Drosophila Melanogaster deli dana gibi Protein toplamları izleme hücre hücre iletim

Kanıt biriken patojenik protein toplamları deli dana gibi özelliklere sahip hücreleri arasında yaymak nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili fikir destekler. Burada, hücre hücre yayılma model organizma, Drosophila melanogasterdeli dana gibi toplamları görselleştirme sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır.

Protein toplama Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) de dahil olmak üzere çoğu nörodejeneratif hastalıkların merkezi bir özellik olur. Protein toplamları nevropatoloji bu hastalıklarda ile yakından ilişkili olmakla birlikte hangi normal hücresel homeostazı anormal protein toplama bozan kesin mekanizması bilinmiyor. Veri ortaya çıkan güçlü bir destek hipotez için reklam, PD, HD o patojenik toplamları sağlayan, ve ALS Prionlar, sadece protein bulaşıcı ajanlar için bulaşıcı spongiform Encephalopathy sorumlu birçok benzerlikler. Prionlar şablonu tarafından yerel olarak katlanmış sürümleri toplama fenotip yayılmasını neden aynı Protein çevrimi kendini çoğaltır. Nasıl Prionlar ve deli dana gibi proteinler yılında, PD, HD ve ALS bir hücreden diğerine harekettir şu anda yoğun araştırma alanıdır. Burada, deli dana gibi hücre hücre iletim HD ile ilişkili mutant huntingtin (Htt) toplamları izleme izni Drosophila melanogaster modeli kullanılmıştır. Bu model birçok farklı Drosophila dokularda transgene ifade değiştirmek için güçlü araçlar yararlanır ve doğrudan rapor deli dana benzeri transfer mutant Htt toplamları fluorescently öğesini sitoplazmik protein kullanır. Önemlisi, biz burada tarif yaklaşım roman genler ve protein toplamları farklı hücre türleri içinde vivoarasında yayılan aracılık yollar tanımlamak için kullanılabilir. Bu çalışmalardan elde edilen bilgilerden nörodejeneratif hastalıkların altında yatan ve terapötik müdahale için yeni fırsatlar ortaya patojenik mekanizmaların sınırlı anlayış genişletir.

Deli dana hipotez devletlerin bulaşıcı transmissible spongiform Encephalopathy (örneğin, Creutzfeldt - Jakob hastalığı insanlarda, koyun, geyik ve elk kronik israf hastalığı ve "deli dana hastalığı" sığır büyük sorumlu ) sadece protein ve nükleik asitler¹yoksun oluşmaktadır. Prion hastalıkları, hücresel prion protein (PrP^C) son derece beta sayfa zengini ve dönüştürme ve monomeric PrP^C molekülleri istikrarlı amiloid işe alma tarafından kendi kendine yayabilirsiniz bir yerel olmayan, istikrarlı kat (PrP^Sc) varsayar. toplar. PrP^Sc toplamları bu kendini çoğaltan mekanizması bir canlı farklı hücreler arasında ve hatta bireysel organizmaların²arasında yaymak için kullanın.

Protein misfolding ve toplama Ayrıca merkezi bir özelliğidir çoğu nörodejeneratif hastalıklar (Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) ve amyotrofik lateral skleroz (ALS))³. Bu hastalıklar derlemelerde içi veya ekstra cellular toplanan protein oluşumunu saat^5, yakından ile sitotoksisite⁴ ve beyin ile son derece tekrarlanabilir ve hastalığa özgü yolları boyunca ilerledikçe ilişkilidir ⁶. patojen toplamları bu bozuklukları ile ilişkili deli dana gibi özelliklere sahip bu kalıpları yayılan öneririz. Şimdi güçlü desteği vardır deli dana gibi iletim reklam ile ilgili toplamları için PD, HD ve ALS - onlar yaymak hücre-hücre ve şablon monomeric formları daha önce etkilenmemiş hücreleri^{7, aynı proteinin konformasyon Değiştir 8}.

Deli dana gibi protein toplamları bugüne yayılmasını araştıran çalışmalar çoğunluğu memeli hücre kültür modelleri, ekstrasellüler boşluk veya başka bir hücrenin toplamları saf hücre sitoplazma nerede Aktarım'ı kullanarak gerçekleştirilen sitoplazma^{9,10,11,12,13,14,15}, veya toplama içeren malzeme fare beyin enjekte ve izleme Toplu Görünüm dışında Enjeksiyon Makinası^{16,17,18,19,20,21,22, 23}. son zamanlarda Transjenik hayvanlar sağlam beynini^{24,25,26,27, içinde diğer hücrelere yayılan hücre içi toplamları göstermek için kullanılmıştır 28,29,30}. Burada, doğrudan görselleştirme Drosophila melanogastersağlam beynini tek tek hücreleri arasında toplu aktarım için bir yöntem açıklanmaktadır. Drosophila modelleri HD/polyglutamine (polyQ) hastalıkların ilk geliştirilmiş olup, tüm yaklaşık iki yıl önce^31,32 ve bu bozuklukların altında yatan patojenik mekanizmaların birçok çok değerli anlayışlar hazırladık ³³. HD için protein huntingtin (Htt)³⁴kodları gen bir otozomal dominant mutasyon neden bir devralınan nörodejeneratif bozukluğu olduğunu. Genişleme polyQ abartılı Htt'ın N-terminus bir patojen eşiğinde ötesinde yakınındaki bu mutasyon sonucunda ~ misfold ve toplam^35,36protein neden 37 glutamines. Vahşi-türü Htt protein içeren < bu streç içinde 37 glutamines kendi yerel kat elde, ama için indüklenen bir Htt toplama "tohum"^12,27,37ile doğrudan fiziksel temas üzerine toplamak. Biz bu homotipik, vahşi tipi Htt çekirdekli toplama deli dana benzeri transfer için bir okuma olarak ve diğer hücrelerde kaynaklanan mutant Htt toplamları sitoplazmik giriş yararlanmak.

