Второй гармонических поколения сигналов в кролика склеры как инструмент для оценки терапевтических ткани сшивки (TXL) для близорукости

Этот протокол описывает методы оценки химической сшивки кролик склеры, используя второй гармоники поколения изображений и дифференциальной сканирующей калориметрии.

Методы укрепления тканей путем введения химических связей (неферментативного cross-linking) в структурных белков (фибриллярного коллагены) для терапии включают фотохимического cross-linking и ткани, сшивки (TXL) методы. Такие методы для стимулирования изменения свойств механических тканей используются для роговицы роговицы истончение (механически ослаблены) расстройств, как кератоконус склеры в прогрессирующей близорукости, где истончение и ослабление кзади Склера возникает и скорее всего способствует осевое растяжение. Основная цель белки для укрепления таких тканей являются фибриллярного коллагены, которые составляют подавляющее большинство белков сухого веса в роговицы и склеры. Случайно фибриллярного коллагены являются главным источником второй гармонических поколения сигналов в пространстве внеклеточной ткани. Таким образом изменения коллагеновых белков, таких как те, индуцированной через cross-linking терапии, потенциально может быть обнаружен и предел использования второй гармоники поколения микроскопии (SHGM). Мониторинг SHGM сигналов с помощью лазерного сканирования системы микроскопии в сочетании с инфракрасного света возбуждения, что источник интересных современных изображений метод, который наслаждается широкое использование в биомедицинских наук. Таким образом, настоящее исследование было проведено для того, чтобы оценить использование SHGM микроскопии, как средство для измерения индуцированной сшивки эффекты в ex vivo кролик склеры, после инъекции химического cross-linking агент в суб Tenon пространство (sT), инъекции подход это стандартная практика для нанесения глазной анестезии при офтальмологических клинических процедур. Химической сшивки агент, натрия hydroxymethylglycinate (SMG), — от класса косметические консерванты, известный как формальдегид, выпуская агентов («фарс»). Склеры изменения после реакции с SMG привела к увеличению SHG сигналов и коррелирует с изменениями в температуре тепловой денатурации, стандартный метод для оценки индуцированной ткани cross-linking эффекты.

Прогрессирующая близорукость постулируется считаются излечимыми посредством неферментативного склеры сшивки (фотохимического и/или химических веществ), который имеет смысл, учитывая, что блокирование коллаген ферментативные cross-linking может увеличить экспериментальные формы лишения (FD)-индуцированной близорукость¹. Инфекционную и Филлипс² недавно обсуждали возможности и потенциал использования стандартной УФ А излучения (UVA)-рибофлавин опосредованной фотохимического сшивки (также известный как Дрезден протокол), сокращенно здесь как (рибофлавин CXL) для задней склеры стабилизации прекратить осевое растяжение в близорукости. Этот фотохимического метод успешно используется для лечения дестабилизации поверхности передней глобус (то есть, выпуклые роговицы), видели в keratectasia кератоконуса и пост LASIK. Однако применение этой CXL протокола для склеры препятствуют проблемы, связанные с трудностями в получении доступа к задней склеры с источником ультрафиолетового (УФ) света, а также необходимость изменения гораздо больше ткани площадью поверхности. Что сказал, CXL подход был использован чтобы остановить осевое растяжение в визуально форме лишено кроликов (Тарзорафия), хотя несколько областей задняя склеры требуется несколько отдельных облучения зон в этом исследовании³. Напротив инъекции химического стабилизирующим агента (то есть, сшивки агент) через sT пространства может представлять простой способ изменить задняя склеры, избегая необходимости введения источник ультрафиолетового света. Эта техника инъекции хорошо известен как полезный способ заставить глазной анестезии при офтальмологических процедуры, такие как Катаракта хирургии^4,5,6. Wollensak⁷ описал ранее использование sT инъекции с помощью Глицеральдегид (химической сшивки агент схожая по концепции с формальдегидом, выпуская агентов (фарс), описанные в данном исследовании) застывать кролик склеры и genipin имеет был показан для ограничения осевой длина в FD морских свинок^8,9. Эти исследователи продемонстрировали явное преимущество использования растворимых химического агента над фотохимического CXL технику. Таким образом, склеры сшивки с помощью инъекции химического агента некоторого типа, в том числе фарс (т.е., TXL)¹⁰, может предоставить метод лечения возможно остановить прогрессирование склеры удлинения, видели в близорукости.

В протоколах, представленные здесь мы используем химической сшивки раствор натрия hydroxymethylglycinate (SMG), через sT инъекции склеры глаз трупной кролика. Мы внедрили аналогичные протоколы ранее для актуальных химической сшивки в роговице. Особенно в этих исследованиях сообщалось ранее концентрация зависимых cross-linking эффекты могут быть получены с помощью SMG, с диапазоном эффект, охватывающих значительно выше, достижимые с фотохимическими CXL определяется тепловой денатурации анализа¹¹ .

Здесь мы описываем протоколы для оценки сшивки эффект SMG, доставлено через sT инъекции склеры ткани, тепловой денатурации с помощью сканирования дифференциальной калориметрии (ДСК) и второй гармоники поколения микроскопии (SHGM).

