un paio di forbici per microdissezione, un numero di pin per microdissezione, una capsula di Petri per fare il piatto di dissezione, vetrini da microscopio e coprioggetto, un microscopio confocale e un computer con installato il software ImageJ Fiji.

2. larve collezione

1. Compagno UAS-Sox102F-RNAi mosche con UAS-GFP, ppk-GAL4 o W¹¹¹⁸ selvaggio tipo mosche, rispettivamente. Mosche di cultura in condizioni standard a 25 ° C.
2. ~ 5-6 giorni, raccogliere le larve instar terza dell'UAS-Sox102F-RNAi / ppk-GAL4, UAS-GFP o UAS-GFP e ppk-GAL4 / + controllo attentamente con pinze per dissezione.

3. dissezione delle larve

Nota: Tutte le procedure in questa sezione sono funzionate sotto un microscopio di microdissection. L'ingrandimento è fino agli investigatori. Provare a regolare la visualizzazione ottimale vista. ~ 4-6 ingrandimenti sono raccomandato.

1. Posto una larva su un piatto di dissezione realizzata in elastomero di silicone base e una cultura di tessuto di Petri.
2. Appuntare il gancio di bocca della larva per consentire il lato dorsale a faccia in su, e poi pin la coda della larva. Posizionare il lato dorsale in mezzo il più possibile per esporre la linea mediana, che sarà il marcatore di aprirsi.
3. Aggiungere 200 µ l di PBS alla larva di mantenere l'umidità del corpo.
4. Fare un taglio con un paio di forbici lungo la linea mediana dorsale tra la due trachee, da caudale al rostrale. Fare un piccolo taglio in ciascuno dei quattro angoli del corpo della larva.
5. Mettete un perno a ciascuno dei quattro angoli del corpo, così il corpo giace piatto.
6. Difficoltà la parete del corpo della larva in 4% PFA per 25 min a temperatura ambiente.
7. Lavare in PBST per 5 min, ripetere altre due volte.
8. Rimuovere i perni dal tessuto. Quindi trasferire il tessuto su una lastra di vetro, coprire con mezzo di montaggio antifade e montare con un vetrino coprioggetto. Aria secca per 1 h e sigillare i bordi con smalto per unghie.

4. elaborazione di imaging

Nota: Le immagini sono state scattate utilizzando un sistema di microscopio confocale rovesciato. L'utente può fotografare l'esempio utilizzando un obiettivo X 20 (consigliato).

1. Catturare immagini di serie Z. Aprire la finestra di dialogo "Capture serie Z" nel software microscopio confocale. Determinare l'intervallo per catturare le immagini di serie Z.
   1. Fare clic sul pulsante "Top and Bottom". Determinare la parte superiore e inferiore di posizione e i valori di input "fondo:" e "Top:" caselle. Impostare il "passaggio" nella finestra di dialogo "Catturare serie Z" come 0,5 µm. Fare clic sul pulsante "Esegui ora" per acquisire le immagini di serie Z.
2. Salvare le immagini ottenute come file TIFF o *.nd2.
3. Riporre le diapositive in un buio a 4 ° C dopo formazione immagine.

5. dendrite valutazione

Nota: La proteina GFP è stato co-sovraespresso in UAS-GFP e ppk-GAL4 vola nei neuroni da per analisi di imaging di fluorescenza di GFP. La lunghezza, ramificazione e la struttura dei neuroni da nelle larve instar terzo sono stati quantificati. Parametri di analisi includono la lunghezza dei dendriti (µm), superficie (µm²), numero totale di rami e la struttura ad albero (%). La figura 1 Mostra i parametri di analisi in dettaglio.