Mekanizmaları göre hangi deli dana gibi toplamları belirleme seyahat hücreler arasında tedavi edilemez nörodejeneratif hastalıklar için yeni tedavi hedefleri tanımlaması yol açabilir. Biz almak avantajı hızlı yaşam döngüsünün, kullanım kolaylığı ve hücre-hücre mutant Htt toplamları yayılması için moleküler mekanizmaları tanımlamak için Drosophila melanogaster genetik tractability. Deneysel stratejimiz iki ikili ifade sistemleri Drosophila, köklü Gal4 özgü ters yönde harekete geçirmek sıra (Gal4-UAS) sistem³⁸ ve son zamanlarda geliştirilen QF-QUAS sistemi³⁹uygun kullanmaktadır. Bu iki bağımsız sistem kaplin mutant ve vahşi-type Htt transgenes ifadesi aynı sinek⁴⁰içinde farklı hücre popülasyonlarının sınırlama sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, biz normalde diffüz, çözünür durumuna gelen sitoplazmik vahşi tipi Htt toplanan bir devlet, önceden biçimlendirilmiş bir mutant Htt ile fiziksel temas doğrudan bir sonucu yeniden dağıtılması izleyerek mutant Htt deli dana gibi yayılan incelemek toplama "tohum." Biyokimyasal kullanarak dönüşüm vahşi tipi Htt mutant Htt tarafından onaylanabilir veya floresan rezonans enerji gibi protein-protein etkileşimleri rapor biyofiziksel teknikleri (FRET)^9,27,41 transfer .

Da önemlisi, aynı zamanda genetik genler ve/veya protein toplamları yayılmasını deli dana benzeri aracılık yolları tanımlamak için Drosophila araçlarında çok sayıda erişebilirsiniz. Biz son zamanlarda önemli bir rol için hücre yüzey çöpçü reseptör, mutant Htt toplamları Drosophila Merkezi yakındaki fagositik glia nöronal aksonlar aktarılması içinde Draper^42,43, açıklayacak bu yaklaşım kullanılan sinir sistemi (MSS)²⁷. Böylece, biz burada tarif genetik ve görüntüleme tabanlı yaklaşım için kullanımı kolay ama güçlü model organizma, Drosophilahastalık ilgili bir fenomen hakkında önemli temel biyolojik bilgi ortaya çıkarabilir.

1. Htt Transgene ifadede Gal4 ve QF aracılı Drosophila kaplin

1. Toplamak ve/veya transgenik Drosophila melanogaster oluşturmak vahşi-türü veya mutant Htt transgenes aşağı Gal4-UAS³⁸ veya QF-QUAS³⁹içeren satırların yanı sıra doku özel Gal4 veya QF "sürücüler" içeren satırları. Bu transgenes ifade edilir protein flüoresan proteinler için yuvarlak veya epitope mutant ve vahşi-türü Htt transgene ürünlerinde aynı sinek farklılaşma izin verme öğesini olduğundan emin olun. Bkz: şekil 1.
   Not: Genellikle insan Htt gen²⁷exon 1 parçaları kullanın. Ancak, transgenik sinekler yerine isterseniz uzun Htt parçaları veya diğer genlerin ifade etmek için oluşturulur.
2. Öyle ki mutant ve vahşi-type Htt transgenes farklı ve üst üste hücre popülasyonlarının belirtilecektir genetik strateji planı.
   1. Herhangi bir ifade çakışma oluşursa, aynı hücrelerinde sentezlenen mutant ve vahşi-type Htt proteinler co toplamak ve deli dana gibi olaylar olarak algılanmasını önlemek. Bunu önlemek için Gal4 ve QF belirli repressors, Gal80 ve QS⁴⁰, sırasıyla kullanın (şekil 1). Gelişimsel olarak kontrollü Gal4 ve/veya QF sürücüleri seçerek mutant Htt ifade sonrası Mitotik hücre olasılığı ortadan kaldırmak için bu hücre bölünmesi kısıtlamak için yardım katkıda hücre hücre toplama yaymak için.
3. Standart kodlamayla koşul kullanma, mutant Htt QF (veya Gal4) bir "bağış" yolu ile hücre nüfus ve vahşi-türü Htt "alıcı" Gal4 (veya QF) yolu ile hücre nüfus hızlı döl üretmek için sinekler dostum. Olası bir genetik arada gösterilen bir şematik için bkz: şekil 1 .
   Not: rakamlar 1-4 ve bizim önceki yayın²⁷ gösterilen verileri oluşturmak için kullanılan QF ve Gal4 sürücüleri içeren DA1 koku reseptör nöron (ORN) sürücü, Or67d-QF ve pan gliyal sürücü, repo-Gal4.
4. Her iki QF ve Gal4 etiketli hücre popülasyonlarının vahşi tipi Htt hızlı paralel denetimi sinekler oluşturmak.
5. İstenen genotip döl toplamak ve hayvan uygun olarak yaş.

