초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 집계 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS)를 포함 하 여 대부분의 신경 퇴행 성 질병의 중앙 특징 이다. 정도 벗어난 단백질 집계 방해 정상적인 세포 항상성 정확한 메커니즘은 알려져 있지 있지만 단백질 집계는이 질병에 neuropathology와 밀접 하 게 관련. 데이터를 신흥 AD, PD, hd, 그 병원 성 집계 가설에 대 한 강력한 지원을 제공 하 고 ALS prions, 단백질만 전염 성 요원 전달할 수 면 encephalopathies에 대 한 책임에 많은 유사점을가지고. 자기 prions 집계 형의 확산을 일으키는 동일한 단백질의 기본적으로 접혀 버전의 변환 템플릿으로 복제. 어떻게 prions 그리고 광고, 프리온 같은 단백질 한 셀에서 다른 PD, HD, 및 ALS 이동 현재 강렬한 수 사의 영역입니다. 여기, HD와 관련 된 돌연변이 huntingtin (Htt)의 프리온 처럼, 셀 전송의 모니터링을 허용 하는 초파리 melanogaster 모델을 설명 합니다. 이 모델 transgene 식 많은 다른 초파리 조직에 조작 하기 위한 강력한 도구를 활용 하 고 돌연변이 체 Htt의 직접 보고서 프리온 같은 전송에 놓여있는지 태그 세포질 단백질을 이용 한다. 중요 한 것은, 우리가 여기에 대해 설명 하는 접근 소설 유전자와 단백질의 다양 한 셀 형식 비보사이의 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 얻은 정보는 신경 퇴행 성 질병 기초 및 치료 적 개입을 위한 새로운 기회를 공개 하는 병원 성 메커니즘의 제한 된 이해를 확장 됩니다.

프리온 가설 상태에 전염성이 에이전트 전송 가능 해 encephalopathies (예를 들면, 인간에서 크로이츠펠트-야콥 병, 양, 사슴, 엘크, 만성 낭비 질병 및 "광우병" 가축에서 scrapie에 대 한 책임 )의 단백질 및 핵 산¹없는 전적으로 구성 되어 있습니다. 프리온 질병, 세포 프리온 단백질 (PrP^C) 가정 아닌, 안정적인 접이식 PrP (^Sc) 높은 베타 시트-부자 이며 자체 변환 및 안정 된 아 밀 로이드로 단위체 PrP^C 분자에 의해 전파 수 있습니다. 집계합니다. PrP^Sc 집계는 유기 체에 다른 세포 사이 및 개별 유기 체²사이 확산이 자기 복제 메커니즘을 사용 합니다.

단백질 misfolding 및 집계 또한 대부분 신경 퇴행 성 질환 (Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS))의 중앙 특징 이다³. 이러한 질병에 내부 또는 여분 cellular 집계 단백질 어셈블리의 형성은 시간^5, 에 밀접 하 게 관련 된 세포 독성⁴ 와 두뇌를 통해 높은 재현성 및 질병 특정 경로 따라 진행 ⁶. 이러한 패턴의 확산이이 질환과 관련 된 병원 성 집계 프리온 같은 속성을가지고 제안. 강력한 지원, 광고와 관련 된 집계의 프리온 같은 전송에 대 한 존재 PD, HD, 및 ALS-그들은 셀 템플릿 이전 영향을 받지 않는 셀^{7, 동일한 단백질의 단위체 형태의 구조적 변화에서 확산 8}.

날짜의 단백질 프리온 처럼 확산 조사 연구의 대다수 포유류 세포 문화 모델, 어디 집계 전송을 사용 순진한 세포의 세포질에 다른 세포 또는 세포 외 공간에서 수행 되었습니다. 세포질^{9,10,11,12,13,,1415}, 또는 마우스 두뇌에 집계 포함 된 재료를 주입 하 고 모니터링 하 여 집계는 사출 사이트^{16,17,18,19,20,,2122,} 이외의 모양 ²³. 최근 유전자 변형 동물 세포내 집계 그대로 두뇌^{24,25,,2627, 내의 다른 셀에 확산을 보여 주기 위해 사용 되었습니다 28,,2930}. 여기, 우리는 초파리 melanogaster의 그대로 뇌에 있는 개별 셀 사이의 집계 전송의 직접 시각화 하는 방법을 설명합니다. 초파리 모델 HD/polyglutamine (polyQ) 질병의 거의 2 년 전 처음 개발^31,32 이 무질서의 기반이 되는 병원 성 메커니즘에 대 한 많은 귀중 한 통찰력 제공 ³³. HD는 단백질 huntingtin (Htt)³⁴코드 하는 유전자는 상 염색체 지배적인 돌연변이 의해 발생 하는 상속 된 신경 장애. 이 돌연변이의 병원 문 턱을 넘어 Htt의 N-말단 근처 polyQ 스트레치의 확장 결과 ~ 37 glutamines, misfold 및 집계^35,36단백질을 일으키는. 야생-타입 Htt 단백질 포함 된 <이 뻗 기에 37 glutamines 그들의 네이티브 배를 달성 하지만에 유도 될 수 있다는 Htt 집계 "씨앗"^12,,2737와 직접적인 물리적 접촉 시 집계. 우리는이 homotypic, 프리온 같은 전송에 대 한 판독으로 야생-타입 Htt의 nucleated 집계 및 다른 세포에서 발생 하는 돌연변이 체 Htt 집계의 세포질 항목을 악용 합니다.