1. Lunghezza dei dendriti
   Nota: La lunghezza dei dendriti è la somma di tutti i dendriti etichettati nel plugin di tracciante.
   1. Configurazione ed eseguire software²⁰ ImageJ Fiji (https://fiji.sc/). Quindi dividere le immagini in canali separati, se esistono diversi canali delle immagini.
      Nota: L'immagine in questo protocollo ha solo un canale di GFP.
   2. Eseguire "immagine | Stack | Progetto Z"per ottenere una proiezione di Z; una nuova finestra apparirà con il nome 'Z-proiezione.' Fare clic su "intensità massima" per tipo di proiezione e organizzare i numeri tra fetta di start e stop a seconda fetta su preferenze individuali. Fare clic su "OK". Verrà visualizzata un'immagine di Z-proiezione che chiaramente presenta la proiezione di dendrite.
   3. Tracciare i neurites.
      1. Selezionare "plugin | Segmentazione | Semplice Neurites Tracer"nella finestra di rintracciare i dendrites. Trovare il soma del neurone e quindi fare clic su un punto a un dendrite a partire dal corpo cellulare e un altro punto all'estremità di questo dendrite.
         Nota: Il programma si collegherà i due punti con una linea blu.
      2. Premere "Y" nella finestra del plug-in, se il percorso è chiaro; fino a quando i punti finali del tracciato selezionato nelle immagini visibili è tracciato il percorso di dendrite. Fare clic su "percorso completo" sulla finestra del plugin stesso; il segmento è completato (Figura 2).
         Nota: Alcuni dendriti si è conclusa più lontano i punti di partenza, in cui il percorso è stato diviso in segmenti più piccoli. I segmenti sono stati combinati per fornire un percorso completo per il tracciante.
   4. Al termine di un percorso, tornare a un nuovo punto dove i rami sono. Il nuovo percorso può essere costruito su; la casella di finestra di "Tutti i percorsi" verranno visualizzati i valori di lunghezza di tutti i percorsi (Figura 3). Salvare il file di traccia e continuare con tracce incompiute, come mostrato nella Figura 2.
   5. Esportare i dati di lunghezza di dendrite cliccando, "File | Esporta come *.cvs"nella finestra 'Plugin'. Poi riassumere tutte le lunghezze di percorso ed esportare i dati ad un software di analisi/foglio di calcolo di dati. (Figura 3).
2. Superficie dei neuroni da
   1. Selezionare lo strumento di disegno a mano libera nella finestra 'Fiji ImageJ'. Tracciare il percorso e quindi collegare l'endpoint. Dal menu 'Analizza', selezionare "Set misure | Area". Fare clic su "misura" dal menu 'Analizza'. Il risultato viene visualizzato in una nuova finestra con il valore per l'area selezionata (Figura 4). Copiare il software di analisi dati.
3. Totale numero di sportelli e la struttura di ramificazione dei neuroni da
   1. Calcolare il numero totale di rami con l'apertura di "Analisi" e poi "Render | Analizzare i percorsi alleggeriti"nella finestra del plugin di tracciatura (Figura 5).
      Nota: La struttura dell'albero è la somma dei livelli dei rami. Il percorso è stato definito tra il corpo cellulare e i suggerimenti di dendrite e un percorso può includere più rami, come le pergole primari sono i dendriti dal corpo cellulare del neurone. Le pergole secondari sono rami dal primario e così via con le pergole di terziario, Quaternario e quinary. La struttura del dendrite ramificazione è separata a seconda dei livelli dei rami. Per esempio, il primario % è il numero di rami divisi dal numero totale di ramificazione e così via.

I dendriti dei neuroni da sono stati etichettati da co-overexpressing GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) da soma neurale e dendritiche pergole per analisi di imaging di fluorescenza di GFP. La morfologia dei dendriti del neurone da è stato ripreso da un microscopio confocale invertito (Figura 2).

I dendriti dei neuroni da sono stati rintracciati usando il software ImageJ Fiji. Il file è stato utilizzato per stimare la lunghezza di dendrite (Figura 3). Silenziamento di Sox102F in neuroni da (N = 21) (UAS-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; UAS-GFP) ha condotto ad una riduzione significativa del numero di dendriti e una più breve lunghezza del ramo con una struttura più semplice rispetto ai controlli (N = 20) (UAS-GFP; ppk-GAL4 / +) nel terzo instar larva (Figura 6). In particolare, mosche in cui fu messa a tacere Sox102F hanno esibito una riduzione di lunghezza di dendrite medio a 127 µm rispetto a 249 µm nei controlli (p = 0,02), e aveva una superficie più piccola media arbor 552.476 µm² rispetto a 847.571 µm² in controlli (p = 0,04). Inoltre, il silenziamento di Sox102F ha provocato un minor numero di rami e una struttura più semplice di ramificazione delle pergole con rami totale di 17 (17,3 ± 6,7), rispetto ai 28 (28,4 ± 9.5) nei controlli (p = 0,04). Student t-test sono stati eseguiti per confrontare le differenze tra i gruppi, e il livello di significatività è stato impostato a 0,05.