Resim 1 . QF-QUAS ve Gal4-UAS ikili ifade sistemleri kullanarak mutant ve vahşi-type Htt transgenes birleştiğinde ifade genetik yaklaşım. "Hücre A," bulunan bir QF sürücüyü kullanarak bir patojen uzunluğu polyQ streç (Q91) içeren bir mCherry olarak etiketlenmiş mutant Htt protein ifade edilir aşağı bir doku özgü organizatörü bir ("P^A"). "Hücre B," bir YFP tagged yaban tipi Htt normal polyQ streç (S25) içeren doku özel düzenleyici B ("P^B") tarafından kontrol edilen bir Gal4 sürücü ile ifade edilir. Şekil 2-4, Or67d-QF QUAS-HttQ91-mCherry ifade DA1 ORNs götürmek için kullanılan ve repo-Gal4 UAS-HttQ25-YFP tüm glia²⁷' ifade etmek için kullanılmıştır. Önemlisi, HttQ91-mCherry sadece transgene ters yönde yerleştirilen QUAS sıra sayesinde QF ifade hücrelerdeki ifade edilir. Benzer şekilde, HttQ25-YFP sadece özellikle UAS tanır Gal4 yolu ile ifade edilir. QF ve Gal4 sürücüler doku dağıtımında herhangi bir çakışma algılarsa, kodlama QS hücrelerdeki Gal4 ifade etmek ve hücrelerdeki QF ifade Gal80 transgenes tanıttı olabilir. Floresan protein Etiketler vahşi tipi ve mutant Htt üzerine ekleme iki protein farklılaşma sırasında görüntüleme ve perde uygun donör/alıcısı çiftleri arasında (örneğin, CFP/YFP veya YFP/mCherry) ölçmek için yeteneği sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. mikro-diseksiyon ve yetişkin Drosophila beyin fiksasyonu

Not: Bu diseksiyon yordamı bir önceki yayın⁴⁴değiştirildi ve beyin görüntüleme doğrudan Floresans sinyal Htt-floresan protein füzyon hazırlamak için kullanılabilir. İmmunostaining için beyin yapılabilir prosedür değişiklikleri sonraki bölümde ele alınmıştır.

1. Aşağıdaki malzemeleri toplamak ve buz üstünde yer: % 0.03 içeren fosfat tamponlu tuz Triton X-100 (PBS/T); microcentrifuge tüpler içeren 970 µL % 20 200 µL ekleyerek hazırlanan %4 paraformaldehyde (PFA) sabitleştirici çözüm PFA 770 µL için PBS/T; iyi içeren bir açık cam yemek; Tek kullanımlık transfer damlalıklı; iki diseksiyon forseps (bir No 3 ve bir No 5).
2. CO₂ kullanarak yetişkin sinekler anestezi ve buz cam yemek bir şey için aktarabilirsiniz.
3. Bir aktarım damlalıklı kullanarak küçük bir miktar eklemek (~ 500 µL) soğuk PBS/t de içeren boş bir şey için de sinekler için. Onlar diseksiyon ile engelleyebilir gibi çok fazla kabarcıklar tanıtan kaçının.
4. Cam tabak diseksiyon mikroskop altında düz bir yüzeye yerleştirin ve uçmak vücut görüş alanı doldurur ve odak kadar büyütme oranını ayarlamak.
5. Boynu ışık kaynakları bir çift cam tabak her iki ışık aydınlatıcı şekilde konumlandırın. Katlanmış laboratuvar mendil altında diseksiyon sırasında vücut parçaları/kütikül atmak için cam tabak demir.
6. No 3 forseps sigara dominant el kullanarak, bir tek sinek kapma tarafından anında tutun onun karın ventral yüzü yukarı bakacak şekilde hareketsiz de içeren PBS/T. içine aktarın.
7. Tam olarak PBS/T batık anında tutmak, sinek kafa No 5 forseps dominant el ile kaldırın. Bu forseps Manikür altında bir ucu küçük bir alanda sinek başın bir tarafında hortum bitişik yerleştirin. Her iki taraftan göz tutun forseps pinching tarafından kafasına kavrama güvenli.
8. Sinek kafa onun vücudundan iki forseps ayrı çekerek çıkarın. Yakın konumlandırılmış bir laboratuvar doku üzerinde uçmak vücut atmayın. Sinek kafa kayıp değil baskın-el forseps baskıyı koruyun.
9. Aynı küçük bir alanda hortum kütikül diğer tarafta altında pozisyon No 3 forseps sigara dominant bir ucu ver. Konumlandırılmış bir kez forseps gözler başın her iki tarafında aynı konumda kavrama için çimdik.
10. Manikür üzerinde kavrama güvenli olduğunda, yavaşça forseps 180 ° ayır. Bu eylem baş kütikül beyin zarar vermeden parçalayın. Bir laboratuar doku üzerinde kütikül kalıntı atmak.
    1. İdeal olsa da, baş kütikül tek adımda tamamen kaldırılmayabilir. Bu durumda, beyin tam olarak maruz kadar kütikül parça tarafından kaldırın. Beyin Forseps ile doğrudan temas kaçınarak zarar vermemesi için dikkat ediniz.
11. Disseke beyin PBS/T kaldırmak ekli bir nefes borusu kapma ahold tarafından veya beyin kapiller eylem tarafından forseps ipuçları arasındaki boşluğa aspirating.
    Not: Bu antennal loblar nerede biz genellikle görüntü beyin ön yüzeyinde belirsiz değil eğilimindedir gibi Trakea isteğe bağlı, çıkartılmasıdır. Nefes borusu ile görüntülemede sokarsan, beyin bu manipülasyon tarafından zarar görmüş değil bu yüzden ancak, onları dikkatli bir şekilde çıkarın.
12. Sinek beyin bir buz sabitleştirici solüsyon içeren microcentrifuge tüpler içine aktarın. Beyin forseps ayırır ve sabitleştirici çözümde sular altında emin olun.
13. Bir kez tüm beyin disseke, onları tabi bir "kısa-düzeltme" bir nutator için kapalı tüpler yerleştirerek ~ karanlık oda sıcaklığında 5 dak.
    Not: Bu kısa fiksasyon adım beyin sonraki adımlar kolay ve microcentrifuge tüp taraf için uygun değil sağlar.
14. P1000 pipet sabitleştirici Çözümle çoğunluğu kaldırmak ve o atın.
    1. Bu ve herhangi bir sonraki yıkama adım sırasında beyin tüp alıyorum kaçının. P1000 (örneğin, 650 µL) daha düşük bir ses ayarına ve süpernatant iki adımda kaldırın. Buna ek olarak, microcentrifuge tüpler bir ışık kaynağı (örneğin genel gider ışıklar) doğrultusunda beyin daha iyi görmek için alıyorum süre tutun.
15. 1 mL taze PBS/T Beyin için ekleyin. Hızlı bir şekilde yıkamak (< 1 dk) karanlıkta süpernatant beyin gelen Aspire edin ve atın.
16. PBS/T ile çamaşır aşağıdaki programa göre oda sıcaklığında karanlıkta yineleyin: 2 hızlı (< 1 dk) yıkar, 1 X 5 dk, 3 X 20 dk ve 1 X 1 h yıkama. Microcentrifuge tüpler başında güvenli ve tüpler bir nutator yıkar arasında yerleştirin.
    1. DAPI boyama isterseniz, PBS/T, 1 X 30 dk kuluçka 250 ng/mL DAPI ile ile son 1 h yıkama seyreltilmiş Değiştir izler 2 X hızlı ve 1 X 20 min tarafından yıkar.
17. Son yıkama sonra beyin bozmamaya dikkat çekici çoğunluğu yıkama arabellek süpernatant, kaldırın ve gliserol tabanlı antifade reaktif 30 µL beyin için ekleyin. Hareketi en az 1 h için ve en fazla 24 s olmadan karanlıkta 4 ° C'de kuluçkaya.

