Мониторинг в ячейке передачи китовая птичка подобных белков агрегатов в Drosophila Melanogaster

Накапливая доказательства поддерживает идею о том, что патогенные белка агрегатов, связанные с нейродегенеративных заболеваний спрэд между клеток с китовая птичка подобными свойствами. Здесь мы описываем метод, который позволяет визуализации ячеек для распространения прионы, как агрегатов в организме модель, Drosophila melanogaster.

Агрегации белков является центральным элементом большинства нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезни Гентингтона (HD) и боковой амиотрофический склероз (ALS). Белка агрегаты тесно связаны с невропатология в этих заболеваний, хотя точный механизм, по которому аномальным белка агрегации нарушает нормального клеточного гомеостаза не известно. Появляющиеся новые данные оказывать решительную поддержку гипотезу что патогенные агрегатов в AD, PD, HD, и ALS имеют много общего в прионы, которые являются только белок инфекционных агентов, ответственных за трансмиссивные формы губкообразной энцефалопатии. Прионы, шаблонов саморазмножается преобразование изначально сложить версий же белка, вызывая распространения фенотип агрегации. Как прионы и китовая птичка подобных белков в AD, PD, HD и ALS перехода от одной ячейки к другой в настоящее время площадь интенсивных расследований. Здесь описан модель Drosophila melanogaster , которая допускает контроль передачи китовая птичка как, к ячейке мутант гентингтина (НТТ) агрегатов, связанные с HD. Эта модель использует мощные инструменты для манипулирования трансген выражение во многих различных тканях дрозофилы и использует дневно тегами цитоплазматический белок передачи непосредственно доклад китовая птичка как мутант Htt агрегатов. Важно отметить, что подход, который мы описываем здесь может использоваться для выявления новых генов и пути, которые посредником, распространение агрегатов белка между клеток различных типов в естественных условиях. Информация, полученная от этих исследований будет расширяться ограниченное понимание патогенетических механизмов, которые лежат в основе нейродегенеративных заболеваний и выявить новые возможности для терапевтического вмешательства.

Прионы гипотеза утверждает, что инфекционный агент, ответственный за трансмиссивные формы губкообразной энцефалопатии (например, болезни Крейтцфельда - Якоба в организме человека, почесуха овец, хронической тратить болезни в оленя и лося и «коровьего бешенства», крупного рогатого скота ) исключительно состоит из белка и лишенный нуклеиновые кислоты¹. В прионы заболеваний клеточных прионных белков (ОТР^C) предполагает не носителями, стабильной складку (^ScPrP), высоко бета лист богатые и может самостоятельно распространять путем преобразования и вербовки мономерных PrP^C молекул в стабильной амилоид агрегатов. PrP^Sc агрегатов использовать этот самовоспроизводящихся механизм для распространения между различными клетки в организме и даже отдельных организмов².

Сворачиванию белков и агрегации также является центральным элементом большинства нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезни Гентингтона (HD) и боковой амиотрофический склероз (ALS))³. Создание сборок внутри или загородный cellular агрегированных белка в этих заболеваний тесно связан с цитотоксичность⁴ и прогрессирует дорожкам воспроизводимость и конкретных заболеваний через мозг за время^{5, 6}. Эти модели распространения предполагают, что патогенные агрегатов, связанные с этими расстройствами китовая птичка как свойства. Решительная поддержка теперь существует для передачи прионы, как агрегатов, связанные с AD, PD, HD и ALS - они распространились от ячейки к ячейке и шаблон конформационные изменения Мономерных форм же белка в ранее силе клетки^{7, 8}.

Большинство исследований, изучения распространения китовая птичка как белка агрегатов до настоящего времени были проведены с использованием модели культуры mammalian клетки, где агрегаты передачи в цитоплазме клеток наивные из внеклеточного пространства или из другой ячейки Цитоплазма^{9,10,11,12,13,14,15}, или путем впрыскивать агрегат содержащих материалов в мозг мыши и мониторинг Совокупный внешний вид вне инъекции сайте^{16,17,18,19,20,21,22, 23}. совсем недавно, трансгенные животные были использованы, чтобы продемонстрировать, что внутриклеточные агрегатов распространилась в другие ячейки в пределах нетронутыми мозги^{24,25,26,27, 28,29,30}. Здесь мы описываем метод для прямой визуализации совокупного передачи между отдельными ячейками в нетронутыми мозга Drosophila melanogaster. Дрозофилы модели HD/Хантингтона (polyQ) заболеваний были впервые разработаны почти два десятилетия назад^31,32 и предоставили много неоценимый вклад в патогенетических механизмов, которые лежат в основе этих расстройств ³³. HD является унаследованным нейродегенеративных расстройств, вызванных аутосомно-доминантной мутации в ген, кодирующий белок гентингтин (НТТ)³⁴. Эта мутация приводит расширение стрейч polyQ вблизи Htt в N-конечная помимо патогенного порог ~ 37 Глутамины, вызывая белка misfold и совокупных^35,36. Одичал тип Htt белки содержащие < 37 Глутамины в этом участке достичь их родной фолд, но может быть наведено в совокупных после прямого физического контакта с Htt совокупных «семян»^12,27,37. Мы используем этот homotypic, ядерных агрегации Htt одичал тип как индикация передачи китовая птичка как и цитоплазматических вход мутант Htt агрегатов, происходящих в других ячейках.