С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), также известный как термический анализ, тепловой денатурации переход измеряется, который для склеры ткани является преимущественно, руководствуясь свойства фибриллярного коллагены, поскольку они составляют большинство массовых белка. Этот метод оценивает стабильность молекулярной структуре коллагена и сшитого облигации, которые стабилизировать фибрилл коллагена, структуры основных высших белков. Во время нагревания в DSC, критического переходного периода температура достигнута, приводит к денатурации коллагена молекулы, что приводит к разматывающее тройной спирали, процесс, который формирует то, что широко известен как желатин. Этот тепловой денатурации разрушает водородные вдоль молекулы коллагена и может быть перенесен в более высоких температурах посредством индуцированного сшивки методы^12,13. Этот метод был использован для многих десятилетий, особенно в индустрии биоматериалов и для процессов, которые включают кожа решений. Однако этот метод требует извлечения склера ткани и поэтому может быть только полезным ex vivo технику.

Микроскопия генерации второй гармоники (SHGM) на основе нелинейных оптических свойств конкретных материалов, с не Центросимметричная молекулярных сред. Например в таких материалах, интенсивный свет, свет производства лазеров, генерирует сигналы ГСП, в которых падающего света в два раза частотой. Биологические материалы, которые известны для создания SHG сигналы являются коллаген, микротрубочки и миозина мышц. Например коллаген, возбужденных с инфракрасным излучением 860 нм длины волны будет излучать сигнал ГСП в видимом диапазоне с 430 Нм длины волны. Второй гармоники поколения (SHG) сигнал изображений является перспективным методом для оценки терапевтических коллагена сшивание. Более 30 лет было известно, что фибрилл коллагена в тканях излучают SHG сигналы¹⁴. Однако только недавно изображения с высоким разрешением можно¹⁵ в различных тканях, включая сухожилия¹⁶, кожи, хряща¹⁷,¹⁸кровеносных сосудов и коллагеновые гели¹⁹.

Основываясь на этом знании, данное исследование оценивает изменения сигнала ГСП, индуцированной в склеру через SMG химически индуцированных сшивания коллагена. Результаты показывают, что SMG модификация склеры увеличивает сигналы ГСП, производится из ткани коллагена расслоений (выше порядок Четвертичная структура состоит из фибрилл коллагена), а также производит структурных морфологических изменений в коллагена оптической сети, отражено в волоконно расслоение «выпрямление».

Все процедуры были проведены с использованием трупной кролика глаза в рамках главы нетронутыми беспородных кролика. Были соблюдены все институциональные и национальные руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных.

1. Подготовка решений

1. SMG подготовкой для TXL:
   1. Готовим 1 мл 0,2 М концентрации раствора бикарбоната натрия раствор (₃NaHCO), с использованием 0,0165 г NaHCO3 порошка растворяют в 1 мл дистиллированной воды.
   2. Растворяют в 1 мл дистиллированной воды, чтобы получить окончательный концентрация 800 мм SMG 0.1016 мг порошка натрия hydroxymethylglycinate (SMG). Отрегулируйте раствор бикарбоната натрия до конечной концентрации 0,1 М NaHCO₃ и 400 мм SMG. Концентрации SMG в зависимости от желаемого эффекта сшивки. В протоколе, в описанный здесь мы использовали, 40, 100 и 400 мм SMG.

2. subTenon инъекции для TXL, используя SMG

1. Заполните два инсулиновые шприцы 1 мл (25G иглы) с 400 мкл управления и решения SMG, соответственно.
2. Место головы кролика в плоскости профиля с помощью подушки. Пенополистирола или стопку бумаги может использоваться для исправить голову в оптимальное положение.
3. Убрать веки с педиатрического глаза зеркало.
4. Измерьте первоначальный внутриглазного давления (ВГД) с помощью устройства applanation тонометрия.
5. Марк месте предполагаемой инъекции в верхней средней части лимба с ткани маркер.
6. Убрать конъюнктивы, окружающие место инъекции с конъюнктивы щипцы (или любой щипцы с зубчатыми круглым наконечником) и вставьте иглу через конъюнктиву, введя капсулу Tenon чуть-чуть за пределами заметное послабляющие сайта (т.е., 2-3 мм от лимба). Небольшой надрез в конъюнктиве можно также с диафрагмой ножницы для облегчения прохождения иглы через Tenon в капсуле.
7. Однажды в шип в капсуле, убедитесь, что игла свободно мобильных, перемещая его стороны в сторону. В это время всему миру не должны двигаться. Это подтверждает правильное размещение иглы выше склеры в суб Tenon's (sT) пространства.
8. Раствор из шприца и Выбросьте иглу. Сразу же после инъекции жидкость накапливается в пространстве sT, создавая передней дуге сквозь конъюнктивы (то есть, хемоз).
9. Повторите измерения ВГД для того, чтобы подтвердить, что он не был изменен из-за случайного перфорация земного шара.
10. Удалите крышку зеркало и выполнить цифровой массаж через закрытые веки для около 2-3 мин.
11. Покинуть голову для инкубационный период 3,5 ч (комнатной температуры = 18 ° C), до перехода к следующему шагу.

