Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık

Biz hipofiz bezleri teşrih ve fareler gelişmekte olan hipofiz koronal bölümleri hazırlamak için bir protokol mevcut.

Önemli bir endokrin organ homeostazı için gerekli hormonlar salgılayan hipofiz bezi veya hypophysis olduğunu. O oluşmak-in iki bezleri ile ayrı embriyonik kökenleri ve görev — nörohipofiz ve adenohipofiz. Küçük ve narin bir uzun oval şekli ile gelişmekte olan fare hipofiz bezi bulunmaktadır. Koronal bir bölümü adenohipofiz ve nörohipofiz fare hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için tercih edilir.

Bu iletişim kuralı uygun hipofiz koronal bölümleri fareler gelişmekte olan iyi korunmuş doku mimarileri ile ulaşmak hedeftir. Bu protokol için ayrıntılı olarak incelemek ve hipofiz bezlerinin düzgün üzerinden fare geliştirme işlemek nasıl açıklar. İlk olarak, fare transcardial perfüzyon formaldehit diseksiyon önce tarafından sabitlenir. Daha sonra üç farklı diseksiyon teknikleri sağlam hipofiz bezlerin fareler yaş bağlı olarak elde etmek için uygulanır. Fetal farelerin embriyonik gün (E) 17,5-18,5 ve Yenidoğan Bebeklerin yukarı 4 gün olarak yaşları için ense kemiği, bezi ve trigeminal sinir de dahil olmak üzere tüm sella bölgeleri kesmiştim. Yavrular için bir bütün olarak trigeminal sinir ile bağlı yaşında doğum sonrası gün (P) 5-14, hipofiz bezleri disseke. 3 hafta boyunca fareler için hipofiz bezleri dikkatle ücretsiz çevre dokulardan disseke. Ayrıca nasıl koronal bölümleri tatmin elde etmek için simge çevre dokular kullanarak uygun yönde hipofiz bezleri katıştırmak için görüntüler. Bu yöntemleri fareler gelişmekte olan hipofiz bezlerinin histolojik ve gelişimsel özellikleri analiz yararlıdır.

Önemli bir endokrin organ homeostazı^1,2için gerekli hormonlar salgılayan hipofiz bezi veya hypophysis olduğunu. Anatomik olarak, hipofiz bezi, nörohipofiz ve adenohipofiz oluşan bir '' iki-in-one'' yapısıdır. Bu parçaların farklı embriyonik kökenleri ve işlev farklı var. Nörohipofiz sinirsel ektoderm türetilmiştir ve oksitosin ve Antidiüretik hormon salgılar. Adenohipofiz Rathke'nın çantası kaynaklı ve dahil olmak üzere büyüme hormon, prolaktin, tiroid - uyarıcı hormon, folikül - uyarıcı hormon, Lüteinizan, adrenocorticotropic hormon, hormon serbest bırakmak için sorumludur ve melanosit - uyarıcı hormon^3,4,5.

Hipofiz bezi fare kafatası ense kemiği (sella turcica) dorsal yüzeye aittir ve beynin tabanına kırılgan bir SAP tarafından eklenir. Yanal trigeminal sinir tarafından ve anteriorly optik hemisferlerine^6,7ile çevrilidir. Bezinin uzun ekseni başı dik bir uzun oval şekil vardır. Dorsal yüzeyi nörohipofiz ve adenohipofiz kolayca, dorsal orta bölge ve yanal ve ventrally ikinci uzanan işgal eski ile demarcated. Postnatal geliştirme sırasında ilk ay sonra doğum^8,9hipofiz boyutunu hızla artar. Yine de, fare hipofiz hala çok küçük boyutu 1,9 mg bir ortalama ağırlığı ve uzun eksen çapı ~ 3 mm ile yetişkin¹⁰, postnatal gün 21 (P21) 2-2.5 mm ve P0 yalnızca 1-1.5 mm uzun eksen çapı.

Koronal bir bölümü adenohipofiz ve nörohipofiz fare hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için tercih edilir. Ancak, bazı teknik becerileri fareler son derece küçük boyutu ve farklı anatomi nedeniyle gelişmekte olan hipofiz bezlerinin koronal bölümleri tatmin elde etmek için gereklidir. Video bu makalede, biz nasıl fare hipofiz bezleri teşrih ve hipofiz koronal bölümleri farklı geliştirme aşamalarında hazırlayın göstermek.

C57BL/6 fareler özel patojen-Alerjik durumlar yetiştirilmiş. Tüm hayvan deneysel hayvan bakım ve ikinci askeri Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış yönergelere uygun yöntemlerdir.