Определение механизмов по которой прионы, как агрегатов поездки между клеток может привести к идентификации роман терапевтических целей неизлечимым нейродегенеративных заболеваний. Мы воспользоваться преимуществом быстрого жизненного цикла, простота использования и генетических уступчивость Drosophila melanogaster определение молекулярных механизмов для распространения в ячейке мутант Htt агрегатов. Наши экспериментальные стратегии работают две системы двоичные выражения, в дрозофилы, устоявшихся вверх по течению Gal4-конкретных активации системы последовательности (Gal4-бас)³⁸ и недавно разработанных QF-QUAS системы³⁹. Соединение этих двух независимых систем позволяет ограничить выражение дикого типа и мутантов Htt трансгенов различных клеточных популяций в пределах же лететь⁴⁰. Используя этот подход, осматриваем китовая птичка как распространение мутант Htt путем наблюдения за перераспределение цитоплазматических одичал тип Htt от состояния обычно диффузного, растворимые агрегированных государству, является прямым следствием физического контакта с предварительно сформированных мутант Htt совокупных «семя». Преобразования одичал тип Htt, мутант Htt может быть подтверждено с помощью биохимические или биофизических методов, которые сообщают белок белковых взаимодействий, таких, как энергия резонансной флуоресценции передачи (ЛАДА)^9,27,41 .

Главное мы также можем получить доступ большое количество генетических инструментов у дрозофилы для идентификации генов и/или путей, которые посредником китовая птичка как распространение белка агрегатов. Недавно мы использовали этот подход раскрыть ключевую роль для клеточного рецептора поверхности мусорщика, Draper^42,43, в передаче мутант Htt агрегатов от нейрональные аксоны близлежащие фагоцитарной глии в дрозофилы Центральной нервной системы (ЦНС)²⁷. Таким образом генетические и изображений на основе - подход, который мы описываем здесь можно выявить важные основные биологическая информация о болезни соответствующие явления в простой в использовании но мощный модельный организм, дрозофилы.

1. муфта Gal4 - и QF-опосредованной Htt трансген выражение у дрозофилы

1. Собрать и/или создания трансгенных Drosophila melanogaster строк, содержащих ткани конкретных Gal4 или QF «драйверы», а также строки, содержащие одичал тип или мутант Htt трансгенов вниз по течению Gal4-Уан³⁸ или QF-QUAS³⁹. Убедитесь, что белки, которые выражаются от этих трансгенов плавленого флуоресцентные белки или эпитоп тегами для дифференциации дикого типа и мутантов Htt трансген продуктов в том же ходу. Смотрите Рисунок 1.
   Примечание: Мы обычно используем экзона 1 фрагменты человеческих генов Htt²⁷. Однако трансгенных мух вместо могут создаваться выразить больше Htt фрагменты или других генов, при желании.
2. План генетическая стратегия, таким образом, что дикого типа и мутантов Htt трансгенов будет выражаться в собственный, non перекроя клеточных популяций.
   1. Если выражение параллелизма происходит, дикого типа и мутантов Htt Белки синтезируются в тех же камерах совместно агрегировать и предотвратить обнаружение китовая птичка подобных событий. Чтобы избежать этого, используйте Gal4 и QF конкретных подавляющего, Gal80 и QS⁴⁰, соответственно (рис. 1). Выбор развивающих контролируемой Gal4 и/или QF драйверы может помочь ограничить выражение мутант Htt пост митотическая клетки, устраняя возможность что деление клеток может способствовать к ячейке совокупных распространения.
3. С помощью стандартных условий культивирования, mate мух для создания потомства, что Экспресс Мутантные популяции клеток Htt через QF (или Gal4) в «донора» и популяции клеток одичал тип Htt через Gal4 (или QF) в «получатель». Смотрите Рисунок 1 для схемы показаны возможные генетические комбинации.
   Примечание: Драйверы QF и Gal4, которые были использованы для создания данных показано на рисунках 1-4 и в нашей предыдущей публикации²⁷ включают DA1 обонятельных рецепторов нейронов (ORN) водитель, Or67d-QF и Пан глиальных водитель, репо Gal4.
4. Генерировать мух управления параллельно, что Экспресс Htt одичал тип в обоих QF - и Gal4-меченых клеточных популяций.
5. Собирать потомства желаемого генотипа, а возраст животных в соответствующих случаях.