3. Подготовка тканей

1. Убрать веки, используя веко зеркало для того чтобы оптимизировать доступ к миру. Выбор оптимального размера зеркало в зависимости от размера глаза.
2. Отдельные конъюнктивы, окружающих лимба. Если он уже были врезаны неподалеку от места инъекции, окружности раскройте границы, поэтому он будет содержать посевным материалом размером приблизительно 1 x 1 см.
3. Вырежьте экстра глазные мышцы, на их сайтах склеры вставки.
4. Поднимите глазного яблока с щипцами, толкая его от задней стороны. Это обеспечивает доступ к задней глобус и будет способствовать резки зрительного нерва с глазной артерии и Вены, расположенные возле заднего полюса мира.
5. Вырежьте из Корнеосклеральный комплекс, с внешней границы, включая отмеченные укола. Пятно все еще должна быть видна на остальной частью склеры.
6. Удалите все слои, прилагается к внутренней стороне склеры, применяя тяги с щипцами ткани и vitreus корпус .
   Примечание: Дальнейшие действия зависят от следующих процедур осуществляется: 4. - анализ DSC, 5. - SHG микроскопии.

4. для регионального анализа ДСК

1. Для глаз лечение: вырезают четыре склеры секторов из оставшихся склеры Кубка с ножницами так, что сайт инъекции расположен в верхнем секторе и соответствие централизованно. Вырежьте оставшиеся 3 секторов как боковых (т.е., носа и временных), так и снизу.
   Примечание: нумерация секторов (1-4), которые далее подразделяются на квадраты (1-16) показана на рисунке 1A.
2. Вырежьте склеры секторов (1-4) на меньшие квадраты (1-16) примерно 4 x 4 мм каждая. Сектор 1 следует разделить на 9 квадратов (сделать точное место инъекции отдельные площади [2]). Разделите секторах 2 и 3 на 2 квадратов (квадратов, 10-11 и 12-13) и сектор 4 на 3 квадратов (квадраты 14-16).
3. Присваивает номер каждый квадрат, как показано на рисунке 1A, чтобы локализовать расстояние проанализированы ткани от местоположения района вводят.
4. Для управления глаз: после того, как разделить четыре склеры сектора (по аналогии с обработанной ткани) ткани вырезают квадратные куски ткани из следующих местоположений: 3 квадратов от верхней сектор (сектор 1), 1 с каждой стороны (сектора 2 и 3) и 1 из Нижний сектор (сектор 4).
5. Соскрести оставшихся слоев сетчатки и хориоидеи и мыть дважды с свежими PBS каждый раз, оставляя куски, погруженной в растворе для приблизительно 10 s в то время.

5. для визуализации SHG

1. Вырежьте в верхней части склеры, используя ножницы для создания области 1 x 1 см с сайтом инъекции, соответствие централизованно.
2. Соскрести оставшихся слоев сетчатки и сосудистое и дважды промыть свежим PBS каждый раз оставляя куски в растворе для приблизительно 10 s.
3. Место ткани в 1 мл трубки заполнены раствором PBS для транспортировки для визуализации объекта. Все процедуры, после время инкубации и начиная с вскрытия глазного яблока должно выполняться в течение часа.

6. микроскопия протокол

Примечание: Этот протокол для изображений обратно рассеянном SHG сигнала от коллаген склера ткани специально для лазерный сканирующий микроскоп.