3. Bölüm 2 Immunostaining yetişkin beyin için yapılan değişiklikler

Not: Bu protokol ile zayıf Floresans floresan proteinler görüntüleme veya floresan protein füzyon için kullanın.

1. Triton X-100 PBS/t tarafından konsantrasyonu 10 kat artırmak (PBS + % 0,3 Triton X-100) her adımı için. Bu yeterli deterjan hücre zarları permeabilize ve antikorlar hücre içi alanlarda erişmek izin vermek için mevcut sağlar.
2. %4 beyni tamir PFA PBS/T, oda sıcaklığında 20 dakika içinde.
3. Tüm yıkama gerçekleştirdikten sonra karanlık oda sıcaklığında 30 dk için engelleme arabellek (PBS/T + % 5 normal keçi serum (NGS)) taze hazırlanmış beyinlerinde kuluçkaya.
4. Kaldırmak ve engelleme arabellek atın. Birincil antikor çözüm taze engelleme arabellekte uygun birincil antikorlar sulandrarak ana bir karışımı hazırlanan tüp başına 0.5 mL ekleyin ( Malzemeler tablo bkz: yaygın olarak kullanılan antikor ve dilutions için). Bir nutator için en az 24 saat içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de üzerinde birincil antikorlar beyinlerinde kuluçkaya.
5. Birincil antikor çözümü bir P1000 kullanarak beyin kaldırmak ve taze bir tüp içinde saklıdır. Beyin yıkamak için PBS/T 1 mL ekleyin.
   Not: Ayrılmış birincil antikor çözüm 4 ° C'de dört haftaya kadar saklanabilir. Biz başarıyla birincil antikorlar ilâ iki kez sonraki deneylerde geri dönüşümlü.
6. Hızlı bir şekilde beyin yıkama (< 1 dk) PBS/T, süpernatant beyin gelen Aspire edin ve atmak. Bu hızlı yıkama bir kez daha yineleyin.
7. Yıkama aşağıdaki programa göre oda sıcaklığında 1 mL PBS/T ile devam: 1 X 5 dk, 3 X 20 dk ve 1 X 1 h yıkama. Microcentrifuge tüpler başında güvenli ve tüpler bir nutator yıkama sırasında yerleştirin.
8. Son yıkama sonra PBS/T süpernatant çoğunluğu kaldırmak ve 0.5 mL taze engelleme arabellekte uygun antikorlar sulandrarak ana bir karışımı hazırlanan ikincil antikor çözeltisi ekleyin (bkz Tablo malzemeler için yaygın olarak kullanılan antikor ve dilutions) Karanlıkta 4 ° C'de 24 h için ikincil antikorlar beyinlerinde kuluçkaya.
9. İkincil antikorlar ile kuluçka sonra adımları 3.5, 3,6 ve 3,7 yıkama adımlarını yineleyin.
10. Son yıkama sonra yıkama arabellek çoğunluğu kaldırmak ve tüm beyin tüp alt kısmında yer olduğundan emin olun. 30 µL antifade reaktif beyin için ekleyin. 16-24 h için hareket etmeden karanlıkta 4 ° C'de kuluçkaya.

