Tavşan sklera bir araç olarak ikinci harmonik üretimi sinyalleri tedavi doku (TXL) için miyopi Cross-linking değerlendirilmesi için

Bu protokol kimyasal ikinci harmonik üretimi görüntüleme ve diferansiyel kalorimetre taramakullanarak tavşan sklera cross-linking değerlendirmek için teknikler açıklanır.

Yapısal proteinler (fibriler collagens) tedavisi için içine kimyasal bağları (enzimatik olmayan cross-linking) tanıtarak doku güçlendirmek için yöntemleri fotokimyasal cross-linking ve doku (TXL) yöntemleri cross-linking içerir. Mekanik doku özellik değişikliklerini inducing için tür yöntemler için kornea Keratokonus gibi ilerici miyopi, sklera gibi hastalıklarda kornea incelme (mekanik olarak zayıflamış) nerede inceltme ve arka zayıflaması istihdam olmak sklera oluşur ve büyük olasılıkla Aksiyel uzaması için katkıda bulunur. Böyle doku güçlendirilmesi için birincil hedef proteinler Kuru Ağırlık proteinler kornea ve sklera büyük çoğunluğu oluşturan fibriler collagens vardır. Tesadüfen, fibriler collagens ikinci harmonik üretimi sinyalleri doku ekstrasellüler alanda ana kaynağıdır. Bu nedenle, kollajen proteinlerin bu terapiler, cross-linking ile indüklenen gibi değişiklikler potansiyel olarak algılanabilir ve ikinci harmonik üretimi mikroskobu (SHGM) kullanımı ile quantitated. SHGM izleme bir kızılötesi uyarma ışık ile birleştiğinde mikroskobu sistem tarama bir lazer kullanılarak sinyalleri Biyomedikal bilimlerde yaygın kullanımı zevk heyecan verici bir modern görüntüleme yöntemi kaynağıdır. Böylece, mevcut çalışma ölçmek için bir yol cross-linking etkileri ex vivo tavşan sklera, bir kimyasal ajan (sT), alt-bilir'ın uzaya cross-linking enjeksiyonu takiben indüklenen gibi SHGM mikroskobu kullanımını değerlendirmek için yürütülen bir enjeksiyon yaklaşım yani oküler anestezi Oftalmolojik klinik işlemler sırasında neden için standart bir uygulama. Kimyasal ajan cross-linking, sodyum hydroxymethylglycinate (SMG), kozmetik koruyucu ajanlar (FARs) serbest formaldehit bilinen bir sınıf geliyor. SHG sinyalleri artışlar scleral değişiklikleri SMG ile reaksiyonu takip sonuçlandı ve vardiya termal denatürasyon sıcaklık ile ilişkili, değerlendirmek için standart bir yol etkileri cross-linking doku indüklenen.

İlerici miyop öne enzimatik olmayan scleral (fotokimyasal ve/veya kimyasal), cross-linking yoluyla tedavi edilebilir olması için verilen bu kollajen enzimatik cross-linking engelleme deneysel formu yoksunluk (FD) artırabilir hangi mantıklı-indüklenen miyopi¹. Elsheikh ve Phillips² son zamanlarda ele fizibilite ve standart ultraviyole-bir ışınlama (UVA) kullanarak potansiyel-riboflavin aracılı fotokimyasal (Dresden protokolü olarak da bilinir) kısaltılmış cross-linking burada (riboflavin CXL) olarak miyopi Aksiyel uzama durdurmak posterior scleral istikrar için. Fotokimyasal bu yöntem başarıyla istikrarsızlık Keratokonus ve post-LASIK keratectasia görülen anterior küre yüzeyi (Yani, şişkin kornea) tedavisi için kullanılır. Ancak, bu CXL iletişim kuralı sklera için uygulanması gereken çok daha büyük doku yüzey alanı değiştirmek için yanı sıra bir ultraviyole (UV) ışık kaynağı ile posterior sklera erişim zorlukları ile ilgili sorunlar tarafından engelliyordu. Birden çok arka sklera bölgelerinde ki çalışma³birden çok ayrı ışınlama bölgelerinde gerekli, ancak söyleniyor, CXL yaklaşım görsel biçimde Aksiyel uzama durdurmak için oluşturulduğunu tavşan (tarsorrhaphy tarafından), yoksun. Buna karşılık, enjeksiyon sT alanı üzerinden kimyasal teskin ajan (Yani, cross-linking agent) UV ışık kaynağı tanıtmak için ihtiyaç kaçınarak posterior sklera değiştirmek için daha basit bir yolu temsil edebilir. Bu enjeksiyon tekniği iyi katarakt cerrahisi^4,5,6gibi Oftalmolojik yordamları sırasında oküler anestezi inducing kullanışlı bir yol olarak bilinir. Wollensak⁷ daha önce gliseraldehit (bir kimyasal cross-linking agent kavramına benzer bu çalışmada açıklanan ajanlar (FARs) serbest formaldehit için) kullanarak bir sT enjeksiyon kullanımı nitelendirdi tavşan sklera ve genipin sıkın için vardır FD eskiden şiling şimdi pigs^8,9Aksiyel uzunluğu sınırı gösterilmiştir. Bu müfettişler çözünür bir kimyasal ajan üzerinde fotokimyasal CXL tekniği kullanarak açık bir avantaj gösterdi. Böylece, scleral enjekte edilebilir bir kimyasal ajan FARs (Yani, TXL) dahil olmak üzere bazı tip kullanarak cross-linking¹⁰, scleral uzama miyopi içinde görülen ilerlemesini durdurmak için uygun tedavi yöntemi verebilir.

Burada sunulan iletişim kuralları kadavra tavşan gözler sklera için sT enjeksiyon yolu ile teslim bir kimyasal cross-linking çözümü sodyum hydroxymethylglycinate (SMG), kullanın. Biz daha önce topikal kimyasal kornea cross-linking için benzer iletişim kuralları hayata geçirdik. Özellikle daha önce bildirilen bu çalışmalarda, konsantrasyon etkileri cross-linking bağımlı SMG, o şeyden de termal denatürasyon analiz^{11 tarafından belirlenen fotokimyasal CXL ile ulaşılabilir kapsayan etkisi aralığı kullanarak elde} .