Рисунок 1 . Генетический подход для спаренных выражение дикого типа и мутантов трансгенов Htt, с использованием систем двоичные выражения QF-QUAS и Gal4-UAS. В «ячейку A,» mCherry тегами мутант Htt белка содержащие патогенные длина polyQ стрейч (Q91) выражается с помощью QF водитель находится ниже по течению от ткани конкретной промоутера («P^A»). В «клетке B,» рекламы ЯФП тегами Htt одичал типа, содержащие нормальные polyQ стрейч (Q25) выражается через драйвер Gal4 контролируется ткани конкретной промоутера B («P^B»). На рисунках 2-4Or67d-QF был использован для привода QUAS-HttQ91-mCherry выражение в DA1 ORNs и репо Gal4 был использован для Экспресс бла-HttQ25-рекламы ЯФП всех глии²⁷. Важно отметить, что HttQ91-mCherry только выражается в QF-выражая клетки силу QUAS последовательность размещены выше по течению от трансген. Аналогично только HttQ25-рекламы ЯФП выражается через Gal4, который конкретно признает UAS. При обнаружении какого-либо дублирования в распределении ткани QF и Gal4 драйверы, трансгенов кодирования QS в Gal4-выражая клеток и Gal80 в клетках QF-выражения могут быть введены. Добавление метки флуоресцентный белок на дикого типа и мутантов Htt позволяет для дифференциации двух белков во время обработки изображений и возможность оценки ЛАДА между парами соответствующих доноров/акцептора (например, СЛП/рекламы ЯФП или рекламы ЯФП/mCherry). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. микро рассечение и фиксации взрослых дрозофилы мозги

Примечание: Эта процедура диссекции был изменен с предыдущей публикации⁴⁴и может использоваться для подготовки мозги для визуализации прямых флуоресценции сигнала от Htt флуоресцентный протеин сплавливания. Изменения в процедуры, которые могут быть сделаны для иммуноокрашивания мозги, обсуждаются в следующем разделе.

1. Соберите следующие материалы и место на льду: фосфат амортизированное saline, содержащие 0,03% Тритон X-100 (PBS/T); Microcentrifuge трубки содержащих 970 мкл параформальдегида 4% (PFA) фиксирующие раствор, приготовленный путем добавления 200 мкл 20% PFA до 770 мкл PBS/Т; Блюдо прозрачное стекло, содержащие скважины; накапайте одноразовой передачи; два рассечения щипцы (один № 3 и один № 5).
2. Анестезировать взрослых мух с помощью CO₂ и передавать их на одной скважиной стеклянную посуду на льду.
3. С помощью пипетки передачи, добавить небольшое количество (~ 500 мкл) из холодной PBS/T, чтобы хорошо содержащие мух также относительно пустой колодец. Избегайте введения слишком много пузырьков, как они могут мешать рассечение.
4. Установите стеклянную посуду на плоскую поверхность под микроскопом рассечения и отрегулируйте масштаб до летать тела заполняет поле зрения и находится в фокусе.
5. Положение пару гусиная шея источников света, так что свет освещает обе стороны стеклянную посуду. Якорь ткани сложить лаборатории под стеклянную посуду отказаться частей тела/кутикулы во время вскрытия.
6. С помощью щипцов № 3 в руке недоминирующих, передачи одной мухи в хорошо содержащие иммобилизации PBS/т., Муха, захватывая провести ее живота с вентральной стороне, обращенной.
7. Сохраняя лету полностью погруженной в PBS/T, удалите летать голову пинцетом № 5 в доминирующей рукой. Вставьте один подсказки этого щипцы под кутикулы в небольшом пространстве, прилегающих к Хоботок на одной стороне покупать головы. Закрепите ручку на голове, щипать пинцет, чтобы схватить глаз от обеих сторон.
8. Удалите летать голову из своего тела, потянув за два щипцы друг от друга. Распоряжаться летать тела на ткани лаборатории расположены поблизости. Поддерживайте давление на доминирующей рукой пинцет, так что покупать головы не теряется.
9. Один наконечник позиция № 3 щипцов в недоминирующих рука же небольшом пространстве под кутикулой на другой стороне Хоботок. После того, как размещены, щепотка щипцы для захвата глаза в том же месте по обе стороны головы.
10. После того, как сцепление на кутикулу является безопасным, осторожно, потяните щипцы были друг от друга на 180°. Это действие будет разбить голову Кутикула без повреждения мозга. Отказаться от кутикулы остатков на ткани лаборатории.
    1. Хотя идеальным, головы кутикулы не могут быть полностью удалены в один шаг. В этом случае удалите кутикулы, кусок за куском, пока мозг полностью разоблачил. Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг, избегая прямого контакта с щипцами.
11. Удалите расчлененных мозга от PBS/T захвата ahold прилагаемый трахеи, или аспирационных мозга в пространство между щипцами советы действием капиллярных.
    Примечание: Удаление трахеи является необязательным, как правило, не заслонять усиков лопастями на передней поверхности головного мозга, где мы обычно изображения. Однако если трахеи вмешиваться с работой с образами, удалите их тщательно так, что мозг не поражен этой манипуляции.
12. Перевести весь мозг в один из microcentrifuge пробирки, содержащие фиксирующие решение на льду. Убедитесь, что мозг отсоединяется от щипцы и погружен в решении фиксирующие.
13. После того, как все мозги были расчленены, подвергать их «короткий исправить», поместив закрытые трубы на nutator для ~ 5 мин при комнатной температуре в темноте.
    Примечание: Этот шаг короткий фиксацию гарантирует, что мозги легче обрабатывать последующие шаги и не придерживаться стороны пробки microcentrifuge.
14. Большинство фиксирующие решения с пипеткой P1000 снимите и выбросьте его.
    1. Избегайте аспирационных мозги из трубки в течение этого и любых последующих мыть шаг. Установите P1000 низкой громкости (например, 650 мкл) и удалить супернатант в два этапа. Кроме того удерживая microcentrifuge трубы в соответствии с источником света (например, верхний свет) аспирационных лучше визуализировать мозги.
15. Добавьте 1 mL свежих PBS/T в мозг. Помыть быстро (< 1 мин) в темноте, аспирационная супернатант от мозги и отбросить.
16. Повторите стирка с PBS/T в темноте при комнатной температуре в соответствии со следующим графиком: 2 стирок быстро (< 1 мин), 1 X 5 мин, 3 X 20 мин и 1 X 1 h мыть. Безопасный топы на microcentrifuge трубы и трубы на nutator между моет.
    1. По желанию DAPI окрашивание, заменить окончательное 1 h мыть с 1 X 30 мин инкубации с 250 нг/мл DAPI разводят в PBS/T, следуют 2 X быстрый и 1 X 20 мин смывки.
17. После последнего вымыть удалить большинство супернатант буфера мытья, стараясь не нарушить мозги и добавьте 30 мкл Реагента на основе глицерина antifade мозги. Инкубируйте на 4 ° C в темноте без движения, по крайней мере 1 час и до 24 часов.