4. tüm beyin montaj

1. Bir cam mikroskop kaymak bir diseksiyon mikroskop ve kimlik bilgileri ile etiket altında yerleştirin.
   Not: Alternatif olarak, beyni doğrudan her iki beyin görüntüleme sırasında erişmek için bir kapak cam üzerine monte edilebilir. Bu montaj prosedürü açıklayan bir iletişim kuralı daha önce yayımlanmış⁴⁵oldu.
2. Beyin körelmenin damlalıklı ucu kullanarak her microcentrifuge tüpünden kaldırmak (alt kaldırmak için jilet kullanılarak hazırlanan ~ 1-200 µL bahşiş kapalı 1 cm) ve slayt ortasında içine aktarabilirsiniz. Küçük antifade reaktifi mümkün olduğunca beyni aktarabilirsiniz.
3. Forseps (örneğin, slayt ve ön yüzeyi yukarı bakacak şekilde antennal LOB görüntüleme için doğru işaret dorsal) istenen yönde beyin konumlandırmak için kullanın. Beyin yönlendirme, onları görüntüleme için kullanılmak üzere mikroskop ışık yolunu göz önünde bulundurun.
4. Aşırı antifade reaktif sivri köşe katlanmış laboratuvar doku beyin bozmadan kullanarak slayt kaldırın. Oturup slayt izin ~ 5-10dk slayda uymaları beyin izin vermek için karanlıkta.
5. Dört kırık olan bir kare oluşturmak için beyin her tarafında yerleştirilmiş cam parçaları ile sinek beyni çevreleyen ~ 19 mm x 19 mm. bir bir bu küçük cam parçaları dışında bir 22 x 22 mm No 1.5 cam kenarına yerleştirin ve coverslip Köprüsü-mount tamamlamak için beyin üzerinde yavaşça indirin.
6. Yavaş yavaş coverslip coverslip ya da beyni değil rahatsız etmek için dikkatli olmak, yüzeyin doldurmak için taze antifade reaktif dağıtmak. Sivri köşe katlanmış laboratuvar doku coverslip başvurmadan doğrudan kullanarak herhangi bir aşırı antifade yok etmek.
7. NET, çabuk kuruyan oje bir damla her coverslip dört bir yanına ekleyin. İçin Kuru izin ~ 10 dak. Sonra coverslip beyni tamamen aldığınızdan oje ile dört kenarlarını kapatın.
8. Görüntü beyin hemen, ya da mağaza 4 ° c kadar hazır.
   1. Htt-floresan protein füzyon gelen içsel Floresans Imaging, en iyi sinyal için 24 saat içinde beyin görüntü.