Burada sT enjeksiyonları scleral doku, termal denatürasyon diferansiyel tarama Kalorimetre (DSC) ve ikinci harmonik üretimi mikroskobu (SHGM) kullanarak üzerinden teslim SMG cross-linking etkisini değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar.

Diferansiyel tarama Kalorimetre (DSC), Termal Analiz olarak da bilinir, bir termal denatürasyon geçiş, scleral doku olduğu çoğunlukla onlar toplu çoğunluk teşkil beri fibriler collagens özellikleri tarafından destekli ölçülür protein. Bu yöntem kollajen moleküler yapısı kararlılığını ve kollajen liflerinde, asıl Tersiyer protein yapısı stabilize çapraz bağlı Tahvil değerlendirir. DSC içinde Isıtma sırasında kritik geçiş sıcaklığı denatürasyon kollajen molekülünün üçlü sarmal, ne jelatin yaygın formları bir süreç, sökme ortaya çıkan sonuçları elde edilir. Bu termal denatürasyon kollajen molekülü boyunca hidrojen bağları bozan ve daha yüksek sıcaklıklara indüklenen cross-linking yöntemleri^12,13arası kaymıştır. Bu yöntem özellikle Biyomalzeme sektöründe uzun yıllar için ve deri-yapma içeren işlemler için kullanılmıştır. Ancak, bu yöntem sklera doku çıkarılması gerektirir ve bu nedenle sadece bir ex vivo teknik olarak yararlı olabilir.

İkinci harmonik üretimi mikroskobu (SHGM) ile sigara centrosymmetric moleküler ortamlar belirli malzemelerin doğrusal olmayan optik özellikleri temel alır. Tür malzemelerin, yoğun ışık, örneğin ışık lazerler tarafından üretilen, olay ışık frekans katıdır SHG sinyalleri üretir. SHG sinyalleri oluşturmak için bilinen biyolojik kollajen, mikrotübüller ve kas myosin malzemelerdir. Örneğin, kollajen 860 nm dalga boyu bir kızılötesi ışık ile heyecanlı-ecek göndermek 430 nm dalga boyu ile görünür aralıktaki bir SHG sinyal. İkinci harmonik üretimi (SHG) sinyal görüntüleme tedavi kollajen cross-linking değerlendirmek için umut verici bir yöntemdir. Bu dokularda kollajen liflerinde SHG sinyalleri¹⁴yayarlar 30 yıldan fazla zamandır. Ancak, yakın zamanda yüksek çözünürlüklü görüntüleri¹⁵ dokular, tendon¹⁶, Cilt, kıkırdak¹⁷, kan damarlarının¹⁸, dahil olmak üzere çeşitli ve kollajen jelleri¹⁹elde edilebilir.

Bu bilgiye dayalı, bu çalışmada kollajen kimyasal olarak indüklenen SMG cross-linking aracılığıyla sklera indüklenen SHG sinyal değişiklikleri değerlendirir. Sonuçları, sklera SMG değişiklik doku kollajen lif demetleri (kollajen liflerinde oluşan yüksek sipariş dördüncül yapı) üretilen SHG sinyalleri artırır ve ayrıca kollajen bir yapısal morfolojik değişiklik üretir gösterir fiber ağ, yansıyan fiber bundle "düzleştirme içinde."

Tüm yordamları kullanarak kadavra tavşan gözler bozulmadan outbred tavşan başkanları içinde gerçekleştirilmiştir. Bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı tüm kurumsal ve ulusal yönergeleri takip edildi.

1. hazırlanması çözümleri

1. TXL için SMG hazırlık:
   1. 1 mL 0,2 M konsantrasyon sodyum bikarbonat çözüm (NaHCO₃) çözüm 0.0165 g 1 mL distile su içinde çözünmüş NaHCO3 tozu kullanarak hazırlayın.
   2. Toz sodyum hydroxymethylglycinate (SMG) 0.1016 mg 1 mL distile su 800 mM SMG son bir konsantrasyon almak için geçiyoruz. Sodyum bikarbonat çözüm 0.1 M NaHCO₃ ve 400 mM SMG son bir konsantrasyon için ayarlayın. SMG konsantrasyonları bağlı olarak istenilen cross-linking etkisi. Burada açıklanan protokolünde 40, 100 ve 400 mM SMG kullanılır.

2. subTenon'ın enjeksiyon TXL SMG kullanmak için

1. İki 1 mL insülin şırınga (25 G iğneler) 400 µL kontrol ve SMG çözüm, sırasıyla doldurun.
2. Tavşan kafası profil uçağa yardımı ile bir yastık yerleştirin. Strafor veya bir kağıt yığını kafa içinde en uygun bir pozisyon düzeltmek için kullanılabilir.
3. Göz kapakları ile Pediatrik göz spekulum geri çek.
4. İlk göz içi basıncı (GiB) bir applanation tonometry aygıtı kullanarak ölçmek.
5. Bir doku işaretçisi ile işaret amaçlanan enjeksiyon limbus üst orta kısmında yer.
6. Konjonktival forseps (veya herhangi bir Forseps ile tırtıklı yuvarlak uç) ile Enjeksiyon Makinası çevreleyen konjonktiva geri çekmek ve bilir'ın kapsül biraz ötesinde işaretli limbal sitesi (Yani, 2-3 girme konjonktiva, iğne ekleme ««limbus mm'den). Konjonktiva küçük bir insizyon attım da Iris makasla bilir'ın kapsül ile iğne geçişini kolaylaştırmak amacıyla yapılabilir.
7. Bir kez bilir'ın kapsül içinde yan yana hareket ettirerek iğne serbestçe hareket eden olduğundan emin olun. Bu süre boyunca, dünya taşımamalısınız. Bu alt-bilir'ın (sT) sklera yukarıda iğne uygun yerleştirme onaylar alanı.
8. Eriyik--dan belgili tanımlık tenkıye enjekte ve iğne atın. Hemen enjeksiyonu, bir ön şişkinliği konjonktiva (örneğin, chemosis) görülen oluşturma sT alanda sıvı birikir.
9. GiB ölçüm amacıyla Dünya yanlışlıkla bir delikli nedeniyle değişmedi onaylamak için yineleyin.
10. Kapak spekulum kaldırmak ve kapalı göz kapakları ile dijital masaj yaklaşık 2-3 dakika için gerçekleştirin.
11. Baş 3.5 h bir kuluçka dönemi için bırakın (Oda sıcaklığı 18 ° C =), sonraki adıma geçmeden önce.