Figura 1 : Schemi di parametri di analisi di dendrite del neurone da Drosophila . Pannello (A) è l'immagine originale di un neurone da. (B) lunghezza di Dendrite era la media di tutte le lunghezze di dendrite in tutti i neuroni da misurata. (C) l'area della superficie di dendrite del neurone da manualmente è stato definito dallo strumento a mano libera ImageJ. (D) questo schema viene illustrato come contare il numero totale di rami e analizzare la struttura ad albero di un neurone da. 1: arbor primario. 2: arbor secondario. 3: arbor terziario. 4: arbor quaternario. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Analisi rappresentativa dei dendrites di un neurone da. Un neurone da era imaged con un sistema di microscopio di fluorescenza confocale. (A) il primo tracciato è stato creato con un punto di partenza dal corpo cellulare e il punto finale di un dendrite utilizzando lo strumento di plugin/segmentazione. La linea blu (freccia bianca) rappresenta il percorso definito. Dopo facendo clic su "Yes" (freccia rossa), la linea cambia colore dal blu al rosso. (B) cliccando su "Fine percorso" esso apparirà viola (C). (A-C) Viene illustrato il processo di tracciare un singolo dendrite; (D) l'intero tracciato immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Misurazione dei percorsi tracciati. L'immagine a sinistra Mostra come misurare i percorsi di traccia dopo aver eseguito la "analisi | Misurare i percorsi". Esportare valori di lunghezza del percorso in un file di foglio di calcolo e calcolare la somma della lunghezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Un esempio di definizione manualmente l'area di superficie di dendrite. Un'immagine definita è stata ottenuta utilizzando lo strumento mano libera nel menu ImageJ (indicato dalla freccia rossa). Impostare le misure selezionando Area. Eseguire la funzione di "Misura" per ottenere l'area mostrata nel riquadro rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Un esempio di analisi di ramificazione. Eseguire "Analysis_Render | Analizzare i percorsi alleggeriti"nella finestra del plugin"Segmentazione". I percorsi di rendering e il loro numero sono stati ottenuti selezionando "tutti i percorsi di rendering | Riepilogo di ottenere." Il percorso è stato definito tra il corpo cellulare e i suggerimenti di dendrite e un percorso può includere più rami; per esempio, le pergole primari erano i dendrites dal corpo cellulare del neurone; le pergole secondari erano rami dal primario e così via con le pergole di terziario, Quaternario e quinary. La struttura del dendrite ramificazione è stata separata in base ai livelli dei rami. Per esempio, % primario era il numero di rami divisi dal numero totale di ramificazione e così via. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Risultati rappresentativi di silenziamento di Sox102F in neuroni da. Silenziamento di Sox102F in neuroni da (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ppk-GAL4) portato a significativamente ridotta lunghezza di dendrite e più breve ramificazione con struttura più semplice nella terza larva instar rispetto ai controlli. Le differenze tra Sox102F-RNAi mosche (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ppk-GAL4, N = 21) e controllo (UAS-GFP; ppk-GAL4 / +, N = 20) mosche erano su (A) dendrite lunghezza (B) arbor superficie (C) totale numero di rami e (D, E ) struttura con diramazioni dei neuroni da. Test T di Student è stato proposto per l'analisi statistica. * indica la significatività statistica (p < 0,05). Le barre di errore sono media ± deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dendriti che innervano l'epidermide sono le regioni ingresso dei neuroni e loro morfologie determinano come informazioni viene ricevuti ed elaborati da singoli neuroni. Morfologia del dendrite di sviluppo riflette la modulazione genica dell'organizzazione di dendrite. Il Drosophila larvale da neurone del sistema nervoso periferico è un modello importante per studiare lo sviluppo di dendrite causa di: 1) la somiglianza funzionale con mammiferi^11,12; 2) quattro distinzioni di classe basati su dendrite struttura^11,12; e 3) i fattori genetici che regolano la morfogenesi. In questo protocollo, vi presentiamo il flusso di lavoro dalla preparazione di larve di analisi dell'immagine di neuroni da Drosophila . I metodi descritti i quattro parametri importanti per l'analisi dei dendriti in neuroni da in dettaglio, che sono la lunghezza dei dendriti, l'area della superficie, il numero totale di rami e la struttura ad albero. Il passaggio fondamentale era di rimuovere come molti tessuti da parete del corpo della larva come possibile per esporre completamente i neuroni da per l'imaging e analisi. Potrebbero esserci alcuni rami corti tagliati fuori a causa del numero limitato di immagini di Z-proiezione. Questo metodo è la misura relativa di lunghezza di dendriti in confronto ai comandi, un gran numero di immagini per ogni gruppo di neuroni da dovrebbe adottare per aumentare la copertura delle zone del Z-proiezione immagini.