1. Микроскопия, Настройка
   1. Для максимального сигнала и резолюции при выполнении SHG микроскопии объектива оптимизировать для передачи инфракрасного света и с высокой числовой апертуры (NA). Наша цель – Nikon АПО LWD 25 x / NA1.1 воды погружения.
   2. Отрегулируйте воротник Коррекция объектива соответствует глубине образца, в этом случае, толщина coverslip, 0.17 миллиметров.
   3. Маунт 25 x объектив и добавить большое количество смазки на водной основе геля для покрытия поверхности изображений перед монтажом образца. Гель на водной основе не будет испаряться в ходе эксперимента и следовательно, будет поддерживать качество изображения.
   4. Место склеры ткани от 1 мл с PBS без сушки между двумя 25-мм круглые coverslips (эписклеральные стороной вниз) предоставление максимального контакта между эписклерой и coverslip поверхности.
      Примечание: Ткани могут также быть размещены открытые на coverslip. Хорошее количество PBS следует сохранить ткани, увлажненной во время визуализации. В этом случае добавьте кусок ткани и PBS после монтажа cellchamber.
   5. Соберите зале клеток, поместив 25-мм круглые coverslip, один или в сэндвич технике, в нижней части камеры и привинтить верхнюю часть вниз для того чтобы создать запечатанный вокруг камеры. Не винт вниз плотно когда Топ coverslip используется, чтобы избежать искусственно уплощение и повреждение тканей.
   6. Смонтируйте клетки камеры с образца ткани на микроскопа.
   7. Набор микроскоп для глаз мнение с пропускаемого света на.
   8. Расположите стадии и отрегулируйте высоту цели таким образом, чтобы нижняя поверхность образца находится в фокусе, как определяется светлые области инспекции через глаз кусок.
   9. Выключите все огни, за исключением монитора компьютера и блокировать столько света от монитора как можно с алюминиевой фольги листы драпированные на микроскопа. Сведение к минимуму любых рассеянный свет, достигнув детекторы обеспечит приобретение низким уровнем шума, как детекторы Хаасп NDD имеют высокую чувствительность.
   10. В панели Ti Pad программного обеспечения проверьте правильность определения объектива.
   11. В панели A1 компактный GUI выберите ИК лазер для изображений, выберите NDD детекторы и выбрать DAPI канал, который оснащен 400-450 Нм полосовой фильтр.
   12. В панели А1 MP GUI, задайте волны инфракрасного лазера 860 нм и откройте затвор.
   13. Установки лазерного сканирования условий в панели A1 компактный GUI следующим образом. Выберите: сканер гальвано (), (b) однонаправленного сканирование, (c) пикселей останавливаться время 6.2 МКС, кадра (d) размер 1 024 x 1 024 пикселей, (e) линии в среднем 2 x
       Примечание: Гальвано сканера и однонаправленная сканирования обеспечивает точное выравнивание точка за точкой. Размер 1024 x 1024 для полное поле зрения переводится пикселя размером 0,5 мкм /pixel. Линии в среднем уменьшит Дробовой шум в изображении.
   14. Получить набор изображений условий панели A1 компактный GUI, регулируя мощность лазера и детектора. Откройте панель выглядят таблицы (ТМП), которая отображает гистограмму значений интенсивности пикселей в текущем образе. Включите живых изображений в режиме «Найти» и максимального обнаруженного диапазона значений пикселов, регулируя лазерный детектор и мощность усиления. Избегайте насыщения. Типичные значения — 2,5% мощности лазера, из в общей сложности 2,35 W на 860 нм и 100 HV (детектор прибыль).
   15. Примечание: Для этой установки, мощность лазера, измеренная с внутренней ваттметр является 5.2 МВт. Каждый раз, когда проводится эксперимент, подрегулировать процент лазер, таким образом, что измерения внутренней мощности является постоянным на 5.2 МВт между сессиями изображений. Следует позаботиться при определении мощности лазера. Хамелеон II лазер является 3 Вт лазер на 800 Нм и 10% или более высокой мощности потенциально может вызвать повреждение тканей.
2. Получение изображения
   1. В режиме предварительного просмотра сканирования области ткани, используя инструмент XYZ обзор.
   2. Набор изображений с низким разрешением (256 x 256 пикселей и не линия усреднения) ускорить приобретение изображения в этом режиме.
   3. Захват 5 x 5, 3 x 3 или единого поля зрения для покрытия всей поверхности ткани. В каждом месте, до захвата обзор включите режим живой «Сканировать» и принести ткани в фокус. Обратите внимание, что различные регионы ткани будет иметь несколько различных позиций в осевом направлении.
   4. Найти плоской области, где видны в поле зрения весь коллагеновые волокна и дважды щелкните эту позицию в средстве обзор переехать на стадии в определенном месте.
   5. Включите режим живой «Сканировать», отрегулировать положение Z цели таким образом, что в нижней плоскости находится в фокусе и, для перемещения плоскости оптической 10-15 мкм выше это нижний слой Ti Pad, используйте диск Z.
   6. Получить изображение с высоким разрешением с 1 024 x 1 024 пикселей и 2 x линии усреднения, используя кнопку «Захват».
   7. Сохраните место в обзоре XYZ, используя кнопку «+». Это гарантирует, что же области ткани не пойман.
   8. За каждый кусок ткани 10 снимков non перекроя поля зрения.

7. DSC протокол

Примечание: Перейти к этому шагу, как только Подготовка тканей является полным, для регионального анализа ДСК, или после ткани изображений при выполнении SHGM.

1. Подготовьте DSC кастрюли, взвешивают и помечены.
   Примечание: Этот шаг должно быть сделано до рассечение тканей для того, чтобы свести к минимуму усыхание тканей.
2. Сухой каждый склеры площадь поглощающей тканью и заложить плашмя на нижней части сковороде DSC, используя зубчатый щипцами.
3. Весят сковороду с ткани внутри и крышкой обжим и покрыты для получения ткани мокрый вес (масса образцов должно быть в диапазоне от 5 до 11 мг).
   Примечание: Печать каждого кастрюлю с помощью разглаживания перед переходом на следующий образец ткани. Посуду герметично, предотвращая потерю воды до термического анализа.
4. После того, как образец гофрированные, поместите его на указанном месте на панели DSC. Там должно быть 6 образцов для элемента управления и 16 для лечение глаз.
5. Создайте метод, с помощью инструмента управления программного обеспечения, указав вес ткани, и запустите термический анализ, используя следующие параметры: температура 40-80 ° c, скорость нагрева: 1 ° C/мин, тепловой поток: 17.37 МВт, поток газа (N₂): 19,8 мл/мин, Давление газа: 2.2 бар.
6. После завершения анализа данных для каждой выборки путем извлечения пик температуры перехода на котором тепловой денатурации происходит с помощью инструмента управления программным обеспечением.