3. doku hazırlık

1. Dünya erişimi en iyi duruma getirmek için göz kapağı spekulum kullanarak göz kapakları geri çek. Gözün boyutuna göre en iyi şekilde büyüklükte spekulum seçin.
2. Limbus çevreleyen konjonktiva ayırın. Zaten enjeksiyon bölgesine yakın kazıma, böylece bir inoculum boyutu yaklaşık 1 x 1 cm içerecektir çepeçevre sınırlarını genişletmek.
3. Ekstra oküler kas scleral ekleme kendi sitelerinde de kes.
4. Arka taraftan bastırıyor Forseps ile göz küresi yükseltmek. Bu arka dünya erişim sağlar ve optik sinirin oftalmik arter ve ven dünyanın kutup posterior bulunan kesme kolaylaştıracaktır.
5. Corneoscleral işaretli enjeksiyon yeri de dahil olmak üzere dış kenarlığı ile karmaşık, kes. Leke hala sklera kalan kısmını görünür olmalıdır.
6. Corpus vitreus ve doku Forseps ile çekiş uygulayarak sklera iç tarafına bağlı tüm katmanları kaldırın.
   Not: Daha fazla adımlar aşağıdaki yordamları üzerinde gerçekleştirilen bağlıdır: 4. - DSC analizi, 5. - SHG mikroskobu.

4. için bölgesel DSC analizi

1. Tedavi göz için: diğer scleral bardaktan makasla kesmek enjeksiyon sitenin üst sektöründe yer alan ve merkezi olarak hizalanmış için dört scleral sektörler. Her iki yan tarafı (Yani, burun ve temporal) ve alt kalan 3 sektörlerden kesti.
   Not: daha fazla kareler (1-16) ayrılır (1-4) sektörler numaralandırma şekil 1A' gösterilmiştir.
2. Scleral sektörler (1-4) daha küçük kareler (1-16) yaklaşık olarak 4 x 4 mm her halinde kesin. Sektör 1 (enjeksiyon tam site bir bireysel kare [kare 2] olun) 9 kareler bölünmüş olmalıdır. Sektör 2 ve 3 (10-11 ve 12-13 kareler) 2 karelere ve sektör 4 (kareler 14-16) 3 karelere bölün.
3. Eklenen alanın konumunu analiz dokudan mesafe yerelleştirmek için şekil 1A', gösterildiği gibi her kareye bir numara atamak.
4. Denetim göz için: doku dört scleral sektörler (tedavi dokusu ile benzer) içine bölme doku kare parçalarını dışarı aşağıdaki konumlardan kestikten sonra: 3 kareler üst bölgeden (sektör 1), her iki tarafın (sektör 2 ve 3) ve 1'den 1 alt sektör (sektör 4).
5. Gırç kalan retina ve choroidal katmanları ve yıkama iki kez taze PBS ile her zaman çözüm için yaklaşık 10 batık adet bırakarak teker s.

5. için SHG görüntüleme

1. 1 x 1 cm alan merkezi olarak hizalanmış Enjeksiyon Makinası ile oluşturmak için makas kullanarak sklera üst kısmı kesilmiş.
2. Scrape off diğer retina ve choroid katmanları ve çözüm için yaklaşık 10 adet bırakarak her zaman iki kez taze PBS ile yıkayın s.
3. Yer 1 mL tüpler doku görüntüleme merkezine ulaşım için PBS çözüm ile dolu. Kuluçka zaman aşağıdaki ve göz küresi diseksiyon ile başlayan tüm yordamları, bir saat içinde yapılmalıdır.

6. mikroskobu Protokolü

Not: Bu iletişim kuralı için görüntüleme arka dağınık SHG sinyalini kollajen sklera doku mikroskobu tarama lazer için hazırlanmıştır.