프리온 같은 집계 하 여 결정 하는 메커니즘 셀 사이의 여행 불 치 신경 퇴행 성 질환에 대 한 새로운 치료 대상의 식별 될 수 있습니다. 우리는 빠른 라이프 사이클을 이용, 사용의 용이성, 그리고 초파리 melanogaster 돌연변이 체 Htt의 셀을 확산에 대 한 분자 메커니즘 정의를 유전적 추적성을 걸릴. 우리의 실험 전략 초파리, 잘 설립 Gal4 특정 상류 활성화 순서 (Gal4 UAS) 시스템³⁸ 및 QF QUAS 최근 개발 시스템³⁹에서 사용할 수 있는 두 개의 이진 식 시스템을 사용합니다. 이 두 개의 독립적인 시스템을 커플링 같은 비행⁴⁰내 뚜렷한 세포 인구를 제한 하는 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 표현 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 프리온 같은 집계 된 상태로, 미리 형성 된 돌연변이 체 Htt와 육체적 인 접촉의 직접적인 결과 일반적으로 확산, 수용 성 상태에서 세포질 야생-타입 Htt의 재분배를 모니터링 하 여 돌연변이 Htt의 확산 검토 집계 "씨입니다." Htt의 돌연변이 의해 야생-타입 Htt의 변환 생물을 사용 하 여 확인 될 수 있다 또는 단백질 단백질 상호 작용, 형광 공명 에너지 등을 보고 생물 기술 전송 (무서 워)^9,,2741 .

중요 한 것은, 우리 또한 많은 유전자 초파리 유전자 및 단백질의 프리온 같은 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 도구를 액세스할 수 있습니다. 우리는 최근 세포 표면 폐품 수용 체, 드레이퍼^42,43, 신경 축 삭에서 초파리 중앙에 가까운 phagocytic 명과 돌연변이 체 Htt 집계를 전송에 대 한 중요 한 역할을 공개 하기 위해이 접근을 사용 신경 시스템 (CNS)²⁷ 따라서, 우리가 여기에 설명 하는 유전 및 이미징 기반 접근 강력한 모델 생물, 초파리하지만 사용 하기 간단한에서에서 질병 관련 현상에 대 한 중요 한 기본적인 생물 학적 정보를 밝힐 수 있다.

1. 초파리 에 Gal4 QF 중재 Htt Transgene 식 커플링

1. 수집 또는 생성 하는 유전자 변형 초파리 melanogaster 조직 관련 Gal4 또는 QF "드라이버"를 포함 하는 라인으로 줄 야생-타입 또는 돌연변이 체 Htt transgenes 하류 Gal4 UAS³⁸ 또는³⁹QF-QUAS. 단백질이이 transgenes에서 표현 되는 형광 단백질을 융합 또는 동일한 비행에 돌연변이 야생-타입 Htt transgene 제품의 차별화에 대 한 있도록 피토 프 태그 인지 확인 합니다. 그림 1을 참조 하십시오.
   참고: 우리는 일반적으로 인간의 Htt 유전자²⁷의 exon 1 조각을 사용합니다. 그러나, 유전자 변형 파리 대신 원하는 경우 더 이상 Htt 조각 또는 다른 유전자를 표현 하기 위해 생성할 수 있습니다.
2. 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes 별개, 겹치지 않는 세포 인구에 표현 될 것 이다 그런 유전 전략을 계획 합니다.
   1. 어떤 식의 중복 발생, 돌연변이 및 야생-타입 Htt 단백질 같은 세포에서 합성 공동 집계 하 고 프리온 같은 이벤트의 탐지를 방지. 이 문제를 방지 하려면 Gal4 및 QF 특정 repressors, Gal80 및 품질 평가 점수⁴⁰, 각각 (그림 1). 발달 제어 Gal4 / QF 드라이버 선택 제한 돌연변이 Htt의 표현 가능성을 제거 하는 포스트 mitotic 세포는 세포 분열 하는 데 도움이 수에 기여할 수 셀 집계 확산.
3. 표준 자란 상태를 사용 하 여, 돌연변이 "기증자" QF (또는 Gal4) 통해 Htt 셀 인구와 야생-타입 Gal4 (QF) "받는 사람"에 통해 Htt 세포 인구를 표현 하는 자손을 생성 하기 위해 파리 친구. 회로도 가능한 유전자 조합을 보여주는 그림 1 을 참조 하십시오.
   참고: 우리의 이전 게시²⁷ 에서 그림 1-4 에 표시 된 데이터를 생성 하는 데 사용 했다 QF Gal4 드라이버 DA1 후 각 수용 체 신경 (온) 드라이버, Or67d-QF, 팬 glial 드라이버, repo Gal4 포함.
4. QF Gal4 표시 두 세포 인구에서 야생-타입 Htt를 표현 하는 병렬에서 제어 파리를 생성 합니다.
5. 원하는 유전자 형의 자손을 수집 하 고 적절 한 동물 나이.