8. анализ

1. SHG сигнал
   1. Выберите по крайней мере 5-10 наиболее представительных изображений из каждого лечения и его управления, таким образом, что часть изображения занята главным образом коллагеновых волокон.
   2. Загрузить каждое изображение в ImageJ программного обеспечения и измерить интенсивность средняя пикселей, выбрав Анализ > мера для активного изображения.
   3. Значения, извлеченные помечаются как интенсивность средняя пикселей и также может быть доказано путем построения гистограмму интенсивности, выбрав в меню Анализ > гистограммы.
   4. С помощью листа Excel, создать таблицу к документу все измеренные данные соответственно образец идентификатора.
   5. Вычислить среднее и стандартное отклонение интенсивности пикселей для каждого лечения и контроля состояния.
   6. С помощью студента t тест, сравнить различия для всех попарных сравнений концентраций (т.е., 40 мм SMG против 0 и 400 мм SMG против 0). [P≤0.05].
2. Волнистость
   1. Выберите изображение, которое отображается коллагеновых волокон. По крайней мере 10 изображений на сэмпл должны быть проанализированы (включая образец элемента управления для каждой концентрации - по крайней мере 40 в общей сложности).
   2. Открытые ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ требует предварительной установки.
   3. Загрузите все imagesby, перетащить в открытое окно NeuronJ .
   4. Создание трассировки линии вдоль волокон, по контуру фибриллярных мыши (пера Рисование таблетки могут использоваться), нажмите кнопку M для измерения расстояния длины всего волокна.
   5. Выберите «Параметр» рисовать касательной прямой линии и соединяют начала и конца контура ранее волокна. Теперь нажмите кнопку M для измерения длины end-to-end.
   6. Повторите ту же процедуру на по крайней мере 10 фибриллами на изображение.
   7. Сбор этих двух измерений от каждого из 10 фибриллами и ввод данных в электронную таблицу excel, выражая общее волокна (контур) и конец в конец длиной (прямой соединительной линии) в длину [кривая] и [линейный], соответственно.
   8. Рассчитать индекс волнистости (W), с использованием формулы: W = длина [кривая] / [линейный] длина.
   9. Рассчитать % волнистость, сравнивая данные из образов лечение samples(SMG) с изображениями из контрольных образцов, используя формулу: (W [SMG] - 1) / (Вт [контроль] - 1)
   10. Чтобы определить статистические различия (p значения) коллагеновые волокна морфологии условий различных лечения и управления выполните парного t тест для волнистость индекса (W).

Тепловой денатурации температуры (Tm) как метод анализа для оценки TXL cross-linking эффект: В общей сложности 16 пар кролика глаза были использованы в этих экспериментах TXL процедуры. В первой части этого исследования оценивалась локализации сшивки эффект вызванных одной инъекции SMG сшивки агента через sT пространства в голову трупной кролика. Этот тип эксперимент имеет отношение к клинического лечения больных, так как инъекции в более чем одном месте может быть необходимой для стабилизации нужную область склеры.

Как было бы предсказать на основе принципов основные температуропроводности, эффект был величайший в месте инъекции с эффектами, индуцированной в прилегающих регионах, а также, в зависимости от концентрации растворов. Рисунок 1A представляет схематическое расположение склеры секторов (1-4 в красный пустотелый номер шрифта) (разделена на квадраты (1-16 в черный тонкий номер шрифта)) которые прошли анализ отдельных тепловой денатурации после одного Святого инъекций с цветовой индекс сопоставления. Таблица 1 показывает изменение в ТМ значений для каждого пронумерованные сектора по сравнению с соответствующего элемента управления. Значения для инъекции 40 мм и 400 мм и включают стандартная ошибка среднего рассчитаны как минимум трех независимых заключений.

1B цифры-C представляют собой результаты, с использованием двух различных концентраций SMG, 40 мм (рис. 1B) и 400 мм (рис. 1 c). В Рисунок 1BНижняя концентрации 40 мм образца показали мягкий сдвиг в ТМ, что было отмечено на площади 2 (инъекции). Аналогичные сдвиги были замечены в соседние клетки 1 и 3 (светлее голубой). Маргинальных сдвиги наблюдаются в квадраты, 4-6 и 7 к 9 без статистически значимых отличий от площади вводят. Не ТМ сдвиг был замечен в нижней квадратов 14-16, которые представлены наиболее отдаленные сектора от укола.

Как показано на рисунке 1 c, более высокой концентрации (400 мм) статистически весьма существенно отразилось сшивки (указывается как оттенки оранжевого). Были замечены большой сдвиг в ТМ с связаны небольшие стандартное отклонение и p < 0,05, отражающие большой разницы в эффект на 400 мм по сравнению с низкой концентрации 40 мм. Наиболее драматические эффекты отмечались в секторе 1 в верхнем мире. Что касается остальных секторов малый эффект наблюдался в квадраты, 10 и 14, (которые могут быть из-за некоторых отслеживания сшивки жидкости кзади) и не эффект наблюдался в квадраты, 11, 12, 13, 15 и 16. В целом, сшивки эффекты были маргинальные в секторах 2 и 3 без эффекта наблюдается в секторе 4 (то есть, самые отдаленные места от укола), похож на пример: 40 мм. Эти результаты показали, что существует '' зоны влияния '' и что этот тип шаблона можно ожидать после инъекции sT сшивки агента. Это может означать необходимость для инъекций в нескольких местах с целью побудить эффекты на большой площади ткани.