1. Kurmak mikroskobu
   1. En üst düzeye çıkarmak için sinyal ve kararlılık ne zaman SHG mikroskobu yapmak kullanın bir objektif lens ışık ve yüksek sayısal diyafram (NA) ile kızılötesi iletimi için en iyi duruma getirmek. Bizim hedefimizdir Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 su daldırma.
   2. Coverslip, 0,17 milimetre kalınlığında örnek derinliği bu durumda eşleştirmek için lens düzeltme yaka ayarlayın.
   3. 25 x objektif lens mount ve görüntüleme yüzey örnek montaj önce karşılamak için su bazlı jel yağlama cömert bir miktar ekleyin. Su bazlı jel deneme sırasında buharlaşır değil ve bu nedenle görüntü kalitesini korur.
   4. PBS ile 1 mL tüp scleral dokudan iki 25 mm yuvarlak coverslips (episcleral tarafı aşağı) episclera ve coverslip yüzey arasında'deki sağlayan maksimal temas arasında kurutma olmadan yerleştirin.
      Not: Doku da coverslip üzerinde ele geçen yerleştirilebilir. PBS iyi bir miktar görüntüleme sırasında sulu doku tutmalı. Bu durumda, doku parçası ve PBS cellchamber montaj sonra ekleyin.
   5. Hücre odası 25 mm yuvarlak coverslip, tek yerleştirerek veya odası alt kısmında bir sandviç tekniği montaj ve mühürlü bir oda oluşturmak için aşağı üst kısmı canı cehenneme. Sıkı bir üst coverslip, yapay olarak düzleştirme önlemek ve dokusuna zarar için kullanıldığında aşağı yatmayacaksın.
   6. Hücre odası doku örneği ile mikroskop Sahne Alanı'nda bağlayın.
   7. Mikroskop görünüm iletilen ışık için ayarlayın.
   8. Sahne getirin ve örnek alt yüzeyine odakta, parlak alan muayene göz parça aracılığıyla tarafından belirlenen öyle ki amaç yüksekliğini ayarlayın.
   9. Bilgisayar monitörü hariç tüm ışıkları kapatın ve alüminyum folyo levhalar mikroskop Sahne Alanı'nda bol dökümlü ile mümkün olduğu kadar MONITOR gelen ışık engellemek. GaAsP NDD dedektörleri yüksek hassasiyet gibi herhangi bir kaçak ışık dedektörleri ulaşan en aza düşük gürültü satın alma, garanti eder.
   10. Yazılım Ti Pad panelinde objektif tanımı doğru olup olmadığını denetleyin.
   11. A1 kompakt GUI panelinde IR lazer görüntüleme için seçin, NDD dedektörleri seçin ve bir 400-450 nm bant filtre ile donatılmış DAPI kanalını seçin.
   12. 860 nm ve açık Kızılötesi Lazer dalga boyu A1 MP GUI Masası'nda ayarlanan çekim.
   13. Lazer tarama koşulları A1 kompakt GUI panelinde aşağıdaki gibi ayarlayın. Seçin: (a) Galvano inceden inceye gözden geçirmek, (b) tek yönlü tarama, (c) piksel Işınma Zamanı 6.2 µs, (d) çerçeve boyutu 1024 x 1024 piksel, (e) satır ortalama 2 x
       Not: Galvano inceden inceye gözden geçirmek ve tek yönlü tarama hassas noktasına uyum sağlar. Boyutu 1024 x 1024 tam görüş alanı için 0.5 mikron /pixel piksel boyutunu çevirir. Satır ortalama görüntü çekim gürültü azaltır.
   14. Lazer güç ve Dedektör kazanç ayarlayarak koşulları A1 kompakt GUI Masası'ndaki görüntüleme ayarla. Geçerli yansımadaki pixel yoğunluk değerleri histogramını görüntüler yukarı bak Tablo panelini (AÜSS) açın. Canlı görüntüleme "Bulmak" modunda açın ve lazer güç ve Dedektör kazanç ayarlayarak piksel aralýðý algılanan en üst düzeye çıkarmak. Doygunluk kaçının. Tipik değerlerdir 2,35 W 860, toplam % 2.5 lazer iktidardan nm ve 100 HV (Dedektör kazanç).
   15. Not: Bu kurulum için bir dahili güç metre ile ölçülen lazer 5.2 güçtür mW. Her saat bir deney gerçekleştirilir, öyle ki iç güç ölçüm 5.2 sabittir lazer yeniden yüzdeye mW görüntüleme oturumları arasında. Lazer güç ayarlarken özen gösterilmelidir. Bukalemun II lazerdir 3 W lazer 800 nm ve % 10 veya daha yüksek güç potansiyel olarak doku hasarına neden.
2. Resim alma
   1. Önizleme modunda XYZ genel bakış aracını kullanarak doku alan tarama.
   2. Düşsel hız yukarıya imge içinde bu tarz edinimi için daha düşük çözünürlük (256 x 256 piksel ve hiçbir satır ortalama) için ayarlayın.
   3. 5 x 5, 3 x 3 veya tek alanları doku tüm yüzey kapsayacak şekilde bakış yakalamak. Daha önce genel bakış yakalama her yerde canlı "Scan" modunu ve doku odak haline getirmek. Dokusunun farklı bölgelerde farklı pozisyonlar eksenel yönde olduğunu unutmayın.
   4. Nerede kollajen lifleri görüş tüm alanı görülür ve o konumda sahne o belirli konuma taşımak için genel bakış aracı çift tıklatın düz bir alan bulun.
   5. Canlı "Scan" modunu alt uçak odakta öyle ki amaç Z konumunu ayarlamak ve Ti defterinde, Z sürücü optik uçak 10-15 mikron bu alt tabaka üzerinde taşımak için kullanın.
   6. 1024 x 1024 piksel ve ortalama, "Yakala" düğmesini kullanarak 2 x çizgi ile yüksek çözünürlükte bir görüntü elde etmek.
   7. Kaydetme konumu XYZ genel bakış içindeki "+" düğmesini kullanarak. Bu doku aynı bölgede değil tekrar sağlar.
   8. Doku her parça için alanları bakış üst üste 10 çekim.

7. DSC Protokolü

Not: doku hazırlık tam, bölgesel DSC analizi için veya SHGM gerçekleştirildiğinde doku görüntüleme sonra en kısa zamanda bu adıma geçin.

1. DSC tava, tartılır ve etiketli hazırlayın.
   Not: Bu adım, doku kuruma en aza indirmek için doku diseksiyon önce yapılmalıdır.
2. Her scleral bir kare bir emici doku ile kuru ve düz dişli forseps kullanarak bir DSC pan dibinde yatıyordu.
3. Doku içinde ve kapak sıkışmasını tavayla tartmak ve kaplı doku almak için ağırlık ıslak (örnekleri kütlesi 5-11 mg aralığında olmalıdır).
   Not: Sonraki doku örneği geçmeden önce crimper kullanarak mühür her pan. Tava hermetik, Termal Analiz önce herhangi bir su kaybını önleme mühürlü.
4. Bir kez örnek sıkışmasını, belirlenen konumu DSC tepsiye yerleştirin. Denetim için 6 örnekleri ve 16 tedavi göz için olmalıdır.
5. Yazılımları yönetme, doku ağırlığını belirtme aracı kullanarak bir yöntem oluşturun ve aşağıdaki parametreleri kullanarak Termal Analiz çalıştırın: Sıcaklık aralığı 40-80 ° c, Isıtma oranı: 1 ° C/dak, ısı akışı: 17.37 mW, gaz (N₂) akış: 19,8 mL/dk, Gaz basıncı: 2,2 bar.
6. Bir kez tam, yazılımları yönetme aracı kullanarak hangi termal denatürasyon geçiş sıcaklığı zirvesinde oluşur ayıklanıyor tarafından her örnek için veri analiz.