그림 1 . 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes QF-QUAS 및 Gal4 UAS 이진 식 시스템을 사용 하 여 결합 된 표현에 대 한 유전 접근. "셀 A,"는 mCherry 태그 돌연변이 체 Htt 단백질 포함 된 병원 성 길이 polyQ 스트레치 (Q91) 표현 있는 QF 드라이버를 사용 하 여 조직의 특정 발기인은 ("P^A")의 하류. "셀 B," YFP 태그 야생-타입 Htt 정상적인 polyQ 스트레치 (Q25)를 포함 하는 조직-특정 발기인 B ("P"^B")에 의해 제어 Gal4 드라이버를 통해 표현 된다. 그림 2-4, Or67d-QF DA1 ORNs QUAS-HttQ91-mCherry 식 구동 하는 데 사용 했다 그리고 repo Gal4 모든 명과²⁷UAS-HttQ25-YFP 표현 하는 데 사용 되었다. 중요 한 것은, HttQ91-mCherry 배치는 transgene의 업스트림 QUAS 시퀀스 덕 QF 표현 셀에만 표시 됩니다. 마찬가지로, HttQ25-YFP만 구체적으로 인식 하는 UAS Gal4 통해 표현 된다. QF Gal4 드라이버의 조직 분포에 어떤 중복 감지 되 면 transgenes 인코딩 QS Gal4 표현 셀에 및 Gal80 QF 표현 세포에 도입 수 있습니다. 이미징 및 적절 한 기증자 또는 수락자 쌍 (예를 들어, c f P/YFP 또는 YFP/mCherry) 사이 무서 워를 측정 하는 능력 중 두 가지 단백질의 차별화 야생 형 및 돌연변이 체 Htt에 형광 단백질 태그를 추가 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 마이크로 해 부와 성인 초파리 두뇌의 고정

참고:이 해 부 절차 이전 게시⁴⁴에서 수정 되었습니다 및 두뇌 Htt 형광 성 단백질 융해에서 이미징 직접 형광 신호에 대 한 준비를 사용할 수 있습니다. 수정 할 수 있는 immunostaining에 대 한 두뇌 절차는 다음 섹션에서 설명 되어 있습니다.

1. 다음과 같은 자료를 수집 하 고 얼음에: 0.03%를 포함 하는 인산 염 버퍼 염 분 Triton X-100 (PBS/T); microcentrifuge 튜브 200 µ L 20%를 추가 하 여 준비 하는 4 %paraformaldehyde (PFA) 통 솔루션의 포함 970 µ L 770 µ L PFA PBS/T; 투명 유리 접시 포함 하는 잘; 일회용 전송 피펫으로; 두 해 집게 (한 3 및 1 5)
2. CO₂ 를 사용 하 여 성인 파리 anesthetize 하 고 얼음에 유리 접시의 한 잘에 그들을 전송.
3. 작은 금액을 추가 사용 하 여 전송 피펫으로 (~ 500 µ L) 차가운 PBS/T 필요는 잘 포함 하는 빈 잘으로도 파리의. 그들은 해 부를 방해할 수 있습니다 너무 많은 거품을 소개 하지 마십시오.
4. 해 현미경 아래 평평한 표면에 유리 접시를 놓고 비행 몸 보기의 필드를 채웁니다 때까지 초점이 배율을 조정 합니다.
5. 빛은 유리 접시의 양쪽 모두를 조명 그렇게 목이 광원의 쌍을 배치 합니다. 해 부 시 신체 부품/표 피를 삭제할 유리 접시 아래 접힌된 연구소 조직 앵커.
6. 3 집게 비 지배적인 손을 사용 하 여, 잡아서 비행 그것의 복 부의 복 부 면이 위로 향하도록 잡고 잘 포함 PBS/t. 고정으로 하나의 비행 전송.
7. PBS/T에 완전히 빠져들 비행 유지, 지배적인 손에 5 집게와 비행 머리를 제거 합니다. 비행 머리의 1 개의 측에 코에 인접 한 작은 공간에 표 피 아래이 집게의 한 끝을 삽입 합니다. 눈 양쪽에서 잡고 잡아 집게를 곤란 하 게 하 여 머리에 그립을 확보.
8. 두 집게 떨어져 당겨 그 몸에서 비행 머리를 제거 합니다. 근처 위치 연구소 조직에 비행 체의 처분. 비행 거리 머리 손실 되지 않습니다 있도록 지배적인 손을 집게에 압력을 유지 합니다.
9. 비 지배에서 제 3 집게의 위치 한 팁 코의 반대편에 표 피 아래 같은 작은 공간에 손을. 일단 위치, 머리의 양쪽에 같은 위치에 눈을 그립에 집게를 꼬집어.
10. 일단 표 피에 그립 안전, 부드럽게 당겨는 집게 떨어져 180 °. 이 작업 중단 됩니다 떨어져 머리 표 피는 뇌 손상 없이. 연구소 조직에 표 피 찌 꺼 기를 삭제 합니다.
    1. 하지만, 머리 표 피 수 있습니다 완전히 제거 되지 한 번에. 뇌가 완전히 노출 될 때까지 경우에, 표 피 조각으로 제거 합니다. 알아서 하지는 집게와 직접 접촉을 방지 하 여 두뇌를 손상.
11. 연결 된 기도의 잡아 연락 하거나 모 세관 작용에 의해 집게 끝 사이 공간으로 뇌를 발음 해 부 두뇌 PBS/T에서 제거 합니다.
    참고: 우리가 일반적으로 이미지 하는 뇌의 앞쪽 표면에 더듬이 돌출부를 가리지 않도록 경향이 기관 제거 선택 사항입니다. 그러나, 경우 이미징 기도 방해, 제거 신중 하 게 그래서이 조작에 의해 뇌 손상 되지 않은.
12. 얼음 통 솔루션을 포함 하는 microcentrifuge 튜브 중 하나로 비행 두뇌를 전송 합니다. 두뇌는 집게에서 분리, 통 솔루션에 빠져들 확인 하십시오.
13. 모든 두뇌의 해 부 되어, 일단 그들을 주제 "짧은 수정"에 대 한 nutator에 닫힌된 튜브를 배치 하 여 ~ 어둠 속에서 실 온에서 5 분.
    참고:이 짧은 고정 단계 하면 두뇌 후속 단계에서 처리를 쉽게 하 고 microcentrifuge 튜브의 양쪽에 고착 하지 않는다.
14. P1000 피 펫 통 솔루션의 대부분을 제거 하 고 그것을 폐기.
    1. 이 모든 후속 세척 단계 동안 관에서 두뇌를 발음 하지 마십시오. (예를 들어, 650 µ L) 낮은 볼륨에서 P1000 설정 고 두 단계에는 상쾌한을 제거 합니다. 또한, 더 나은 두뇌를 시각화 하기 위해 발음 하면서 광원 (예: 오버 헤드 조명)에 따라 microcentrifuge 튜브를 누르십시오.
15. 두뇌에 신선한 PBS/T의 1 mL를 추가 합니다. 신속 하 게 세척 (< 1 분), 어둠 속에서 두뇌에서 상쾌한 발음 및 삭제.
16. 다음 일정에 따라 실 온에서 어둠 속에서 PBS/t 세척을 반복: 2 빠른 (< 1 분) 세척, 1 X 5 분, 3 X 20 분, 및 1 X 1 h 세척. Microcentrifuge 튜브에 상판을 보호 하 고 세척 사이 nutator에 튜브를 놓습니다.
    1. DAPI 얼룩을 원하는 경우 대체 250 ng/mL DAPI 가진 1 X 30 분 외피와 최종 1 시간 세척/T의 PBS에 희석 뒤 2 배 빠른 및 1 X 20 분 세척.
17. 마지막 세척 후, 머리를 방해 하지 않도록 주의 복용 워시 버퍼 상쾌한의 대부분을 제거 하 고 두뇌를 30 µ L 글리세롤 기반 antifade 시 약의 추가. 적어도 1 시간 및 24 h까지 운동 없이 어둠 속에서 4 ° C에서 품 어.