5. görüntüleme ve deli dana gibi iletim toplamları miktarının

1. Z dilimli görüntüleri nerede seçilen Gal4 ve QF sürücüleri ifade edilir beyin bölgesi boyunca toplamak için X 40 ya da 60/63 X Petrol amacı ile donatılmış confocal mikroskop (Şekil 2A, B) kullanarak bağlı beyin görüntü.
   1. Floresan protein füzyon veya uygun lazerler kullanarak immunolabeled proteinler heyecanlandırmak (örneğin, 488 nm GFP/YFP/FITC veya 552 nm için mCherry/Cy3 için). Maksimum floresan yakalama set algılama windows kanal çapraz bir spektral algılama sistemi kullanarak talk ayrıcılıklarına olan sinyal veya grup/uzun emisyon filtreler belirli her fluorophore için geçiş.
      Not: protein toplamları görüntüleme zaman dikkatli olmak. Piksel, özellikle büyük toplamları doymuş olmak için her toplama merkezinde kolaydır. Doygunluk görüntüdeki en aza indirmek, ama daha küçük toplu tür (Şekil 2B, C, D) sinyal kaybetme riski dikkat denemesi. Çok fazla doygunluk izole puncta tanımlamak daha zor hale görüntü arka plan artacaktır. Her veri kümesindeki son görüntüleri almadan önce optimize etmek için farklı görüntü ayarlarını sınayın.
2. Bireysel puncta ya el ile tek tek z dilimleri (örneğin, Şekil 2C ve şekil 4A) veya 3 boyutlu (şekil 3 confocal dilimleri oluşturma sonra taşıyarak miktarının tarafından verileri analiz A, B).
   Not: Bu görüntü J veya diğer görüntü işleme yazılımı yapılabilir.
   1. Agrega iyi ayrılmış ve minimal arka plan Floresans ise, görüntü analiz yazılımı sistematik olarak tanımlamak, ölçmek ve ayrı "nesneler" veya "yüzeyler" confocal yığını (3D inşası toplamları çözümlemek için kullanın Şekil 3 B).
      Not: yazılım eylemler açıklanan araç ve burada kullanılan yazılım özgüdür ( Tablo reçetesigörmek).
      1. Confocal z serisi 3D görüntüleme modunda görselleştirin. Seçili bir kanal ( şekil 3' te kırmızı kanal HttQ91-mCherry için toplarörneğin ) yerleri tek tek tanımlamak için "Analiz" Sihirbazı'nı kullanın. Eşik ve doğru şekilde görüntüyü ayrı ayrı nesneler olarak tüm heterogeneously boyutlu toplamları göstermek için filtre ayarlayın.
      2. "İkili işleme aberrantly bilgisayar yazılımı algoritma tarafından birleştirilir yakından ilgili toplamları ayırmak için ön filtre" altında "nesneleri Böl" etkinleştirin. Nesneleri ve onların ilişkili ölçümlerin toplam sayısı "Altında ölçümler." bildirdi unutmayın
         Not: amiloid toplamları, merkezi olduğu için karşı antikorlar için aşılmaz mutant Htt toplamları miktarının bu yöntemi immunostaining iletişim kuralı için müsait değildir. Sonuç olarak, agrega mikroskobunun yüzük benzeri yapılar görünür, ve görüntü analiz yazılımı doğru tanımlamak ve bu "yerleri" tek tek ayırt edemiyor.
   2. El ile z yığınında taşıyarak ve vahşi-türü Htt toplamları, hiçbir toplamları çift-attı onlar birden fazla görünüyorsa emin puanlama vahşi tipi Htt toplamları ölçmek dilim (şekil 4A).
      Not: Bu el ile miktar yaklaşım her confocal yığın toplamları sayısı makul (örneğin, 20-50) olduğunda kullanılabilir. Görüntü analiz yazılımı (örneğin, diffüz vahşi tipi Htt yakındaki hücrelerdeki sinyalini) aynı kanaldaki çevreleyen sinyalinden gelen bireysel puncta ayırt edemez ne zaman da yardımcı olur (Şekil 2B, C ve şekil 4 A). vahşi tipi Htt toplamları miktarının de zor çünkü birçok normal yapılar beyin punctate (örneğin, hücre oluşum ve sinapsların) görünür. Vahşi-türü ve mutant Htt sinyallerin co yerelleştirme bir seçim ölçütü kullanılabilir; Ancak, bazı mutant Htt "tohum" confocal tespiti sınırı altında kalan mümkündür. Bir protein (örneğin, GFP) alıcı hücrelerde toplamak değil Htt dışında beyinde ilgisiz punctate yapıları etiketlemek için kullanılabilir.
3. Daha fazla bireysel toplamları karakterizasyonu gerçekleştirmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. Örneğin, toplamları (şekil 3C), mutant ve vahşi-türü Htt proteinler (şekil 4A), arasında yüzde co yerelleştirme boyutu dağılımı belirlemek veya doğrudan kullanarak FRET (protein-protein etkileşimleri ölçmek Şekil 4 B).
   1. Bireysel puncta doğru bir şekilde belirli bir kanalı tüm görünür toplamları tanımlayan bir nokta veya yüzey algılama algoritması kullanarak boyut dağılımı belirlemek. Örneğin 'toplama çapı' (Res. 3 C), "ses" elde etmek veya yazılım "Analiz" Sihirbazı'ndaki 'yoğunluğu' bilgi 'Ölçüm' dan 5.2.1. adımda anlatıldığı noktalar veya yüzeyler ilgili ölçümler almak için görüntü analiz yazılımı kullanın.
      Not: şekil 3' teC, biz çapları bir tek DA1 glomerulus içinde tanımlanan tüm HttQ91-mCherry puncta için dağıtım raporu.
   2. HttQ25-YFP ve HttQ91-mCherry toplamları arasındaki yüzde co yerelleştirme confocal z deste (en doğru yöntemi) aracılığıyla tarafından dilim dilim el ile hareket ettirerek belirleyin. Ancak, herhangi bir toplamları iki kez değil saymak için dikkat ediniz. Bunu önlemek için odak düzlemi (şekil 4A) toplama Merkezi aracılığıyla ise belirli bir z-dilim toplamları yalnızca say.
   3. PERDE verimliliği için indüklenen HttQ25-YFP toplamları ile colocalized HttQ91-mCherry sinyali alıcısı photobleaching yöntemini kullanarak hesaplayın.
      1. İlk olarak, potansiyel çapraz-hadis diğer kanal sinyal üretmek sadece mCherry ve sadece YFP sinyalleri için algılama windows kurarak YFP ve mCherry kanallar arasında ortadan kaldırmak. Bu ayarları kullanarak almak bir 'resim' bireysel HttQ25-YFP puncta ve onların ilişkili HttQ91-mCherry sinyal ( şekil 4B) önce.
      2. Sonra photobleach mCherry sinyal kırmızı lazer ayarlayarak (örneğin, 552 nm) % 100 yoğunluk ve sinyal bitene inceden inceye gözden geçirmek için. ' Önce resim' ve almak aynı puncta (şekil 4B) bir 'sonra görüntü' için kullanılan ayarları dönmek.
      3. Floresans yoğunluk ölçümleri için her dallarin önce ve sonra görüntü analiz yazılımı kullanarak photobleaching hesaplayın.
      4. YFP donör Floresans ölçülen çıkararak FRET verimlilik hesaplamak 'resim önce'(YFP_ilk) YFP donör floresan 'sonra görüntü' den (YFP_son). Bu değer YFP_sontarafından bölmek ve 100 ile çarpmak.
         Not: Perde verimliliği piksel piksel veya genel her HttQ25-YFP toplamak (şekil 4B) için hesaplanabilir. Alıcısı photobleaching her HttQ25 YFP siklikla ile ilişkili mCherry sinyali tespit YFP mCherry photobleaching sonra dequenching üretmek için yeterince yüksek olduğunda FRET verimlilik hesaplamak için özellikle yararlı bir tekniktir.