8. görüntü analizi

1. SHG sinyal
   1. Resmin çoğunlukla kollajen lifleri tarafından işgal öyle ki en az 5-10 her tedavi ve onun kontrol en iyi temsil eden görüntülerin seçin.
   2. Her resim ImageJ yazılım yükleme ve ortalama piksel yoğunluğu seçerek ölçmek Analiz > ölçüm etkin görüntü için.
   3. Çıkarılan değerler ortalama piksel yoğunluğu bildirilir ve menüden seçerek histogram yoğunluklarını komplo tarafından da gösterilebilir Analiz > çubuk grafik.
   4. Buna göre tüm ölçülen verileri belgelemek için bir tablo oluşturmak bir Excel sheet kullanarak örnek kimliği
   5. Ortalama ve standart sapma tedavi ve kontrol her koşul için piksel yoğunluğunu hesaplamak.
   6. Öğrencinin kullanarak t-Testi, konsantrasyonları (Yani, 40 mM SMG 0 ve 400 mM SMG 0 vs vs) tüm ikili karşılaştırmalar için farkları karşılaştırın. [P≤0.05].
2. Dalgalılık
   1. Kollajen lifleri görüntüler bir görüntü seçin. Örnek başına en az 10 resim (bir denetimi örneğini her konsantrasyon - en az 40 toplam için de dahil olmak üzere) analiz edilmelidir.
   2. Açık ImageJ > Eklentiler > NeuronJ. NeuronJ önceden yüklenmiş olmasını gerektirir.
   3. Tüm imagesby açılan bir NeuronJ penceresine sürükleyerek yükleyin.
   4. Fare ile Fibriller kontur takip lifleri, doğrultuda izleme oluşturma (Tablet çizim kalem kullanılabilir), M toplam lif uzunluğu mesafeyi ölçmek için'ı tıklatın.
   5. "Teğet düz bir çizgi çizmek ve başlangıç ve daha önce çizilmiş lif dağılımı sonuna bağlamak için" seçeneği. Şimdi uçtan uca uzunluğu ölçmek için M'yi tıklatın.
   6. Resim başına en az 10 liflerinde üzerinde aynı işlemi tekrarlayın.
   7. Bu iki ölçüm her 10 liflerinde toplamak ve veri uzunluğu [eğri] ve [doğrusal], uzunluğu toplam lif uzunluğu (kontur) ve uçtan uca uzunluğu (düz çizgi bağlantı) ifade bir excel elektronik tablosu içine sırasıyla giriş.
   8. Dalgalılık Endeksi (W) formül kullanılarak hesaplanır: W = uzunluk [eğri] / [doğrusal] uzunluğu.
   9. Tedavi samples(SMG) görüntüleri kontrol örnekleri formülü kullanarak görüntüleri ile gelen verileri karşılaştırarak dalgalılık % hesaplamak: (W [SMG] - 1) / (W [denetim] - 1)
   10. İkili bir t-test dalgalılık dizin (W) için farklı tedavi koşulları ve denetim arasındaki istatistiksel farklar (p-değerler) kollajen lif morfolojisi belirlemek amacıyla gerçekleştirin.

Termal denatürasyon sıcaklık (Tm) etkisi cross-linking TXL değerlendirmek için bir tahlil yöntemi olarak: Toplam 16 çift tavşan gözler bu deneylerde TXL yordamı için kullanılmıştır. Bu çalışmanın ilk bir parçası, SMG cross-linking Agent kadavra tavşan kafası uzayda sT üzerinden tek bir enjeksiyon tarafından indüklenen cross-linking efekti yerelleştirmesini değerlendirilmiştir. Daha fazla yerde enjeksiyonları sklera istenen bir alanını dengelemek gerekli olabilir bu yana bu tür bir deney, hastaların klinik tedavisi için ilgisi yok.

Temel yayınım ilkelere dayalı tahmin gibi etkisi enjeksiyon yerinde de, bitişik bölgelerde çözümleri konsantrasyonu bağlı olarak indüklenen etkileri ile en büyük. Şekil 1A tek sT enjeksiyon ile takip ayrı termal denatürasyon analizi uygulandı scleral sektörler (1-4 kırmızı içi boş numara yazı) (daha fazla (1-16 siyah ince numara yazı) karelere bölünmüş) şematik konumunu temsil eder. renk eşleme dizini. Tablo 1 Tm değerleri karşılık gelen kendi kontrolü ile karşılaştırıldığında numaralı her sektör için değişiklik gösterir. Değerleri için 40 mM ve 400 mM iğne yer alır ve en az üç bağımsız belirlemeleri için hesaplanan ortalama, standart hata içerir.

Şekil 1B-C SMG, 40 mM (şekil 1B) ve 400 mM (şekil 1 c) iki farklı konsantrasyonlarda kullanarak sonuçları temsil eder. Şekil 1Badımında, daha düşük konsantrasyon 40 mM örnek kare 2 (enjeksiyon yeri) belirtilmişti Tm hafif bir değişim gösterdi. Benzer vardiya bitişik kareler 1 ve 3 (açık mavi) görüldü. Marjinal vardiya meydanlarda 4-6 ve 7-9 olmadan eklenen meydanından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar görülmektedir. Hiçbir Tm shift meydanlarda enjeksiyon sitesinden en uzak sektörü temsil alt 14-16, görüldü.

Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi daha yüksek konsantrasyon (400 mM) (turuncu tonları gösterilen) istatistiksel olarak son derece önemli bir cross-linking etkisi vardı. Tm büyük bir kayma ile ilişkili küçük standart sapma ve p < 0,05 gözlendi, 400 mM alt 40 mM konsantrasyon için karşılaştırıldığında etkisi büyük bir fark yansıtan. En dramatik etkileri üst dünyanın 1 sektöründe kaydedildi. Kalan sektörler ile ilgili olarak daha az bir etkisi meydanlarda 10 ve 14 (ki bazı izleme cross-linking sıvı nedeniyle özafagusu yapıyor olabilirsiniz) gözlenmiştir ve etkisi kareler 11, 12, 13, 15 ve 16 gözlendi. Genel olarak, cross-linking etkileri marjinal sektörlerde 2 ve 3 4 (Yani, enjeksiyon yeri en uzak konumdan), sektöründe gözlenen etkisi ile 40 mM örnek benzer. Bu sonuçlar bir '' bölge '' etkisi oldu ve bu tür desen bir ajan cross-linking, sT enjeksiyon takip bekleniyor olabilir göstermiştir. Bu efektler doku geniş bir alana ikna etmek için çeşitli konumlarda Enjeksiyon gereksinimini gösterebilir.