3. 제 2 Immunostaining 성인 두뇌에 대 한 수정

참고: 사용 하 여이 프로토콜 비 형광 단백질을 이미징 또는 형광 성 단백질 융해에 대 한 약한 형광으로.

1. 트라이 톤 X-100 PBS/T에 의해에서 농도 10 배 증가 (PBS + 0.3% 트라이 톤 X-100) 모든 단계에 대 한. 이렇게 하면은 충분 한 세제 permeabilize 세포 막 항 체 세포내 공간에 액세스를 허용 하는.
2. 4%에서 머리를 수정 PFA PBS/T 실 온에서 20 분 동안에.
3. 세척의 모든 작업을 수행한 후 어둠 속에서 실 온에서 30 분 동안 갓 블로킹 버퍼 (PBS/T + 5% 정상 염소 혈 청 (NGS))에 머리를 품 어.
4. 제거 하 고 차단 버퍼를 삭제 합니다. 0.5 mL 신선한 블로킹 버퍼에서 적절 한 1 차 항 체를 diluting 하 여 마스터 혼합으로 준비 하는 관 당 1 차적인 항 체 솔루션의 추가 (일반적으로 사용 되는 항 체 및 희석 재료의 표 참조). 어둠 속에서 4 ° C에서 24 시간 이상에 대 한 nutator에 1 차 항 체에 두뇌를 품 어.
5. 두뇌는 P1000 사용 하 여에서 1 차적인 항 체 솔루션을 제거 하 고 신선한 튜브에 예약. 두뇌 씻어 PBS/T의 1 mL를 추가 합니다.
   참고: 예약 된 기본 항 체 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 4 주 동안. 우리는 성공적으로 재활용 1 차 항 체를 두 번 후속 실험에서.
6. 두뇌를 신속 하 게 세척 (< 1 분) PBS/T에 두뇌에서 상쾌한 발음 및 삭제. 이 빠른 세척을 한 번 더 반복 합니다.
7. 다음 일정에 따라 실 온에서 1 mL PBS/T와 함께 세척을 계속: 1 X 5 분, 3 X 20 분, 및 1 X 1 h 세척. Microcentrifuge 튜브에 상판을 보호 하 고 세척 동안는 nutator에 튜브를 놓습니다.
8. 마지막 세척 후 PBS/T 상쾌한의 대부분을 제거 하 고 신선한 블로킹 버퍼에 적절 한 항 체를 diluting 하 여 마스터 혼합으로 준비 하는 이차 항 체 솔루션의 0.5 mL을 추가 (일반적으로 사용 되는 항 체에 대 한 재료의 표 참조 그리고 희석)입니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 24 h에 대 한 2 차 항 체에 두뇌를 품 어.
9. 2 차 항 체를 가진 외피 후 3.5, 3.6, 3.7 단계에서 세척 단계를 반복 합니다.
10. 최종 세척 후 워시 버퍼의 대부분을 제거 하 고 모든 두뇌는 튜브의 하단에 있는지 확인 합니다. 두뇌를 30 µ L antifade 시 약을 추가 합니다. 16-24 h에 대 한 운동 없이 어둠 속에서 4 ° C에서 품 어.