Было также проведено исследование структурообразования эффектов, индуцированной в нетронутыми глаза, оценке TXL с двумя концентрациями SMG. Был проведен анализ тепловой денатурации ткани, которые прошли такие склеры сшивки. Сшивание время было 3,5 ч для TXL, используя три различных концентраций, 40 (ТМ = 1,11 +/-1.2), 100 (ТМ = 5.12 + / 2.9) и 400 (ТМ = 14.34 + / 1.1) мм SMG. Результаты показали, что концентрации зависимых эффект проявляется в SMG сшитой ткани.

Второй гармоники поколение (SHG) изображений как метод оценки TXL cross-linking эффект:

Микроскопия ГСП, что изображения были проанализированы как для интенсивности пикселей SHG сигнал и волоконно расслоение волнения. Широкий диапазон cross-linking концентрации (от 40 до 400 мм) был использован для того чтобы исследовать изменения сигнала ГСП, которые могут произойти в широком диапазоне сшивки эффекты. Используя возможности анализа гистограммы, включены в программы²⁰обработки изображений Фиджи, можно было quantitate сигнала ГСП, производимых в склеры ткани путем инъекций sT, сравнение эффектов на 40 мм для тех, вызванных использованием 400 мм. Средняя разница в средней пиксель intesities на 40 мм были 66.3 ± 27,7 по сравнению с 361.4 ± 28,3 для образцов 400 мм, почти кратные увеличение. Это соответствует с увеличением ткани сшивки, поскольку соответствующее увеличение ТМ также были отмечены в таких условиях. Рисунок 2 показывает представитель марки SHG изображения склеры, взяты из управления (рисунок 2A), 40 мм (рис. 2B) и 400 мм (рис. 2 c). Показано также, сопровождающих Гистограмма анализ, включая средней яркости (или пиксель). Общее количество изображений проанализированы был: 120 для 40 мм и 98 для его управления; 121 400 мм и 94 для собственного элемента управления. Глубины изображения тканей было 10-15 мкм от поверхности эписклеральные. Результаты анализов гистограммы, которые усреднения многочисленных полей изображения, указал, что более высокие концентрации cross-linking эффект (рис. 3) производится большей интенсивности пикселей.

Как показано на рисунке 4, был также проведен анализ изображений с методами, принятыми от сердечно-сосудистых литературы, с помощью плагинов ImageJ ''Нейрон J''²¹. Мы оценили фактор волнистости W = длина [кривая] / Длина [линейный] и мы отметил, что cross-linking привели к Выпрямление расслоений, как указано на снижение волнистость % в 40 мм, 400 мм сшитого склера по сравнению с необработанными управления склеры (W % = (W [ SMG]-1)/(W[Control]-1), Таблица 2). Разница в волнообразность между 40 и 400 мм SMG рассматриваются образцы не была статистически значимой.

Рисунок 1 : Локализация TXL эффекта через sT инъекций с использованием 40 и 400 мм SMG.
(A) схематическое представление 4 склеры секторов (номера 1-4 в большой красный пустотелый шрифта), склера разделена на квадраты [номера 1-16 в небольших тонкий черный шрифт] (не обращается к шкале), которые прошли термического анализа. Место инъекции соответствует расположен площади (2) в секторе 1. Тепловой денатурации cross-linking эффект TXL с (1B) 40 мм SMG и (1 C) 400 мм SMG. (D) цвет кодированная легенда шкала температуры (B) и (C). Этот показатель был изменен с Zyablitskaya et al. с разрешения²². Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Представитель изображений зависит от увеличения концентрации SHG сигнал уровни яркости, производится после TXL через sT инъекции склеры SMG ex vivo . Концентрации SMG показываются как 40 мм (B) и (C) 400 мм. Каждое изображение содержит 50 мкм шкалы (в правом нижнем углу) и средней интенсивности в пикселах (в правом верхнем углу) - абсолютные значения. Этот показатель был изменен с Zyablitskaya et al. с разрешения²². Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Линейчатая диаграмма изменения SHG интенсивности сигнала пикселя (по сравнению с парными управления от же головы кролика) в склеры нетронутыми глобусы, сшитого через инъекции (TXL) sT 40 и 400 мм SMG решения (Δ). Средние значения с Среднеквадратичная ошибка среднего значения были: 66 ± 27,7 для 40 мм и 361 ± 28.3 на 400 мм. Этот показатель был изменен с Zyablitskaya et al. с разрешения²². Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Пример анализа волнистость волокна (как выраженные линейность). Изображение элемента управления образца для концентрации SMG 40 мм с 50 мкм, шкалы (в правом нижнем углу). Этот рисунок был изменен с Zyablitskaya и др. с разрешения²². Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Схематическое изображение Святого инъекций. Области пронумерованы 1-3 соответствуют областям, представлены на рисунке 1A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: DSC результаты для локализации TXL эффект исследования. Изменения в тепловой температуры плавления (ΔTm) с стандартные ошибки для каждой пробы сектора является, как изображено на рисунке 1A. Каждое значение выражается как разница в ТМ ascompared в паре управления и в среднем минимум 3 независимых заключений.