Neuroni da Drosophila classe IV sono stati al centro delle ricerche concernenti il dendrite arbor morfologia^15,21,22,23. Morfogenesi di sviluppo dendritico arbor potrebbe essere disturbata da perdita o guadagno di funzione del gene, dimostrando che lo sviluppo da neurone è sensibile ai cambiamenti genetici²⁴. Per gli studi genetici, è importante analizzare la morfologia con precisione al fine di valutarne l'impatto sui neuroni a da. Classe IV da neuroni sono complesse ma ancora accessibile per l'imaging di alta qualità perché sono situati appena sotto la parete di corpo semi-trasparente e ramo, quasi interamente in due lo spazio dimensionale. La fluorescenza di GFP dinamica etichettato da neuroni (ppk-GAL4; UAS-GFP) fornire un modello facilmente visualizzato per indagare lo sviluppo neuronale. La direzione del cambiamento di morfologia varia, pergole possono diventare overbranched o semplificati. Qui, abbiamo categorizzato questi morfologiche cambia da parametri quantitativi, ad esempio la lunghezza di dendrite, l'area della superficie, il numero totale di rami e la struttura ad albero dei neuroni da. I risultati riflettono la risposta nell'espressione Sox102F che regolano lo sviluppo neuronale, come mostrato in questo studio.

Il nostro protocollo è stato utilizzato per mostrare i cambiamenti morfologici dei neuroni da classe IV in mosche in cui l'ortologo di Drosophila di SOX5, Sox102F, fu messa a tacere, che indica un importante ruolo funzionale di SOX5 nello sviluppo di dendrite e morfogenesi. Le proteine Wnt sono una famiglia di glicoproteine secrete che sono stati implicati nella regolazione della morphogeneis di dendrite. Wnt2 e Wnt7b promuovere da e complessità neuronale^9,10. Nel pathway canonico di Wnt, questa attivazione è seguita dall'attivazione di GSK3β, una serina-treonina chinasi, che a sua volta attiva β-catenin mediata trascrizione^10,25. Precedentemente abbiamo trovato che il silenziamento di SOX5 in cellule di neuroblastoma umane SH-SY5Y ha provocato una significativa repressione di attività di segnalazione di Wnt e regolato l'espressione di un numero di geni Wnt compreso una sovraespressione di GSK3β ¹⁵. Espressione aumentata di GSK3β è stato associato con le caratteristiche del segno distintivo dell'annuncio, compreso perdita di memoria, β-amiloide piaghe e anormale iperfosforilazione di tau²⁶. Silenziamento di SOX5 ha aumentato l'espressione di β GSK3, che potrebbe indicare un collegamento funzionale fra SOX5 e GSK3β.

I neuroni da classe IV sono i dendriti altamente complessi la maggior parte di tutti i neuroni sensoriali. In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo per analizzare la complessità di arbor e rami di astrarre le proprietà di da di IV classe neuroni in Drosophila basati su software e plugin convenzionalmente disponibili. Immagini che sono state prese da un microscopio confocale sono stati analizzati e la segmentazione di plugin di un tracciante del neurite semplice fornito uno strumento ideale per tracciare il dendrite rami^27,28. Inoltre, questo metodo di quantificazione permette l'analisi dettagliata di complessità dendrite presentando i rapporti dei vari livelli di ramificazione dal soma di dendrite più distante. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per analizzare altre classi di neuroni da. Classe, per esempio, I neuroni da estendere dendriti secondari ad un lato della parete del corpo; Classe II ha rami Librery simmetricamente; e classe III da neuroni hanno maggiore complessità di ramificazione e punte. In sintesi, abbiamo fornito un protocollo di formazione immagine e l'analisi di neuroni da di classe IV per analisi di dendrite neuronale in drosofila.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Vorremmo ringraziare William A. Eimer per l'assistenza tecnica di imaging. Quest'opera è stata sostenuta da fondo cura morbo di Alzheimer [per R.E.T], il National Institute of Health [R01AG014713 e R01MH60009 a R.E.T; R03AR063271 e R15EB019704 di A.L.] e la National Science Foundation [NSF1455613 a A.L.].