3. изменения к разделу 2 для взрослых иммуноокрашивания мозги

Примечание: Используйте этот протокол для визуализации не флуоресцентные белки или флуоресцентный протеин сплавливания с слабой флуоресценции.

1. 10 раз увеличить концентрацию Тритон X-100 в PBS/T (PBS + 0,3% Тритон X-100) для каждого шага. Это гарантирует, что достаточно посуды присутствует разрушения мембран клеток и позволить антитела для доступа к внутриклеточной запрещено.
2. Исправить мозги в 4% ПФА в PBS/T для 20 мин при комнатной температуре.
3. После выполнения всех моет, Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре в темноте мозги в свежеприготовленные блокирующем буфере (PBS/T + 5% нормальной козьего сыворотки (НГС)).
4. Снимите и выбросьте блокирующий буфер. Добавить 0,5 мл раствора первичного антитела на трубки, подготовленных как мастер смесь путем разбавления первичных антител в соответствующих случаях в свежих блокирующем буфере (см. Таблицу материалы для часто используемых антител и разведения). Инкубируйте мозги в первичных антител на nutator для по крайней мере 24 часа при температуре 4 ° C в темноте.
5. Удаление основного антитела решения из мозга с помощью P1000 и заповедника в свежий трубки. Добавьте 1 mL PBS/T, чтобы промыть мозги.
   Примечание: Зарезервированные основное антитело раствор может храниться при температуре 4 ° C на срок до четырех недель. Мы успешно восстановленный первичного антитела до два раза в последующих экспериментах.
6. Промыть мозги быстро (< 1 мин) в PBS/T, аспирационная супернатант от мозги и отбросить. Еще раз повторите этот быстрой стирки.
7. Продолжить Стиральная с 1 мл PBS/T при комнатной температуре в соответствии со следующим графиком: 1 X 5 мин, 3 X 20 мин и 1 X 1 h мыть. Безопасный топы на microcentrifuge трубы и трубы на nutator во время мойки.
8. После последнего вымыть, удалить большинство супернатант PBS/T и добавить 0,5 мл раствора вторичного антитела, подготовленных как мастер смесь путем разбавления антитела в соответствующих случаях в свежих блокирующем буфере (см. Таблицу материалы для часто используемых антитела и разведения). Инкубируйте мозги в вторичные антитела для 24 ч при температуре 4 ° C в темноте.
9. Повторите шаги мыть в шагах 3,5, 3,6 и 3,7 после инкубации с вторичные антитела.
10. После окончательного вымыть удалить часть буфера мытья и убедитесь, что все мозги расположены в нижней части трубки. Добавьте 30 мкл Реагента antifade мозги. Инкубируйте на 4 ° C в темноте без движения за 16-24 ч.