Таблица 2. Результаты анализа волнистость волокна. SHG изображения из района TXL инъекции были проанализированы на предмет степени волнистость волокна с помощью нейрон J программного обеспечения. Десять волокна были отобраны из каждого изображения и в общей сложности около 100 волокна были проанализированы на предмет степени волнистость. Средние значения с Среднеквадратичная ошибка среднего значения включены.

Проведенные эксперименты показали, подтверждающей использование микроскопии сигнала ГСП в качестве метода для оценки коллагена cross-linking эффекты в склеры, повышение будущие возможности использования этого метода как инструмент контроля для сшивки лечения Это целевых белков коллагена. Следует отметить инструмент уже находится в клинического использования, которые потенциально могут захватить этот сигнал ГСП. Хотя этот инструмент был главным образом предназначен для визуализации дермы кожи человека, он успешно использовался для изображения роговицы и склеры²³.

Это необходимо поддерживать идентичные сканирования и обработки изображений условий при сравнении управления и рассматриваются образцы. Второе поколение гармонического, микроскопия коллагена в склера ткани требует флуоресценции микроскопа совместимы с несколькими фотонных изображений, импульсного инфракрасного лазерного перестраиваемой в диапазоне 800-900 нм длины волны и Высокочувствительный детектор например Хаасп descanned детекторы (NDD). Руководящие принципы, описанные в этой рукописи являются отправной точкой. Условия должны определяться специально для новых экспериментов или для различных систем.

Роговицы и склеры также были оценены одновременно в исследованиях с использованием этой техники^24,25,,2627. Зная, что сигнал SHG распространяет в направлениях вперед и назад, несколько исследований изучили ткани роговицы независимо в своей родной государства^{28,29,,3031, 32,,3334} и в кератоконуса^35,36 , а также после CXL (как описано ниже). Результаты этих исследований показывают, что роговицы сигнал оптимизирована в направлении вперед рассеянного, который имеет смысл, учитывая прозрачность роговицы и тот факт, что свет проходит через ткани, чтобы ударить монитор вперед разбросанных систем. Как правило сигнал ГСП в синий видимого диапазона и будет значительно сокращено при прохождении через весьма рассеяния ткани как склеры глаз. В результате обнаружения вперед рассеянного ГСП потребует шлифов ткани 50 мкм или менее в толщину, а также специальных оптических set-up. В противоположность этому обратно рассеянного сигнала может быть захвачен через регулярные светового луча флуоресцентным микроскопом без разрезания тканей, и поэтому этот режим является предпочтительным при визуализации коллагена в неповрежденной склера ткани на глубину 30-40 мкм. В этом исследовании мы отметили зависит от увеличения концентрации в плотности сигнала. Это вполне возможно, однако, что TXL могли дополнительных и аналогичные воздействие на более глубокие слои склеры, и что эффект может быть более выраженными и расширить в более глубокие слои особенно с более высокой концентрации. Однако из-за ограниченной SHG сигнал проникновения в склеру и для целей этого первоначального исследования, мы решили работать с лучшее качество изображения, которые были получены из самых поверхностных склеры (глубина 15 мкм). В будущем исследования, мы будем рассматривать глубина зависимых эффектов после TXL методы, как это может обеспечить дополнительную важную информацию о том, почему даже больше различия не наблюдается между 40 и 400 мм обработанных образцов.

Кроме того относительно использования ГСП для оценки рибофлавин CXL индуцированной ткани сшивки, ГСП микроскопии изображений следующих рибофлавин CXL роговицы сообщали несколько групп^37,,38-^{39 , 40 , 41}. в исследовании Стивена и др. ³⁷, роговицы стабилизации, с помощью метода CXL привели к '' гомогенизации '' сигнала и потери тканей '' складки '' или '' неровности '' видели в кросс несвязанном образцов. Эти типы изменений, однако, также были отмечены в ходе исследования, оценки последствий изменений в IOP роговицы SHG сигналов, повышение возможности техническими артефактами. Организационно волосики, а также высшего порядка волоконно расслоение/пластинчатые Организации точки зрения, склеры и роговицы являются весьма различными и многое известно о таких различиях от электронной микроскопии исследования. Две ткани отличаются фибриллярных упаковки, которая включает в себя фибриллярных Диаметр распределения (малые единообразных фибриллами для фибриллами диаметр роговицы и переменную для склеры) и Интер фибриллярных интервал (форма для переменной для склеры и роговицы). Также высшего порядка организации в Ламеллярные листы (роговица) против расслоений (склера) совершенно иная. Такие структурные различия отражаются в ГСП сигналы производства этих двух тканей. Таким образом изменения, вызванные cross-linking может изменить SHG сигнала в разных, но параллельных путей. Другими словами '' выпрямления '' волокон в склеры в этом исследовании и '' гомогенизации '' сигнала в роговице, сообщили в литературе, были результатом коллагена сшивание модификации. Таким образом эффект '' гомогенизации '' в роговице в некотором роде можно аналогично '' выпрямления '' эффект склеры, что было сообщено здесь.