4. 뇌 장착

1. 유리 현미경 슬라이드 해 현미경 및 식별 정보 레이블을 배치 합니다.
   참고: 또는, 두뇌 장착할 수 있습니다 이미징 동안 두뇌의 양쪽 모두에 액세스 하는 커버 유리에 직접. 이 설치 절차를 설명 하는 프로토콜⁴⁵이전에 게시 되었습니다.
2. 무딘된 피펫으로 팁을 사용 하 여 각 microcentrifuge 튜브에서 두뇌를 제거 (바닥을 제거 하는 면도날을 사용 하 여 준비 ~ 1 200 µ L 팁에서 1cm) 슬라이드의 중간에 그들을 전송. 최대한 머리와 작은 antifade 시 약으로 전송.
3. 집게를 사용 하 여 원하는 방향 (예를 들어, 슬라이드 앞쪽 표면 더듬이 엽 이미징에 대 한 위로 향하도록 상단 쪽으로 향하고 등)에 머리를. 머리 방향을 때 그들을 상상 하는 데 사용할 현미경의 빛 경로 고려 하십시오.
4. 두뇌를 방해 하지 않고 접힌된 연구소 조직의 뾰족한 모서리를 사용 하 여 슬라이드에서 초과 antifade 시 약을 제거 합니다. 앉아 슬라이드 하자 ~ 슬라이드에 머리 수 있도록 어둠 속에서 5-10 분.
5. 깨진된 커버 유리는 광장을 형성 하는 머리의 각 측에 4 개의 작은 조각으로 비행 두뇌를 둘러싸고 ~ 19 m m x 19 mm. 유리의이 작은 조각 중 하나 밖에 22 x 22 mm No. 1.5 커버 글라스의 한 모서리에 배치 부드럽게 다리-산을 완료 하는 머리 위로 coverslip 내립니다.
6. 천천히 분배 되는 coverslip 또는 두뇌를 방해 하지 않도록 주의 하는 coverslip 아래 표면 채우기 위해 신선한 antifade 시 약. 어떤 과잉 antifade는 coverslip 직접 하지 않고 접힌된 연구소 조직의 뾰족한 모서리를 사용 하 여 닦아.
7. coverslip의 네 모서리의 각을 명확 하 고, 빠른 건조 매니큐어의 한 방울을 추가 합니다. 에 대 한 건조 허용 ~ 10 분. 그런 다음, 완전히 머리를 묶는 데 매니큐어와 coverslip의 4 개의 가장자리 물개.
8. 두뇌를 즉시, 이미지 또는 준비 될 때까지 4 ° C에서 저장.
   1. Htt 형광 성 단백질 융해에서 본질적인 형광 이미징 하는 경우 최상의 신호에 대 한 24 시간 이내 두뇌 이미지.