1. diseksiyon, Postnatal gelişmekte olan hipofiz bezi

1. gerçekleştir anestezi: yenidoğan fareler (P0 - P5) hipotermi ikna etmek için ezilmiş buz koyun. 5 günden büyük fareler için %5 üretan (30 µL/g vücut ağırlığının) anestezi ikna etmek için intraperitoneally enjekte et. Kuyruk/Pinch ayak yanıt-e doğru değerlendirmek. Sadece fare için zararlı uyaranlara yanıt vermemesine neden olur sonra devam.
2. Yavaşça forepaws taping tarafından fare (yüz yukarı arkasında yatan) sırtüstü pozisyonda güvenli ve hindpaws olma yeteneğine sahip bir çalışma yüzeyinin için pinned (Yani, strafor) bir kimyasal duman başlık içinde.
3. Transcardial perfüzyon gerçekleştirmek.
   1. Fare kafesi kalp (ve torasik diğer organlara) ortaya çıkarmak için cerrahi makasla kesti.
   2. Kalbi künt Forseps ile güvenli ve 26 G (0,45 mm) iğne sol ventrikül yerleştirin. İğne heparinized fosfat tamponlu tuz ile dolu bir 10 mL şırınga bağlı olduğu (PBS; 5 mg/mL sodyum nitrit ve 10 U/mL heparin ile desteklenmiş, pH 7.4, sıcak kullanmadan önce 37 ° c). Hemen sağ atrium iyi makasla kesmek ve sağ Kulakçık çıkmadan sıvı temizlenene kadar sıcak PBS ile vücut sıvı başlar.
      Not: yaklaşık 5-10 mL PBS yenidoğan fareler için gereklidir ve 10-20 mL PBS yetişkin fareler için.
   3. İğne tutmak ve % 4 paraformaldehyde (PFA; pH 7,4) dolu bir şırınga için değiştirin. 10 mL ve sabitleştirici için 20 mL sıvı yenidoğan ve P21 fare, sırasıyla.
      Dikkat: PFA zehirlidir. Cilt ve solunum tahrişleri ve göz zarar neden olabilir. Eldiven ve iş bir kimyasal başlık altında.
4. PFA-sabit fare başını kesmek ve kafatası kemik makasla kesip.
   1. Yavaşça küçük Forseps ile arka beyin kafatası tabanından kaldırın. Sella turcica ilk belirtisinde durağı kaldırma ama tutun arka beyin, kesme hipofiz sapı ve sinir lifleri beynin tabanına iyi makas ile bağlanma. Bu hipofiz uzakta beyinle kaldırdı değil emin olmak için kritik bir adımdır.
   2. Sonra beyin kaldırma tutmak ve tüm beyin hipofiz bezi tam olarak ortaya çıkarmak için kaldırın. Hipofiz bezi, yanal trigeminal sinir, dahil olmak üzere tüm sella bölge kesmek ve makas (yaklaşık 3 x 5 mm ²) ile ense kemiği altında.
5. Disseke doku içine bir 35 mm çanak ya da bir şey 2 mL soğuk %4 içeren 6-şey plaka koymak PFA (pH 7,4). Saptamak için P0 - P7 pituitaries, P14 pituitaries, P21 - P28 pituitaries ve yetişkin pituitaries için 3 h için 1,5 saat için 1 saat 40 dk 4 ° C'de doku.
6. Daha fazla ayrışma, hipofiz
   1. sabit doku 10 mL PBS, 5 değişiklikleri, 15 dk ile yıkayın. Yenidoğan hipofiz bezi ile birlikte onun çevre dokular ve ense kemiği altında aşırı su kaybına doğrudan işlenebilir. Ancak, hipofiz bezlerin fareler 5 günden daha eski üzerinden ayrışmış başka bir stereo mikroskop altında.
   2. Sabit doku 1 mL PBS içeren bir 35 mm çanak içine koymak. P5 - P14 pituitaries, için sinirler ve iyi forseps ve makas ile kemik arasındaki bağ membranlar kaldırmak ve dikkatle yanal trigeminal sinir birlikte hipofiz bezi sella turcica bırakarak ancak bir bütün izole. İzole bezi ve sinirler ile bağ membranlar tarafından bağlı bir " H "-hangi tarihlerde görünüm ( şekil 1B).
   3. İçin P21 ve yetişkin pituitaries, sinirler ve hipofiz etrafında bağ membranlar kaldırmak ve bezi çevre dokular üzerinden ücretsiz. Hipofiz bezi doku kağıt mendil temizlik lens ile sarın ve gömme bir kaset koy.
      Not: küçük hipofiz lens temizleme kağıt mendil ile kaydırma örneklerin herhangi bir olası kaybını önlemek ve parafin katıştırma aşağıdaki yordamdaki doku bütünlüğünün korunması için yardımcı olur. Cryo-gömme yordamdaki küçük bir şişe içinde işlense hipofiz kaydırılmasına gerek kalmayabilir.