Yöntem tanımlamak burada sağlam veri bozulmamış anında CNS alanında bir hücre popülasyondan deli dana benzeri transfer Htt protein toplamları gösteren üretmek. Dönüştürülmesine ilişkin yaban tipi Htt diffüz punctate için bu YFP füzyon proteinin doğrudan Floresans tarafından alıcı glia donör ORNs (Resim 2A-C ve şekil 4A, B) HttQ91-mCherry ifade sonucu olarak görülmektedir. Bu iki hücre popülasyonlarının arasında deli dana benzeri transfer olayların doğru raporlama transgenik sinekler ve mutasyona uğramış ve vahşi-type Htt transgenes sırasında herhangi bir çakışma olmadan düzeyde güçlü ifade üretmek için Gal4/QF sürücüleri dikkatli seçimi gerektirir geliştirme veya erişkin dönemde. Buna ek olarak, floresan protein-Htt füzyon transgenes düşünceli tasarımını güçlü aşağı akım analizleri etkinleştirebilirsiniz. Örneğin, mutant ve vahşi-türü Htt toplamları olabilir punctate nesneleri olarak da el ile (Şekil 2C ve şekil 4A) sayısal veya görüntü analiz yazılımı (şekil 3A, B) kullanarak, ölçülebilir ve toplam nüfus (şekil 3C) olarak karakterize, mutant ve vahşi-türü proteinler (şekil 4A) arasında ortak yerelleştirme için değerlendirildi ve perde²⁷ için (şekil 4 için analiz edilebilir B). Bu analizler FRET donör ve alıcısı çiftleri arasında (örneğin, CFP/YFP⁹ etkinleştirmek için mutant ve vahşi-type Htt floresan protein etiketlerle yeterince ayrılmış Floresans özelliklere sahip, ancak yeterli spektral örtüşme ile füzyonu gerektirir veya YFP/mCherry²⁷)

Resim 2 . Deli dana gibi dönüşüm gliyal HttQ25-YFP nöronal HttQ91-mCherry toplamları tarafından confocal görüntülerini. (A)maksimum yoğunluk projeksiyon ~ confocal dilim bir antennal LOB HttQ91-mCherry ifade bir erkek sinek (kırmızı) Or67d-QF ve HttQ25-YFP (yeşil) repo-Gal4 kullanarak glia kullanarak DA1 ORN aksonlar içinde gösterilen 30 µm. Antennal LOB ve nerede DA1 ORN aksonlar, bitirmek DA1 glomerulus yaklaşık sınırları sırasıyla katı ve noktalı çizgilerle gösterilir. (B) maksimum yoğunluk projeksiyon üzerinden ~ confocal dilimleri tek bir HttQ25-YFP puncta ve onun ilişkili HttQ91-mCherry sinyal (gösterilen A. (C) A tek 0,35 µm confocal dilim DA1 glomerular bölgesinden büyütülmüş bir görünümünü gösteren 20 µm Her kanaldaki bir ok ile gösterilen). Kırmızı kanal sinyal HttQ25-YFP ve HttQ91-mCherry sinyalleri arasında ortak yerelleştirme görselleştirmek için geliştirilmiş oldu. Tüm görüntüleri bir 40 X 1.4NA petrol hedefi kullanarak elde. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . HttQ91-mCherry toplamları DA1 ORN aksonlar üç boyutlu analizi. (A) bir 3D DA1 glomerulus Or67d-QF istimal ayni Şekil 2' deBgösterilen veriler üzerinden ifade HttQ91 mCherry toplamları tasviri. (B) A screenshot gösterilen tek tek nesneler veya "bir görüntü analiz yazılım paketi kullanarak ham veriler(a)belirlenen noktalar". Yazılım bu kanal/resim farklı boyutlarda 56 nesneleri tespit. Ok ucu (B) ile gösterilen spot çapı için ölçüldü ~ 1.2 µm. oklar işaret nerede iki nesne yanlış birleştirilir bir nokta içine belgili tanımlık bilgisayar yazılımı, bireysel puncta yakınlığı nedeniyle büyük olasılıkla tarafından yerlere. Bu sorunu gidermek için yazılımı farklı eşik ayarları test edilmelidir ve/veya birleştirilmiş noktalar el ile mümkünse ayrılmalıdır. Ölçek çubukları = 10 µm. (C) Histogram çapları dağılımını gösteren ölçülen yazılım tarafından HttQ91-mCherry "(B) gösterilen noktalar" için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 . Co Yerelleştirme ve perde analizini indüklenen HttQ25-YFP toplamları. 4 bireysel 0,35 µm confocal z-dilim--dan HttQ91-mCherry DA1 glia repo-Gal4 kullanarak Or67d-QF ve HttQ25-YFP kullanarak ORNs içinde ifade bir erkek sinek beyin (A) A montaj. Sinyalleri bile küçük HttQ91-mCherry toplamları görülebilir ve diffüz sinyal çevreleyen indüklenen HttQ25-YFP toplamları öne ayarlandı. Gösterilen dilimleri her ayrılır ~ 1.0 µm (birleştirilen görüntülerin alt sağ köşede belirtilen dilim numarasını) böylece birden çok toplam görülebilmektedir. Oklar veya bu belirli z-dilimi odakta yakınında el ile z-yığın içinde hareket ettirerek olduğu tespit HttQ25-YFP puncta gösterir. Burada yedi HttQ25-YFP puncta altı detectably HttQ91-mCherry sinyal ilişkilendirilmiş olan (Yani, HttQ25-YFP toplamları % 86'sı ortak yerelleştirmek HttQ91-mCherry ile). HttQ25-YFP puncta ile ilişkili mCherry sinyal kez DA1 glomerulus mCherry pozitif puncta çoğunluğu daha zayıf olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu 5 µm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-co-lokalize dallarin önce (sol kapı aynası) = ve (doğru panelleri) mCherry (alıcısı) photobleaching sonra. YFP (donör) floresan elde edilen artış ImageJ⁴⁶için AccPbFRET eklentisi kullanarak bir piksel piksel FRET verimliliği (FRET_eff) görüntü üretmek için kullanıldı. Bu belirli toplama %61 genel bir FRET_eff vardır. Ölçek çubuğu 1 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Nörodejeneratif hastalıklardan muzdarip hastaların sayıları artmaya devam ettikçe, böylece daha iyi tedaviler geliştirilen bu hastalıkların moleküler patogenezi anlayışı artırmak için acil bir ihtiyaç vardır. Burada, patojenik protein toplamları model organizma, Drosophila melanogasterfarklı hücre türleri arasında deli dana gibi iletimi izlemek için izin yöntemleri açıklanmaktadır. Biz son zamanlarda mutant Htt toplamları vivo içinde iletimini deli dana gibi göstermek ve nöronlar üzerinden bu toplamları glia²⁷yayılmasını aracılık eder bir fagositik reseptör belirlemek için bu yöntemi kullandık. Genetik insan hastalık çalışmaya Drosophila kullanmanın birçok yararları yaklaşımımız patlatır: onun kısa hayat döngüsü ve tedavi amaçlı ilgili temel biyolojik bilgi keşfi hızlandırabilir büyük genetik araç seti.