4. весь мозг монтажа

1. Место стекло микроскопа под микроскопом рассечения и этикетка с идентифицирующей информации.
   Примечание: в качестве альтернативы, мозг может быть установлен непосредственно на Стекло покровное для доступа к обе стороны мозга во время визуализации. Протокол, описывая эта процедура установки была ранее опубликованные⁴⁵.
2. Удаление мозги из пробирки microcentrifuge, используя кончик притупляются пипетки (подготовлен с использованием лезвие для удаления нижней ~ 1 см от кончика 1-200 мкл) и передачи их в середине слайда. Передача как мало antifade реагента с мозги как можно скорее.
3. Используйте щипцы для расположения мозги в желаемой ориентации (например, спинной, указывая в направлении верхней части слайдов и передней поверхности вверх для визуализации усиков лепестка). При ориентировании мозги, рассмотрим светового луча Микроскоп, чтобы использоваться для визуализации их.
4. Удалите излишки реагента antifade из слайдов, используя острый угол ткани сложить лаборатории не нарушая мозги. Пусть слайд сидеть за ~ 5-10 мин в темноте, чтобы позволить мозги, чтобы присоединиться к слайду.
5. Окружают летать мозги с четырех небольших части сломленного стекла крышка, размещены на каждой стороне мозги, чтобы сформировать квадрат это ~ 19 мм х 19 мм. место один край стекла Обложка 22 x 22 мм № 1,5 просто вне одно из этих кусочков стекла и аккуратно опустите coverslip над мозги, чтобы завершить мост гора.
6. Медленно распределять свежий antifade реагент для заполнения поверхности под coverslip, стараясь не нарушить coverslip или мозги. Стереть любой избыток antifade, используя острый угол ткани сложить лаборатории без напрямую связаться с coverslip.
7. Добавьте каплю ясно, быстросохнущий лак для каждого из четырёх углов coverslip. Дайте высохнуть на ~ 10 мин. Затем уплотнение края четыре coverslip с Лак полностью подложить умы.
8. Изображения мозга немедленно, или хранить при 4 ° С до готовности.
   1. Если визуализация внутренней флуоресценции из НТТ флуоресцентный протеин сплавливания, изображения мозги в течение 24 h для лучший сигнал.

5. обработки изображений и количественного определения передачи прионы, как агрегатов