5. 이미징 및 측정의 프리온 같은 전송

1. Confocal 현미경 선택한 Gal4 QF 드라이버는 표현 하는 두뇌의 영역을 통해 z 슬라이스 이미지를 수집 하는 40 X 또는 오일 목표 X 60/63를 갖춘 (그림 2A, B)를 사용 하 여 탑재 된 두뇌 이미지.
   1. 형광 성 단백질 융해 또는 immunolabeled 단백질 적절 한 레이저를 사용 하 여 자극 (예를 들어, 488 nm mCherry/Cy3에 GFP/YFP/FITC 또는 552 nm에). 최대 형광을 캡처 설정된 검색 창을 채널 잡담 중 스펙트럼 탐지 시스템을 사용 하 여 제거 하는 동안 신호 또는 밴드/긴 각 fluorophore에 대 한 특정 방출 필터를 통과.
      참고: 있을 때 단백질 집계 이미징 세심 한. 각 집계를 포화 되 고, 특히 큰 집계에에서의 중심에 픽셀 쉽습니다. 이미지에 채도 최소화 하지만 작은 집계 종 (그림 2B, C, D)에서 신호를 잃기의 위험을 인식 하려고 합니다. 너무 많은 채도 이미지 배경, 더 어려운 고립 된 puncta를 식별 하 고 증가할 것 이다. 각 데이터 세트에 최종 이미지를 복용 하기 전에 최적화 하려면 다른 이미징 설정을 테스트 합니다.
2. 수동으로 개별 z-조각 (예를 들어, 그림 2C 및 그림 4A) 또는 3 차원 (그림 3 에 confocal 슬라이스 렌더링 후 이동 하 여 개별 puncta를 측정 하 여 데이터를 분석 A, B)입니다.
   참고:이 이미지 J 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어에서 할 수 있습니다.
   1. 집계 됩니다 잘 분리 하는 경우는 최소한의 배경 형광 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 체계적으로 식별, 계량, 및 다른 "개체" 또는 "표면" confocal 스택 (3D 재구성에 집계 분석 그림 3 B)입니다.
      참고: 설명 하는 소프트웨어 작업은 악기와 여기에 사용 되는 소프트웨어 ( 재료의 표참조).
      1. 3D 보기 모드에서 confocal z 시리즈를 시각화 합니다. "분석" 마법사를 사용 하 여 선택한 채널 (예: HttQ91 mCherry에 대 한 빨강 채널 그림3에서 집계)에서 개별 관광 명소를 식별. 임계 처리 및 정확 하 게 나타내는 모든 heterogeneously 크기의 집계는 이미지에서 개별 개체 필터를 조정 합니다.
      2. "이진 처리 사전 필터" aberrantly 소프트웨어 알고리즘에 의해 병합 됩니다 밀접 하 게 관련 된 집계를 별도의 "개체를 분할"을 사용 합니다. 개체와 관련 된 그들의 측정의 총 수는 "측정"에서 보고 note
         참고:이 방법은 돌연변이 체 Htt 집계 측정에 대 한 아니다 immunostaining 프로토콜 의무가, 녹말 체의 중심은 항 체를 꿰 뚫을 수 있기 때문에. 그 결과, 집계 현미경에 고리 모양의 구조로 나타나고 이미지 분석 소프트웨어는 정확 하 게 식별 하 고 이러한 개별 "반점"를 구별할 수 없습니다.
   2. 야생-타입 Htt 집계 수동으로 z 스택을 통해 이동 하 고 득점 야생-타입 Htt 집계, 아니 집계는 더블-득점 이상에 나타나는 경우 확인 하 여 계량 슬라이스(그림 4).
      참고:이 수동 정량화 방법은 각 confocal 스택의 집계 수는 적당 한 (예를 들어, 20-50) 때 사용할 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어 (예를 들어, 가까운 세포에서 확산 야생-타입 Htt에서 신호) 같은 채널에서 주변 신호에서 개별 puncta를 구별할 수 없을 때 그것은 또한 도움이 된다 (그림 2B, C , 그림 4 A). 야생-타입 Htt 집계 측정도 도전적 일 수 있다 두뇌에 많은 정상적인 구조 punctate (예를 들어, 셀 프로세스와 시 냅 스) 표시 때문에. 야생-타입 및 돌연변이 체 Htt 신호 공동 지역화; 선택 기준으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 일부 돌연변이 체 Htt "씨앗" 탐지는 confocal의 제한 아래가. 받는 사람 셀 (예를 들어, GFP)에 집계 되지 않는 Htt 이외의 단백질 없는 두뇌 punctate 구조를 사용할 수 있습니다.
3. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 추가 개별 집계의 특성화를 수행. 예를 들어 집계 (그림 3C), 돌연변이 야생-타입 Htt 단백질그림 4(A), 사이 백분율 공동 지역화의 크기 분포를 결정 하거나 직접 무서 워 (단백질 단백질 상호 작용을 측정 그림 4 B)입니다.
   1. 특정 채널에서 모든 표시 집계를 정확 하 게 식별 하는 자리 또는 표면 탐지 알고리즘을 사용 하 여 개별 puncta의 크기 분포를 결정 합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 관광 명소 또는 표면 관련 측정, 예를 들어 '집계 직경' (그림 3 C), '볼륨', 얻거나 5.2.1 단계에서 설명 하는 소프트웨어 "분석" 마법사에서 '측정'에서 '강도' 정보.
      참고: 그림 3C, 우리는 단일 DA1 glomerulus에서 식별 된 모든 HttQ91-mCherry puncta에 대 한 직경 분포를 보고 합니다.
   2. 수동으로 조각으로 슬라이스 confocal z 스택 (가장 정확한 방법)를 통해 이동 하 여 HttQ25 YFP 및 HttQ91 mCherry 집계 사이 백분율 공동 지역화를 결정 합니다. 그러나, 주의 하지 두 번 모든 집계를 계산 하십시오. 이 방지 하려면 초점의 비행기는 집계(그림 4)의 센터를 통해 사용 하는 경우만 특정 z 슬라이스에서 집계를 계산 합니다.
   3. 수락자 photobleaching 메서드를 사용 하 여 colocalized HttQ91-mCherry 신호 유도 HttQ25 YFP 집계에 대 한 무서 워 효율을 계산 합니다.
      1. 첫째, 다른 채널에 신호를 생성 하는 mCherry 전용 및 YFP 전용 신호 감지 windows를 설정 하 여 YFP 및 mCherry 채널 사이 잠재적인 크로스 토크 제거 합니다. 이러한 설정을 사용 하 여가지고 '이미지'의 개별 HttQ25 YFP puncta 및 그들의 관련된 HttQ91 mCherry 신호 ( 그림 4B) 전에.
      2. 다음, photobleach는 mCherry 빨간 레이저를 조정 하 여 신호 (예를 들어, 552 nm) 100% 강도를 스캔 신호 사라질 때까지. '이미지' 전에 동일한 puncta (그림 4B)의 '후 이미지'에 사용 된 설정으로 돌아갑니다.
      3. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 photobleaching 전후 각 푼 크 툼에 대 한 형광 강도 측정을 계산 합니다.
      4. 무서 워 효율성 YFP 기증자 형광 측정을 빼서 계산는 '이미지' 전에 (YFP_초기) '이후 이미지'에 YFP 기증자 형광에서 (YFP_최종). YFP_마지막에 의해이 값을 분할 하 고 100을 곱하십시오.
         참고: 픽셀-픽셀 또는 각 HttQ25 YFP 집계 (그림 4B)에 대 한 전반적인 무서 워 효율성을 계산할 수 있습니다. 수락자 photobleaching 무서 워 효율성을 계산 하는 각 HttQ25 YFP 푼 크 툼 연관 mCherry 신호 감지 YFP dequenching mCherry photobleaching 후 생산을 충분히 높을 때 특히 유용한 기술입니다.