Çalışma cross-linking etkileri olduğu gibi gözünde TXL SMG iki konsantrasyonları ile değerlendirilmesi indüklenen da gerçekleştirildi. Böyle scleral cross-linking uygulandı doku analizi termal denatürasyon gerçekleştirildi. Zaman cross-linking oldu üç farklı konsantrasyonları, 40 kullanarak TXL için 3,5 h (Tm 1.11 1.2 +/-=), 100 (Tm 5.12 2,9 +/-=) ve 400 (Tm 14.34 +/-1.1 =) mM SMG. Sonuçları SMG çapraz bağlı dokularında görülen bir konsantrasyon bağımlı etki gösterdi.

Etkisi cross-linking TXL değerlendirmek için bir yöntem olarak Imaging ikinci harmonik üretimi (SHG):

İmge were SHG mikroskobu SHG sinyal ve lif paket dalgalılık piksel yoğunluğu için hem de analiz. Konsantrasyonları ('dan 40'a 400 mM) ilişkilendirerek, geniş bir yayılma etkileri cross-linking çok çeşitli üzerinde oluşabilir SHG sinyal değişiklikleri keşfetmek için kullanıldı. Fiji görüntü programı²⁰işleme dahil histogram çözümleme yeteneğini kullanarak, scleral dokusunda etkileri bu 400 mM kullanarak indüklenen 40 mm karşılaştırma sT enjeksiyonla üretilen SHG sinyal quantitate mümkündü. Ortalama piksel intesities 40 mm ortalama farkı 66,3 ± 361.4 ± 28,3 400 mM örnekleri, neredeyse 6-fold bir artış için karşılaştırıldığında 27,7 idi. Tm karşılık gelen artışlar da bu koşullar altında kaydedilmiştir bu yana bu doku ilişkilendirerek, bir artış ile karşılık gelir. Şekil 2 (şekil 2A), 40 mM (şekil 2B) ve 400 mM (şekil 2C) ele sklera temsilcisi SHG görüntüleri gösterir. Ortalama parlaklık (veya piksel yoğunluğu) de dahil olmak üzere eşlik eden çubuk grafik analiz de gösterilir. Toplam sayı-in imge analiz yapıldı: 120 40 mM ve 98 için kendi kontrolü; 121 400 mM ve 94 kendi kontrolü için. Doku görüntüleme derinliği 10-15 µm episcleral yüzeyinden yapıldı. Çok sayıda görüntü alanlarında ortalama dahil, çubuk grafik analizleri sonuçlarını etkisi (şekil 3) ilişkilendirerek, daha yüksek konsantrasyonlarda daha fazla piksel yoğunluklarda üretilen belirtti.

Şekil 4' te gösterilen, bir görüntü analizi de ''Nöron J''²¹ImageJ eklentisi kullanarak kalp-damar damar edebiyatından kabul edilen yöntemler ile gerçekleştirildi. Biz dalgalılık faktör W tahmini uzunluğu [eğri] = / uzunluğu [doğrusal] ve biz gözlenen cross-linking azalmış dalgalılık % 40 mM ve 400 mM çapraz bağlı sklera tedavi edilmezse denetim sklera karşı içinde gösterildiği gibi lif demetleri düzleştirme sonuçlandı (W % = (W [ SMG]-1)/(W[Control]-1), Tablo 2). Dalgalılık 40 ve 400 mM SMG tedavi örnekleri arasındaki farkı istatistiksel olarak anlamlı değildi.

Resim 1 : ST enjeksiyon 40 ve 400 mM SMG kullanarak TXL efekti yerelleştirmesini.
(A) 4 scleral sektörler (sayı 1-4'te büyük kırmızı içi boş yazı tipi), sklera ile şematik gösterimi bölünmüş termal analiz yapıldı (Ölçekle çizilmiş değil) kareler [numaraları 1-16 küçük siyah ince font]. Enjeksiyon yeri sektöründe 1 merkezi bir konumda bulunan kare (kare 2) için denk. Termal denatürasyon TXL (1B) 40 mM SMG ile ve etkisi (1 C) 400 mM SMG ilişkilendirerek. (D) (B) ve (C)için sıcaklık ölçeği efsane renk kodlu. Bu rakam üzerinden Zyablitskaya ve ark. izni²²ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Konsantrasyon bağımlı SHG artışlar temsilcisi görüntülerini parlaklık düzeyleri SMG sklera sT enjeksiyon yolu ile kullanarak TXL sonrasında üretilen sinyal ex vivo . SMG konsantrasyonları (B) 40 mM ve (C) 400 mM gösterilir. Her resim bir 50 µm ölçek (sağ alt köşe) bar ve ortalama piksel yoğunluğu değeri (sağ üst köşe) - mutlak değerler içerir. Bu rakam üzerinden Zyablitskaya ve ark. izni²²ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Çubuk grafik SHG sinyal piksel yoğunluğu (karşılaştırıldığında aynı tavşan kafası eşleştirilmiş bir denetimden) yolu ile sT enjeksiyon (TXL) 40 ve 400 mM SMG çözümleri ile çapraz bağlı scleral sağlam küre içinde değişim (Δ). Ortalama değerleri ile standart hata ortalamaya vardı: 66 ± 27,7 40 mM ve 400 mM için 361 ± 28,3. Bu rakam üzerinden Zyablitskaya ve ark. izni²²ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : (Doğrusallık tarafından ifade edildiği şekilde) fiber dalgalılık analizi örneği. Görüntü denetimi örneğini 40 mM SMG yoğunlaşması 50 µm ölçekli bar (sağ alt köşe). Bu rakam Zyablitskaya ve arkdeğiştirildi. izni ile²². Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : ST enjeksiyon şematik gösterim. 1-3 numaralı alanlarda şekil 1A' temsil alanlarına karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: DSC TXL etkisi çalışma yerelleştirme için sonuçlar. Termal erime sıcaklıkları (ΔTm) ile örneklenen her sektör için standart hataları değişimdir şekil 1A' tasvir. Her değer Tm ascompared farkı eşleştirilmiş kendi kontrolü için olarak ifade edilir ve en az 3 bağımsız tespitler ortalama.