1. Изображения монтируется мозги с использованием Конфокальный микроскоп оснащен 40 X или 60/63 X нефти цель собрать z фрагмент изображения через регион головного мозга, где выражаются выбранные драйверы Gal4 и QF (рис. 2A, B).
   1. Возбуждают флуоресцентный протеин сплавливания или полученных белков, используя соответствующие лазеры (например, 488 нм для GFP/рекламы ЯФП/FITC или 552 Нм для mCherry/Cy3). Настройка обнаружения windows, которые захватывают максимальная люминесцентных сигнал устраняя канала кросс talk с помощью либо спектральных обнаружения системы или группы/Лонг пройти выбросов фильтры специфические для каждого Флюорофор.
      Примечание: Будьте внимательны при визуализации белка агрегатов. Это легко для пикселей в центре каждого агрегата для насыщения, особенно в крупных агрегатов. Попытка уменьшить насыщенность изображения, но осознавать риск потери сигнала от небольших агрегированных видов (рис. 2B, C, D). Слишком много насыщенности увеличит фон изображения, что делает его более трудным для определения изолированных puncta. Тестирование различных изображений настройки для оптимизации до принятия окончательного изображения в каждом наборе данных.
2. Анализ данных путем определения количественных показателей отдельных puncta, либо вручную путем перемещения через отдельные z фрагменты (например, Рисунок 2C и Рисунок 4A) или после рендеринга конфокальный ломтики в 3 измерениях (рис. 3 A, B).
   Примечание: Это может быть сделано в J изображение или другой обработки изображений программное обеспечение.
   1. Если агрегаты хорошо разделенных и есть минимальный фон флуоресценции, используйте программное обеспечение для анализа изображений для систематического выявления, количественной оценки и анализа агрегатов как собственный «объектов» или «поверхностей» в 3D-реконструкции (конфокальный стека Рисунок 3 B).
      Примечание: Описанные действия программного обеспечения являются специфическими для инструмента и программное обеспечение, используемое здесь (см. Таблицу материалов).
      1. Визуализируйте конфокальный z серии в режим 3D-просмотра. Мастер «Анализ» позволяет определить отдельные места в выбранном канале (например красный канал для HttQ91-mCherry агрегатов на рис. 3). Настройка порога и фильтры, чтобы точно представлять все агрегаты гетерогенно размера как отдельные объекты в изображении.
      2. Включите «Split объектов» под «Двоичной обработки предварительный фильтр «отделить тесно связанные агрегатов, которые они объединяются алгоритмом программного обеспечения. Обратите внимание, что общее количество объектов и их связанные измерения сообщается под «Измерения».
         Примечание: Этот метод количественной оценки мутант Htt агрегатов не поддаются протокол иммуноокрашивания потому что центр амилоида агрегатов, непроницаемой для антител. В результате агрегаты появляются на микроскопе как кольцо как структуры, и программное обеспечение для анализа изображений не может точно идентифицировать и отличать эти отдельные «пятна».
   2. Количественно одичал тип Htt агрегатов вручную перемещая через z стек и скоринг агрегатов Htt одичал типа, убедившись, нет агрегатов двойной забил если они появляются в более чем один ломтик (рис. 4A).
      Примечание: Этот подход ручной количественной оценки может использоваться, когда количество агрегатов в каждому конфокальных стека является разумным (например, 20-50). Это также полезно, когда программное обеспечение для анализа изображений не может различать отдельные puncta от окружающих сигнал в том же канале (например, сигнал из диффузных Htt одичал тип в близлежащих клеток) (Рисунок 2B, C и Рисунок 4 A). Количественная оценка одичал тип Htt агрегатов также может быть сложным по потому, что многие нормальные структуры головного мозга появляются пунктата (например, процессы клеток и синапсы). Совместное локализации одичал типа и мутантов Htt сигналов можно использовать в качестве критерия отбора; Однако вполне возможно, что некоторые черепашки Htt «семена» падает ниже предела обнаружения конфокальный. Белок помимо Htt, не подлежащей статистической обработке в получателя ячейки (например, GFP) может использоваться для обозначения несвязанных пунктата структур головного мозга.
3. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для выполнения дальнейших характеристика отдельных агрегатов. К примеру определить распределение по размерам агрегатов (рис. 3C), процент локализации совместно между мутант и белки Htt одичал типа (рис. 4A), или непосредственно измерить белок белковых взаимодействий с использованием ладу) Рисунок 4 B).
   1. Определите размер распределение отдельных puncta, с использованием алгоритма обнаружения пятно или поверхности, который точно идентифицирует все видимые агрегатов в определенном канале. Использовать программное обеспечение для анализа изображений принять соответствующие измерения пятна или поверхностей, например получить «совокупный диаметр» (рис. 3 C), «том», или «интенсивности» информация «Измерения» в мастере «Анализ» программного обеспечения, описанный в шаге 5.2.1.
      Примечание: На рисунке 3C, мы сообщаем распределения диаметров для всех HttQ91-mCherry puncta, определенных в одном glomerulus DA1.
   2. Определите процент локализации совместно между HttQ25-рекламы ЯФП и HttQ91-mCherry агрегатов вручную перемещая срез по срез конфокальный z стека (наиболее точный метод). Однако заботиться не рассчитывать любой агрегатов дважды. Чтобы предотвратить это, только количество агрегатов в частности z срез если плоскость фокуса через центр агрегата (рис. 4A).
   3. Рассчитайте эффективность ладу индуцированных HttQ25-рекламы ЯФП агрегатов с colocalized HttQ91-mCherry сигнал, с помощью метода Фотообесцвечивание акцептора.
      1. Во-первых Устраните потенциальные помехи между каналами рекламы ЯФП и mCherry путем создания обнаружения windows для mCherry- и только для рекламы ЯФП сигналов, которые производят не сигнал, в другой канал. Используя эти параметры, возьмите «образ» отдельных HttQ25-рекламы ЯФП puncta и их связанные HttQ91-mCherry сигнал ( рис. 4B) до.
      2. Затем, photobleach mCherry сигнал, регулируя красный лазер (например, 552 Нм) до 100% интенсивности и сканирования до тех пор, пока сигнал нет. Вернуться к параметрам, используется для «образ» до и принять «после образ» же puncta (Рисунок 4B).
      3. Вычислите измерения интенсивности флуоресценции для каждого punctum, до и после Фотообесцвечивание, с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
      4. Рассчитать эффективность ладу путем вычитания рекламы ЯФП доноров флуоресценции измеряется в «образ» до (рекламы ЯФП_{первоначальный}) от рекламы ЯФП доноров флуоресценции в изображении «после» (рекламы ЯФП_{окончательный}). Разделите это значение рекламы ЯФП_{окончательный}и умножить на 100.
         Примечание: Эффективность лад может быть рассчитана, пиксель в пиксель или общий для каждого HttQ25-рекламы ЯФП агрегата (Рисунок 4B). Акцепторной Фотообесцвечивание является особенно полезным методом для расчета эффективности ладу, при достаточно высокой производить обнаружению рекламы ЯФП dequenching после mCherry Фотообесцвечивание mCherry сигнал, связанные с каждой HttQ25-рекламы ЯФП punctum.