여기에 설명 된 방법을 그대로 비행 CNS에서에서 다른 한 세포 인구에서 Htt의 단백질 프리온 같은 전송 시연 하는 강력한 데이터 생성. 야생-타입 Htt의에서 변환 확산 punctate 기증자 ORNs (그림 2A C 및 그림 4A, B)에서 HttQ91 mCherry 식의 결과로 받는 사람 명과에서이 YFP 융해 단백질의 직접 형광에 의해 관찰 됩니다. 이 두 세포 인구 사이 프리온 같은 전송 이벤트의 정확한 보고 유전자 변형 파리와 중 어떤 오버랩 없이 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 강한 식 수준의 생산 Gal4/QF 드라이버의 신중한 선택 필요 개발 또는 성인에서. 또한, 형광 단백질-Htt 퓨전 transgenes의 사려깊은 디자인 강력한 다운스트림 분석을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 돌연변이 및 야생-타입 Htt 집계 될 수 정량 punctate 개체로 하거나 수동으로 (그림 2C 및 그림 4) 또는 이미지 분석 소프트웨어 (그림 3A, B)를 사용 하 여 측정 될 수 있다 고 돌연변이 야생-타입 단백질그림 4(A), 사이 공동 지역화에 대 한 평가 될 수 있다 집계 인구그림 3(C)으로 추가 특징, 그리고 무서 워²⁷ (그림 4에 대 한 분석 될 수 있다 B). 이러한 분석 필요 (예를 들어, c f P/YFP⁹ 기증자 및 수락자 쌍 사이 무서 워 수 있도록 형광 단백질 태그 충분히 분리 된 형광 속성, 하지만 충분 한 스펙트럼 오버랩에 돌연변이 야생-타입 Htt의 융합 또는 YFP/mCherry²⁷).

그림 2 . 신경 HttQ91 mCherry 집계에 의해 glial HttQ25 YFP의 프리온 같은 변환의 공초점 이미지. (A) 최대의 강도 투영 ~ (빨간색) DA1 ORN axons repo Gal4를 사용 하 여 명과 Or67d-QF와 HttQ25-YFP (녹색)를 사용 하 여 표현 하는 HttQ91 mCherry 남성 비행에서 한 더듬이 엽 보여주는 confocal 조각의 30 µ m. 더듬이 엽 DA1 glomerulus, DA1 온 축 삭 종료의 대략적인 경계는 점선 및 고체 라인으로 각각 표시 됩니다. (B) 최대 강도 프로젝션 ~ 슬라이스에서 A. (C) A 단일 0.35 µ m confocal 단일 HttQ25 YFP puncta 및 그것의 관련된 HttQ91 mCherry 신호 (DA1 사 영역의 확대 보기를 표시 하는 confocal 조각의 20 µ m 각 채널에 화살표로 표시). 빨강 채널에서 신호 HttQ25 YFP 및 HttQ91 mCherry 신호 사이 공동 지역화를 시각화 하기 위해 향상 되었습니다. 모든 이미지는 40 X 1.4NA 오일 목표를 사용 하 여 인수 했다. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 . HttQ91-mCherry 집계 DA1 온 축 삭에서의 3 차원 분석. (A)는 3D 묘사의 HttQ91-mCherry Or67d-QF 같은 그림 2B에 표시 된 데이터를 사용 하 여 통해 DA1 glomerulus 표현. (B) A 스크린샷 개별 개체 또는 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 (A)에 원시 데이터에서 확인 된 "반점"를 보여주는. 소프트웨어는이 채널/이미지에 다양 한 크기의 56 개체를 식별합니다. (B) 화살촉으로 표시 하는 자리를의 직경을 측정 했다 ~ 1.2 µ m. 화살표 어디 두 개체는 정확 하 게 병합 하지 한 자리에 개별 puncta의 가까운 근접으로 인해 소프트웨어에 의해 위치를 가리킵니다. 이것을 극복 하기 위해 다른 임계 처리 설정 소프트웨어에서 테스트 해야/또는 병합 된 관광 명소 가능 하면 수동으로 분리 해야 합니다. 스케일 바 = 10 µ m.의 직경 분포를 보여 주는 (C) 히스토그램 측정 소프트웨어에 의해 HttQ91 mCherry (B)에 표시 된 "반점"에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 . 공동 현지화 및 무서 워 분석 유도 HttQ25 YFP 집계. (A) A 4 개별 0.35 µ m confocal z-조각 표현 repo Gal4를 사용 하 여 명과 Or67d-QF와 HttQ25 YFP를 사용 하 여 DA1 ORNs에 HttQ91-mCherry 남성 비행 두뇌에서의 몽타주. 신호는 작은 HttQ91 mCherry 집계 되 고 유도 HttQ25 YFP 집계 확산 신호를 주변에서 밖으로 서 있도록 조정 되었다. 분할 영역 표시는 각각 구분 하 여 ~ 1.0 µ m (슬라이스 번호 병합 된 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 표시)는 여러 집계를 관찰할 수 있다. 화살표는 수동으로 z 스택을 통해 이동 하 여 또는 그 특정 z 슬라이스에 초점 근처에 있을 하기로 결정 했다 HttQ25 YFP puncta를 나타냅니다. 여기에 표시 된 7 개의 HttQ25 YFP puncta의 6 탐지 HttQ91 mCherry 신호 연결 (즉, HttQ25 YFP 집계의 86% 공동 지역화와 HttQ91-mCherry). MCherry 신호 HttQ25 YFP puncta와 관련 된 참고는 종종 DA1 glomerulus에 mCherry-긍정적인 puncta의 대부분 보다는 더 약하다. 눈금 막대 = 5 µ m. (B) A HttQ25 YFP/HttQ91-mCherry-co-지역화 푼 크 툼 (왼쪽된 패널) 전에 전후 (오른쪽 패널) mCherry (수락자) photobleaching. YFP (기증자) 형광 결과 증가 ImageJ⁴⁶에 대 한 AccPbFRET 플러그인을 사용 하 여 픽셀에 의해 무서 워 효율 (무서 워_eff) 이미지를 생산 하기 위해 사용 되었다. 이 특정 집계의 61%는 전반적인 무서 워_eff 는 있다. 눈금 막대 = 1 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