Tablo 2. Fiber dalgalılık incelemenin sonuçlarını. SHG görüntüleri TXL enjeksiyon bölgesinden nöron J yazılımını kullanarak fiber dalgalılık derecesi için analiz edildi. On lifler her görüntüden seçildi ve toplam yaklaşık 100 liflerinin dalgalılık derecesi için analiz. Ortalama değerleri ile standart hata ortalamaya dahil edilir.

Yapılan deneyler sklera, gelecekteki olasılığını tedaviler cross-linking için bir izleme aracı bu tekniği kullanarak yetiştirmek etkileri cross-linking kollajen değerlendirilmesi için bir yöntem olarak SHG sinyal mikroskobu kullanımı destekleyen kanıtlar göstermiştir kollajen protein hedef. Not, bir enstrüman potansiyel olarak bu SHG sinyal yakalayabilir klinik zaten. Her ne kadar bu araç öncelikle görüntüleme cilt insan DermIS için tasarlanmıştır, bu başarılı bir şekilde görüntü kornea ve sklera²³için kullanılmıştır.

Bu aynı tarama ve denetim karşılaştırırken koşullara Imaging korumak için gerekli olan ve tedavi örnekleri. İkinci harmonik üretimi mikroskobu sklera dokusunda kollajen floresan mikroskop çok foton görüntüleme ile uyumlu gerektirir pulsed Kızılötesi Lazer 800-900 nm dalga boyu aralığı ve GaAsP gibi son derece hassas bir detektörü ayarlanabilir Sigara descanned (NDD) dedektörleri. Bu el yazması açıklanan yönergeleri bir başlangıç noktası vardır. Koşulları özellikle yeni deneyler için ya da farklı sistemleri tespit edilmelidir.

Kornea ve sklera de aynı anda bu tekniği^24,25,26,27kullanarak çalışmalarda değerlendirilir. SHG sinyal ileri ve geri yönde yayar bilerek, çeşitli çalışmalarda kornea dokusunda bağımsız olarak kendi yerel devlet^{28,29,30,31inceledik, 32,33,34} ve Keratokonus^35,36 yanı sıra aşağıdaki gibi (aşağıda açıklanmıştır) CXL. Bu çalışmaların sonuçları kornea sinyal kornea'nın şeffaflık ve ışık ileri dağınık sistemlerinde bir monitör grev doku geçtiği gerçeğini göz önüne alındığında mantıklı ileri dağınık yönünde en iyi duruma getirildiğini belirtir. Genellikle, SHG sinyal mavi görünür aralığında ve göz sklera gibi son derece saçılma doku üzerinden geçerken büyük ölçüde azalacaktır. Sonuç olarak, ileri dağınık SHG tespiti 50 mikron veya daha az içinde kalınlık yanı sıra özel optik tuzak dokusunun ince bir bölüm gerektirir. Buna ek olarak, arka dağınık sinyal floresan mikroskop normal ışık yolunu kullanarak doku kesit olmadan ele geçirilebilir ve bu nedenle bu mod derinliğe kadar 30-40 mikron sağlam sklera dokusunda kollajen Imaging ne zaman tercih edilir. Bu çalışmada, sinyal yoğunluğu bir konsantrasyon bağımlı artış kaydetti. Oldukça Ancak, TXL sklera derin katmanları üzerinde ek ve benzer etkileri olabilirdi ve etkisi-ebil var olmak daha belirgin ve özellikle yüksek konsantrasyon ile daha derin katmanları genişletmek, mümkündür. Ancak, sınırlı SHG sinyal penetrasyon sklera ve bu ilk eğitim amaçlı nedeniyle, en yüzeysel sklera (15 µm derinlik) elde edilmiştir en iyi kalitede görüntü çalışmak seçtik. Gelecekte çalışmalar, bu neden bile büyük farklılıklar olarak değildi ek önemli bilgiler sağlayabilir TXL yöntemleri aşağıdaki bağımlı etkileri 40 ve 400 mM tedavi örnekleri arasında gözlenen derinliği dikkate alacaktır.

Ayrıca, riboflavin indüklenen CXL doku cross-linking değerlendirmek için kullanımı SHG ile ilgili, SHG mikroskobu görüntüleme aşağıdaki riboflavin kornea CXL bildirilmiştir çeşitli gruplar^37,38,39 tarafından ^{, 40 , 41}. bir çalışmada tarafından Steven vd. ³⁷, '' çapraz bağlı örneklerinde görülen bir homojenizasyon '' sinyal ve kaybı doku '' kıvrımlar '' veya '' yaratılan '' kornea sabitleme CXL tekniği kullanarak sonuçlandı. Bu tür değişiklikleri, ancak, aynı zamanda IOP değişimler teknik eserler olasılığını yükseltmek kornea SHG sinyalleri üzerinde etkilerini değerlendiren bir çalışma kaydedilmiştir. Kuruluş Fibriller hem de daha yüksek sipariş fiber paket/lamel organizasyon açısından, sklera ve kornea oldukça farklıdır ve çok elektron mikroskopisi çalışmaları ile bu tür arasındaki farklar hakkında bilinir. İki doku Fibriller çapı dağılımı (küçük üniforma liflerinde sklera kornea ve değişken çap liflerinde için) ve (kornea ve sklera için değişken için tek tip) Aralık arası fibril içeren ambalaj, Fibriller açısından farklılık gösterir. De, lamel sayfaları (kornea) lif demetleri (sklera) karşı daha yüksek sipariş örgüte oldukça farklıdır. Böyle yapısal farklılıklar bu iki doku tarafından üretilen SHG sinyalleri yansıtılır. Böylece, cross-linking tarafından indüklenen değişiklikleri SHG sinyal farklı ama paralel şekilde değiştirebilir. Başka bir deyişle, '' düzleştirme '' sklera liflerinin bu çalışma ve literatürde bildirilen kornea sinyal '' homojenizasyon '' gözlenen hem kolajen değişikliği cross-linking sonucu vardı. Böylece, kornea '' homojenizasyon '' yürürlükte bir şekilde rapor burada sklera '' düzleştirme '' etkisini benzer olabilir.