Описанные здесь методы производить надежные данные демонстрации китовая птичка как передача Htt белка агрегатов от населения одной ячейки в другую в неповрежденной летают ЦНС. Преобразование Htt одичал тип диффузного пунктата наблюдается прямой флуоресценции этой рекламы ЯФП синтез белка в получателей глии в результате HttQ91-mCherry выражение в ORNs доноров (рис. 2A-C и рис. 4A, B). Точной отчетности события передачи китовая птичка как между этими двумя клеточных популяций требует тщательного отбора трансгенной мух и Gal4/QF водителей производить сильное выражение уровня мутантов и одичал тип Htt трансгенов без какого-либо дублирования во время развития или в зрелом возрасте. Кроме того продуманный дизайн трансгенов фьюжн флуоресцентный белок Htt можно включить мощной течению анализы. К примеру, мутант и одичал тип Htt агрегатов может быть количественно как пунктата объектов либо вручную (рис. 2C и рис. 4) или с помощью программного обеспечения для анализа изображения (рис. 3, B), могут быть измерены и характеризуется как совокупного населения (рис. 3C), можно оценить для совместного локализации между мутант и белки одичал типа (рис. 4A) и может быть проанализирован на ладу²⁷ (Рисунок 4 B). Эти анализы требуют фьюжн дикого типа и мутантов Htt флуоресцентный белок Теги с достаточно разделенных флуоресценции свойства, но с достаточно спектрального наложения для включения Лада между доноров и акцепторов пары (например, СЛП/рекламы ЯФП⁹ или рекламы ЯФП/mCherry²⁷).

Рисунок 2 . Конфокальный изображения китовая птичка как конверсии глиальных HttQ25-рекламы ЯФП в нейрональных агрегатов HttQ91-mCherry. (A) максимальная интенсивность проекция ~ 30 мкм конфокальный срезов показаны одной доле усиков от мужчины летать, выражая HttQ91-mCherry (красный) в аксонов DA1 Орн, используя Or67d-QF и HttQ25-рекламы ЯФП (зеленый) в глии, используя репо Gal4. Приблизительные границы усиков лепестков и DA1 glomerulus, где DA1 Орн аксоны прекратить, обозначаются точками и сплошной линии, соответственно. (B) максимум интенсивности проекции от ~ 20 мкм конфокальный срезов показаны увеличенное представление DA1 клубочковых региона от A. (C) A в один 0,35 мкм конфокальный срез показаны один HttQ25-рекламы ЯФП puncta и его связанные сигнала (HttQ91-mCherry изображается в виде стрелки в каждом канале). Сигнал в красный канал был расширен, чтобы визуализировать Сопредседатель локализации между HttQ25-рекламы ЯФП и HttQ91-mCherry сигналов. Все изображения были приобретены с помощью цель масло 40 X 1.4NA. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 . Трёхмерный анализ HttQ91-mCherry агрегатов в DA1 Орн аксоны. (A) 3D изображение HttQ91-mCherry агрегатов, выраженная в DA1 glomerulus через Or67d-QF, с использованием тех же данных, показано на рисунке 2B. (B) скриншот с указанием отдельных объектов или «пятна» определены из необработанных данных в (A) с использованием программного пакета анализа изображения. Программное обеспечение определено 56 объектов разных размеров в этом изображения канала. Пятно, обозначается стрелки (B) был измерен иметь диаметр ~ 1,2 мкм. стрелки указывают на места, где два объекта неточно объединяются в одном месте, программного обеспечения, вероятно, из-за близости индивидуальных puncta. Чтобы преодолеть это, ограничивание различные параметры должны испытываться в программном обеспечении и/или объединенные пятна должны быть разделены вручную, если это возможно. Масштаб баров = 10 мкм. (C) гистограммы, показывающий распределение диаметров измеряется программного обеспечения для HttQ91-mCherry «пятна» показано в пункте (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 . Совместное локализации и анализ ладу индуцированных HttQ25-рекламы ЯФП агрегатов. (A) A монтаж 4 отдельных 0,35 мкм конфокальный z ломтики от мужчины летать мозга выразив HttQ91-mCherry в ORNs DA1, используя Or67d-QF и HttQ25-рекламы ЯФП глии, используя репо Gal4. Сигналы были скорректированы таким образом, что видны даже небольшой HttQ91-mCherry агрегатов и индуцированных HttQ25-рекламы ЯФП агрегатов выделяется из окружающих рассеянного сигнала. Ломтики показано отделенных друг от друга ~ 1.0 мкм (номер слайса, указывается в нижнем правом углу слияния изображений) так, что можно наблюдать несколько агрегатов. Стрелки указывают HttQ25-рекламы ЯФП puncta, которые были полны решимости быть в или возле фокус в этой конкретной z срез вручную перемещая через z стек. Из семи HttQ25-рекламы ЯФП puncta, указанных здесь, шесть связаны detectably HttQ91-mCherry сигнал (т.е., 86% агрегатов HttQ25-рекламы ЯФП совместно локализации с HttQ91-mCherry). Обратите внимание, что сигнал mCherry, связанные с HttQ25-рекламы ЯФП puncta часто слабее, чем большинство mCherry позитивных puncta в DA1 glomerulus. Шкалы бар = 5 мкм. (B) A HttQ25-рекламы ЯФП/HttQ91-mCherry-co локализованных punctum перед (левой панели) и после (справа панели) mCherry (акцептор) Фотообесцвечивание. Обусловленное этим увеличение рекламы ЯФП (донор) флуоресценции была использована для пиксель в пиксель ладу эффективности (_effладу) изображение с помощью плагина AccPbFRET для ImageJ⁴⁶. Этот частности агрегат имеет общий лад_eff 61%. Шкалы бар = 1 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Как числа пациентов, страдающих от нейродегенеративных заболеваний продолжает расти, существует настоятельная необходимость более глубокого понимания молекулярный патогенез этих заболеваний, так что лучше терапии могут быть разработаны. Здесь мы описываем методы, которые позволяют для мониторинга передачи прионы, как агрегатов патогенных белка между различных типов клеток в организме модель, Drosophila melanogaster. Недавно мы использовали эту методологию продемонстрировать передачи китовая птичка как мутант Htt агрегатов в естественных условиях и для определения фагоцитарной рецепторов, которая опосредует распространения этих агрегатов от нейронов для ГЛИА²⁷. Наш подход использует несколько преимуществ использования дрозофилы для изучения генетических заболеваний человека: его короткий жизненный цикл и обширные генетический набор инструментов, которые могут ускорить открытие базовой биологической информации, что терапевтически соответствующих.