신경 퇴행 성 질환으로 고통 받는 환자 수가 증가 하 고, 더 나은 치료법을 개발 될 수 있도록 이러한 질병의 분자 pathogenesis의 이해를 증가 하는 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 다른 세포 유형 사이 병원 성 단백질의 프리온 같은 전송 모니터링을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 최근 돌연변이 체 Htt 집계에서 vivo에서 의 프리온 같은 전송 설명 하 고 명과²⁷뉴런에서 이러한 집계의 확산을 중재 phagocytic 수용 체를 식별 하이 방법을 사용 했습니다. 우리의 접근 방식을 악용 초파리 를 사용 하 여 유전자 인간 질병 연구의 몇 가지 장점: 그것의 짧은 라이프 사이클 및 치료와 관련 된 기본적인 생물 학적 정보의 발견을 가속화할 수 있는 광대 한 유전 도구.

우리는 여기에 설명 하는 방법을 기존의 다른 동물에 비해 두 가지 주요 이점을 제공 및 세포 프리온 같은 전송에 대 한 문화 모델: 그대로 조직, 그리고 (2)에 있는 세포에서 생산 되는 (1) 집계 원인이 되는 에이전트 (예를 들면, 돌연변이 체 Htt) 일반적으로 접혀 버전을 별도 셀에에서 동일한 단백질 (예를 들어, 야생-타입 Htt)의 식을 프리온 같은 이벤트에 대 한 쉽게 액세스할 수 있는 "기자를"를 제공합니다. 우리는 초파리⁴⁰확고는 정교한 유전자 도구를 사용 하 여 돌연변이 같은 유기 체 내에서 세포 인구 겹치지 야생-타입 Htt 단백질의 표현을 달성 했다. 많은 다른 조직 관련 Gal4 및 QF 드라이버를 쉽게 사용할 수 있기 때문에 비행 체에 본질적으로 어떤 뚜렷한 세포 유형 사이 프리온 같은 이전을 검토 하는 것은 가능 합니다.

접근의 중요 한 구성 요소는 돌연변이 같은 동물 내에서 다른 세포 인구에 있는 야생-타입 Htt 단백질의 차별된 표정을 달성 이다. 모든 식 중복 받는 사람 세포에서 야생-타입 Htt 집계 정확 하 게 보고 기증자 세포^{9,12,,27에서 발생 하는 프리온 같은 집계의 세포질 침투 되도록 제거 될 필요가 41}. 이 추가적인 유전 도구 (예를 들어, Gal80와 QS repressors⁴⁰)이이 문제를 완화 하 여 수행할 수 있습니다. 이상적인 유전자 설계 및 선정, 일단 puncta를 측정 하는 체계적인 방법을 설정 해야 합니다. 이 크게 표시 되는 셀의 수, 집계, 수 및 샘플의 신호 대 잡음 비율에 따라 달라 집니다. 우리는 여기에서 설명한 그림 4공동 지역화 긍정적인 무서 워 등 기준 데이터를 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 야생-타입 Htt의 선택 제한 집계가이 기능에 따라 발생할 수 있습니다 과소 프리온 같은 전송 이벤트의 몇몇 돌연변이 체 Htt 집계 씨 confocal 현미경의 검출 한도 이하로 떨어질 수 있기 때문.

여기에 설명 된 vivo에서 접근 HD 또는 심지어 다른 polyQ 장애 관련 된 집계의 프리온 처럼 행동에 대 한 배타적입니다. 유전자 변형 파리 프리온 처럼 알파 synuclein PD, 광고, 타우에에서의 확산을 검사 개발 될 수 있다 및 SOD1 또는 동일한 실험 패러다임을 사용 하 여 ALS에 TDP-43. 이 단백질의 각 집계 경향이 돌연변이 기증자 세포, 그리고 유일한 집계 nucleated 때 받는 사람 세포에서 표현 되어야 합니다 같은 단백질의 용 해 버전에서 표현 되어야 합니다. 이 실험적인 패러다임 또한 다른 질병와 관련 된 병원 성 단백질 크로스 시드 메커니즘⁴⁷을 통해 상호 작용 수 있습니다 신흥 아이디어 조사를 위해 유용할 수 있습니다. 마지막으로, 조사 하 고 식별 분자 따라 세포질-세포질 확산이 치명적인 질병와 관련 된 병원 성 단백질의 기본 장치를 마더보드에 초파리 에서 사용할 수 있는 무수 한 유전 도구를 적용할 수 있습니다.

저자는 공개 없다.

우리는 이러한 방법을 개발 하는 동안 많은 도움이 토론을 위한 Kopito, 루 오, 그리고 피어스 연구소의 회원을 감사합니다. 우리는 또한이 원고에의 중요 한 독서에 대 한 브라이언 Temsamrit을 감사합니다. 이 작품은 대학 과학 및 트 면 스미스 자선 신탁에서에서 자금에 의해 지원 되었다.