Biz burada tarif yöntemleri varolan diğer hayvan iki büyük avantajlar sunuyor ve kültür modelleri deli dana gibi iletimi için hücre: (1 toplayarak etken (örneğin, mutant Htt) sağlam bir doku ve (2) ikamet eden bir hücrede üretilen ifade bir ayrı hücre nüfus aynı protein (örneğin, vahşi tipi Htt) normalde katlanmış sürümünün kolayca erişilebilir bir "muhabir" deli dana gibi etkinlikler için sağlar. Drosophila⁴⁰köklü gelişmiş genetik araçlar kullanılarak mutant ve vahşi-türü Htt proteinler hücre popülasyonlarının üst üste aynı organizma içinde ifade elde ettik. Birçok farklı doku özgü Gal4 ve QF sürücü hazır olduğundan, aslında uçmak vücuttaki herhangi bir farklı hücre tipleri arasında deli dana gibi transferi incelenmesi mümkün olabilir.

Kritik bir bileşeni yaklaşımının mutant ve vahşi-türü Htt proteinler arasında farklı hücre popülasyonlarının aynı hayvan içinde ayrılmış ifade gerçekleştirmektedir. Herhangi bir ifade örtüşme böylece yaban tipi Htt toplama alıcı hücrelerdeki doğru sitoplazmik penetrasyon donör hücreleri^9,12'^{,27kaynaklanan deli dana gibi toplamları raporları bertaraf edilmesi gerekiyor, 41}. Bu ek genetik araçları (örneğin, Gal80 ve QS repressors⁴⁰) bu sorunu hafifletmek için tanıtarak yapılabilir. Bir kez ideal genotip tasarlanmış ve seçili, puncta miktarının için sistematik bir yöntem oluşturulmuş olmalıdır. Bu büyük ölçüde etiketlenir hücre sayısı, görüntülenen toplamları sayısı ve sinyal-gürültü oranı örnek üzerinde bağlıdır. Biz burada şekil 4' te açıklandığı gibi ortak Yerelleştirme ve/veya pozitif perde gibi ölçütleri verileri analiz etmek için kullanılabilir. Bazı mutant Htt toplama tohumları confocal mikroskop tespiti sınırın altına düşme olabilir beri Ancak, vahşi tipi Htt yelpazesi sınırlama bu özelliklerini temel alarak toplamları için deli dana benzeri transfer olayların küçümseme neden olabilir.

Burada açıklanan vivo içinde yaklaşım deli dana gibi davranış HD veya bile diğer polyQ bozuklukları ile ilişkili toplamları için özel değildir. Transgenik sinekler Alfa-synuclein PD, tau yılında, içinde deli dana gibi yayılan incelemek için geliştirilen ve SOD1 veya TDP-43 aynı deneysel paradigması kullanarak ALS içinde. Donör hücreleri ve ne zaman parçalanmayabilir tek toplamları alıcı hücrelerde ifade edilmelidir çözünür bir versiyonu aynı proteinin her bu proteinler için toplama eğilimli bir mutant ifade edilmelidir. Bu deneysel bir paradigma da patojen proteinler farklı hastalıklar ile ilişkili bir çapraz-tohum mekanizması⁴⁷ile etkileşim ortaya çıkan fikir soruşturma için yararlı olabilir. Son olarak, sayısız genetik araçlarını Drosophila içinde araştırmak ve moleküler mechanism(s) bu ölümcül hastalıklar ile ilişkili patojenik protein toplamları sitoplazma sitoplazma yayılan temel belirlemek için uygulanır.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntemlerin geliştirilmesi sırasında birçok yararlı tartışmalar Kopito, Luo ve Pearce Labs'in üyeleri teşekkür ediyoruz. Biz de bu el yazması eleştirel okuma için Brian Temsamrit teşekkür ederim. Bu eser Üniversitesi Bilimler ve chilling Smith hayırsever güven fonlarından desteklenen bir durumdu.