Механизмы, которые приводят к этой выпрямления эффекта, производимого, TXL неясны, основанный на текущем исследовании. Одним из возможных вариантов может быть что ткани было каким-то образом '' о фиксированном '' в механически '' загружена '' позиции. Это будет поддерживать понятие, что индуцированной '' волосики и волокна стабилизации '' имели место. Изменения в внутриглазного давления вероятно не способствует этот эффект с IOP контролируется до и после инъекции sT и оставалась стабильной. В целом значимость этих наблюдений не ясны, и необходимо будет провести дальнейшие исследования. Следует отметить, отдельные методы например Бриллюэна микроскопии⁴², визуализации которого было показано для предоставления количественных мер сшивки (как определяется модуль сдвига) после CXL фотохимии могут быть полезны в подтверждении выводов с ГСП изображения в этом исследовании. Однако следует отметить, что его использование с высоко рассеяния тканей, таких как склера⁴³, требует технических изменений и не была протестирована с перекрестными склеры ткани.

Лазерная поляризации и микроскопии ГСП является важным вопросом. Лазерный свет линейно поляризованных и ориентированные перпендикулярно направлению распространения сигнала ГСП и на некоторый угол в плоскости xy для каждого волокна коллагена. Таким образом, волокна в плоскости xy, которые хорошо согласованы и точно перпендикулярно поляризованные лазерный свет будет производить выше сигнала ГСП чем те, на другие углы, включая те, которые параллельно падающего света (например, z плоскости), которые будут производить низкий сигнал SHG (из-за разрушительных помех). Отношении склера ткани коллагена, что волокна ориентированные под различными углами на микроскопическом уровне, хотя предпочтительным анатомические волокна ориентации, как известно, существуют основанные на месте глобус. Таким образом поскольку SHG сигнал будет варьироваться в зависимости от плоскости xy угол каждого волокна, общий сигнал будет меньше, чем тот, который будет подготовлен, если все коллагеновые волокна были точно выровнены на тот же угол (в ткани, такие как сухожилия например). Таким образом в этом исследовании, в связи с характером образца изображаемого, направление поляризации не определялся преднамеренно, но держали постоянной в течение всего исследования. Кроме того, мы позаботились, чтобы получить ткани от лечить и контролировать глобусы идентичные склеры регионов, свести к минимуму любые различия в ориентации волокон между выборками. Наконец мы проанализировали более 100 изображений на сэмпл с целью получения значения интенсивности. Этот обширный оценки следует нормализовать любые аномальные SHG сигналы, которые были зарегистрированы. Это, как говорится, это возможно, что в результате «волокна выпрямитель» которые мы наблюдали в сшитого образцах (описано выше), большая часть «в фокальной плоскости» волокна могут способствовали увеличение SHG сигнала, а также расширение SHG сигналы от большей выравнивание плоскости xy. Обе эти возможности будет проявлений индуцированных сшивки эффектов.

Региональный анализ cross-linking изменений, (Tm), вызванных sT инъекции SMG была выполнена. Как и ожидалось, уровень cross-linking эффект была сосредоточена в области инъекции. Было отмечено небольшое или никакое сшивки эффект в регионе прямо напротив (Дальний прочь) от инъекции, в соответствии с того, что известно о локализации эффекта после инъекции sT, как показано УЗИ локализации^{44, 45} и компьютерная томография⁴⁶.

Наконец, относительно сшивки терапии и миопия, сшивания коллагена роговицы находит широкое применение в лечении роговицы дестабилизации, включая кератоконуса, пост LASIK keratectasias, прозрачный маргинальных дегенерации (PMD) и как дополнения к рефракционной хирургической процедуры⁴⁷. Успех лечения заболеваний роговицы с cross-linking привело к исследованию применения этого подхода лечения к задней глаза и, в частности, склера, для ограничения осевое растяжение в высокой близорукости², концепция, которая восходит к очень ранних этапах терапевтического сшивки концепции^48,49.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Авторы благодарят Tongalp Tezel, MD, для проведения консультаций относительно sT инъекций; Тереза Swayne, PhD, для проведения консультаций относительно SHG микроскопии; и Джимми Duong от дизайна и биостатистики ресурсов и Фондом Biostatistical ядро Ирвинг института в медицинский центр Колумбийского университета.

Поддержаны в части исследования, чтобы предотвратить слепоту и национальных институтов здравоохранения грантов NCRR UL1RR024156, EY019007 Р30 NEI, NCI Р30 CA013696 и NEI R01EY020495 (DCP). Колумбийский университет владеет связанные интеллектуальной собственности: патента США выданы без: 8,466,203 и не: 9,125,856. Международный патент: PCT/US2015/020276.

Изображения были собраны в Confocal и специализированных микроскопии общий ресурс Герберта Ирвинга всеобъемлющем онкологический центр в Колумбийском университете, поддерживаемых NIH Грант #P30 CA013696 (Национальный институт рака). Конфокальный микроскоп был приобретен с низ Грант #S10 RR025686.