TXL tarafından üretilen bu düzleştirme etkisi neden mekanizmaları geçerli çalışmaya dayanarak pek açık değildir. Bir olasılık doku bir şekilde '' tespit edildi ki '' mekanik '' yüklü '' bir konumda olabilir. Bu indüklenen fikri destek vereceğini '' Fibriller ve lif istikrar '' oluştu. Göz içi basıncı olası değişimler IOP öncesinde ve sonrasında sT enjeksiyon izlenen ve sabit kalmıştır beri bu yönde katkıda değil. Genel olarak, bu gözlemler önemini belirsiz ve daha fazla çalışmaları gerekli olacaktır. Not, ayrı Brillouin mikroskobu⁴²gibi teknikleri Imaging hangi nicel ölçüleri sağlamak için gösterilmiştir (kesme modülü tarafından belirlenen) ilişkilendirerek CXL photochemistry takip SHG bulgularla teyit yararlı olabilir Bu çalışmada görüntüleme. Ancak, kullanımı son derece saçılma doku sklera⁴³gibi ile teknik değişiklikler gerektirir ve çapraz bağlı scleral doku ile doğrulanmadı unutulmamalıdır.

Polarizasyon lazer ve SHG mikroskobu önemli bir konudur. Lazer ışığı doğrusal polarize ve dik yönde SHG sinyal yayma ve her kollajen lif için xy düzlemde bir açıyla odaklı. Böylece, daha yüksek bir SHG sinyal üretecek bu olay ışık (Yani, z-uçak), paralel dahil olmak üzere diğer açılardan daha iyi hizalanmış ve tam olarak dikey polarize lazer ışık için xy düzlemi lifler üretecektir En düşük fiyat SHG sinyal (nedeniyle yıkıcı parazit). Sklera doku ile ilgili olarak, tercih edilen anatomik fiber yönelimleri bulunduğunun bilinmesi lifler mikroskobik düzeyde, çeşitli açılarda odaklı olmakla birlikte, kollajen küre konuma göre. Üretilen SHG sinyal her lif xy düzlemi açısına bağlı olarak değişir bu yana, genel sinyal kollajen lifleri tam olarak aynı açı (içinde bir doku bir tendon gibi hizaladıysanız hangi üretilen daha az böylece, olacak Örneğin). Böylece, yansıma, örnek olması nedeniyle bu çalışmada polarizasyon yönünü değil kasıtlı olarak belirlendi ama çalışma tutarlı. Ayrıca, biz doku almak için özen üzerinden tedavi ve kontrol küre fiber yönlendirme örnekler arasındaki tüm farklılıkları en aza indirme aynı scleral bölgelerden. Son olarak, yoğunluk değerleri elde etmek için örnek başına 100'den fazla görüntü analiz ettik. Bu kapsamlı değerlendirme kayıtlı herhangi bir anormal SHG sinyalleri normalleştirilmiş. Bu söyleniyor, "lif düzleme" sonucu "lifleri SHG artış katkıda bulunmuştur içinde odak düzlemi" daha büyük bir bölümünü (yukarıda açıklanmıştır) çapraz bağlı örneklerinde gözlenen sinyal hem de arttı mümkündür SHG sinyalleri büyük xy düzlemi hizalama. Her ikisi de bu olanakları indüklenen cross-linking etkileri belirtileri olur.

ST iğne SMG tarafından indüklenen değişikliklerden (Tm) ilişkilendirerek bir bölgesel analizi yapılmıştır. Beklendiği gibi etkisi cross-linking düzeyini enjeksiyon alanında yoğunlaşan. Az veya hiç cross-linking etkisi tam karşısında (sağdaki uzak) bölgesinden enjeksiyon, sT enjeksiyon ultrason Yerelleştirme⁴⁴tarafından^, gösterildiği gibi aşağıdaki efekti yerelleştirmesini ilgili bilinen ile tutarlı olarak belirtilmişti ⁴⁵ ve bilgisayarlı tomografi⁴⁶.

Son olarak, cross-linking terapi ve miyopi ile ilgili, kollajen kornea cross-linking yaygın kullanımı kornea istikrarsızlık Keratokonus, post LASIK keratectasias, para marjinal dejenerasyon (PMD), dahil olmak üzere tedavisinde olarak bulduğu bir Refraktif cerrahi işlemler⁴⁷adjunct. Cross-linking ile kornea hastalığı tedavi başarısı arkadaki göz ve özellikle, yüksek miyop², geri gider bir kavram Aksiyel uzama sınırlamak için sklera, bu tedavi yaklaşımı uygulamak keşif açmıştır terapötik cross-linking kavramı^48,49çok erken aşamaları.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yazarlar Tongalp Tezel, MD, istişare sT enjeksiyon ile ilgili için teşekkür ederiz; Theresa Swayne, doktora, Danışma SHG mikroskobu ile ilgili olarak; ve Jimmy Duong tasarım ve Biyoistatistik kaynak ve Biostatistical çekirdek tesisi Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Irving Enstitüsü.

Kısmen körlüğü önlemek için araştırma ve ulusal kurumları, sağlık hibe NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, ncı P30 CA013696 ve NEI R01EY020495 (DCP) tarafından desteklenen. Columbia Üniversitesi'nde ilgili fikri mülkiyet sahibi: verilen ABD patent no: 8,466,203 ve yok: 9,125,856. Uluslararası patent bekleyen: PCT/US2015/020276.

Görüntüleri Confocal içinde toplanan ve İhtisas mikroskobu paylaşılan kaynak-Herbert Irving kapsamlı Kanser Merkezi, Columbia Üniversitesi, NIH tarafından desteklenen hibe #P30 CA013696 (Ulusal Kanser Enstitüsü). Confocal mikroskop NIH ile satın alınmış #S10 RR025686 verin.