Методы, мы опишем здесь предлагают два основных преимущества перед другими существующими животных и клеточной культуры модели для передачи китовая птичка как: (1) объединения возбудителя (например, мутант Htt) производится в ячейке, проживающих в неповрежденной ткани и (2) выражение обычно сложить версии же белка (например, одичал тип Htt) в отдельной ячейке населения предоставляет легко доступной «репортер» китовая птичка подобных событий. Мы достигли выражение мутант и одичал тип Htt белков в non перекроя популяции клеток в пределах же организма с помощью сложных генетических средств, которые хорошо известны в дрозофилы⁴⁰. Потому что много различных тканей конкретных Gal4 QF драйверы и легко доступны, изучения китовая птичка как передачи между по существу любых типов различных клеток в организме летать возможно.

Важным компонентом подхода является достижение сегрегированных выражение мутант и одичал тип Htt белков в различных клеточных популяций в то же самое животное. Выражение параллелизма необходимо устранить, чтобы одичал тип Htt агрегации в получателей клетки точно сообщает цитоплазматических проникновения прионы, как агрегатов, происходящих в донорских клеток^{9,12,27, 41}. Это может быть достигнуто путем введения дополнительных генетических инструменты (например, Gal80 и QS подавляющего⁴⁰) для смягчения этой проблемы. После идеальной генотип разработан и выбран, необходимо создать систематический метод количественной оценки puncta. Во многом это будет зависеть количество ячеек, которые помечены, количество агрегатов, которые появляются и соотношение сигнал шум образца. Такие критерии, как сопредседатель локализации и/или позитивный лад может использоваться для анализа данных, как мы описали здесь на рисунке 4. Однако ограничивая выбор одичал тип Htt агрегатов на базе этих функций может привести к недооценка китовая птичка как передачи событий, так как некоторые черепашки совокупных семена Htt может падать ниже предела обнаружения конфокального микроскопа.

В естественных условиях описанный подход здесь не является эксклюзивной для китовая птичка подобное поведение агрегатов, связанные с HD или даже других polyQ заболеваний. Трансгенные мухи могут быть разработаны для изучения китовая птичка как распространение альфа-Synuclein в PD, Тау в AD и SOD1 или TDP-43 в ALS, используя ту же парадигму экспериментальной. Для каждого из этих белков подверженных агрегации мутант должна выражаться в клеток донора и растворимых версия же белка что только агрегатов, когда способы должны быть выражены в получателей клеток. Эта экспериментальная парадигма также может быть полезным для изучения возникающих идею, что патогенные белки, связанные с различными заболеваниями могут взаимодействовать через механизм кросс сидинга⁴⁷. Наконец множество генетических инструментов, имеющихся в дрозофилы может применяться для расследования и идентификации молекулярных механизма(ов), лежащие в основе цитоплазмы в цитоплазме распространения патогенных белка агрегатов, связанные с этими смертельных заболеваний.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы благодарим членов Kopito, Luo и Пирс лабораторий для многих полезной дискуссии в ходе разработки этих методов. Мы также благодарим Брайана Temsamrit для критических чтении этой рукописи. Эта работа была поддержана средств от университета наук и W.W. Смит благотворительных фондов.