2. Katıştırma ve Sectioning alkol

1. 15 dk için % 50, % 65, %75 ve % 95 etanol çözümleriyle kaset katıştırma olarak numuneler kurutmak. Daha sonra saf etanol, 3 dakikadır her P0 - 3 değişikliklerle P4 bezleri, P5 - P14 bezleri ve 5 min için her 4 dk P21 ve büyük bezleri için kurutmak. Ksilen ile net, 3, 3 dakikadır her P0 - P4 bezleri, P5 - P14 bezleri ve 5 min için her 4 dk P21 ve büyük bezleri için değiştirir. Erimiş parafin mum, 3 değişiklikleri, 7 dk P0 - P4 bezleri, sızmak ve 8 min iki kez izledi tarafından 6 dk bir kez P5 ve büyük bezleri için.
   Not: Doku işleme için en uygun parametreler ampirik olarak ayarlanabilir. Yüksek kaliteli bölümler elde etmek için yaşında veya yetersiz dehidrasyon kaçınılmalıdır. Aynı Ksilen kullanarak doku temizlenmesi için geçerlidir.
2. Katıştırırken yönlendirme
   1. konsol sistemi, gömme bir doku üzerinde örnek kaset çıkarın ve yarı erimiş parafin mum ile dolu temel bir kalıp içine yerleştirin. Gömme hipofiz bezinin uygun yönlendirmeyi koronal bölümleri tatmin edici esastır.
   2. İçin P21 ve yetişkin hipofiz bezleri, hipofiz bezi temel kalıp (bölüm uçak) alt yüzeyine dik kısa ekseni ile getirin. Ense kemikler ve trigeminal sinir anatomik yerlerinden P0 - P4 ve P5 - P14 pituitaries, sırasıyla kullanın. Numuneler ile onların trigeminal sinir ya da enine lamina ense kemik bir temel kalıp alt yüzeyine dik orient.
   Balmumu soğutma tabağa yarı katı hale gelene kadar
   3. yavaşça doku istenen konumda ısıtılmış ince Forseps ile tutun. Kalıp erimiş parafin mum ile kontör. Balmumu tamamen katılaşmış kadar soğumasını parafin blok izin.
      Not: Hipofiz (E18.5) embriyonik gün 18,5 yenidoğan hipofiz olarak aynı şekilde tedavi edilebilir. Ama pituitaries (Rathke ' s torbalar içinde) E16.5 ile tüm baş gömülü ve temel bir kalıp alt yüzeyine dik sagittal eksen (ağzından occiput) ile odaklı daha genç değil.
3. Sonra kesti ve parafin blok için 10-20 dk-20 ° C'de soğuk içine ince dilimleri (4 µm kalınlık tercih edilir) ile bir microtome. Tatmin edici koronal bölümler elde etmek için ince kesit sırasında parafin blok konumunu ayar. Doku dilimleri dilimleri aşağıdaki yordamlar dekolmanı önlemek için polylysine kaplı cam slaytlar üzerine monte.
   Not: Alternatif olarak, örneklerin % 15, susuz %30 (W/V) Sükroz çözümlerinde (PBS) aynı yönlendirme yöntemini kullanarak bileşik cryo katıştırma katıştırılmış ve hızlı bir şekilde kuru buzda donmuş alt lavabo kadar 4 ° C'de. O zaman donmuş doku bloklar bir cryostat kullanarak 8-10 µm dilimler halinde kesin. Cryo-kesitler, Morfoloji ancak, sık sık alkol bölümleri aşağı kalır yanı yok.

3. H & E boyama ve ayirt etiketleme

1. , sıcak bir ısı slaytlarda blok 55 ° C'de ve dewax Ksilen, 2 değişiklik, 4 dk ile her. % 95 etanol iki kez ve % 75 etanol iki kez, 3 dk örnekleriyle kurutmak. Slayt üzerinde bir shaker 5 min için distile su ile yıka.
2. H için & E boyama, şap Hematoksilen çözüm için 6 dk bölümlerde leke, durulama runn içindeIng musluk suyu 2 dakika, 45 s ve durulama akan suyun 2 dakika içinde yeniden için % 0,2 amonyaklı su ile ayırt etmek. 1 dk ve leke için 2 min. Eozin ile sırayla kurutmak, Sil ve mount için % 95 etanol bölümlerle kurutmak.
3. 1. Ayirt etiketleme bölümleri % 3 H ₂ O ₂ ve % 0,01 NaN ₃ endojen peroxidases devre dışı bırakabilirsiniz için oda sıcaklığında 20 dakika içeren metanol ile tedavi. 37 30 dk için engelleme arabellek (%5 keçi serum içinde PBS) bölümlerle bir düdüklü tencere 2 dk. Incubate alma arabellek (1 mM EDTA ve 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) bölümlerinde kaynatılarak antijenleri almak ° C.
   2. Engelleme arabellekte gecede 4'te seyreltilmiş bölümleri tavşan Anti-büyüme hormonu (GH) antikor (1:2, 000) veya tavşan anti-gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) antikor (1:2, 000) ile kuluçkaya ° C.
   3. 35 dk. 37 için ikincil antikor (keçi Anti-tavşan IgG-HRP, 1:300 engelleme arabelleği) bölümlerle kuluçkaya ° C.
   4. 15 dakika oda sıcaklığında Biotinyl Tyramide (1:50 Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik içeren %0,3 H ₂ O ₂) kullanarak sinyalleri yükseltmek ve Streptavidin-Alexa594 veya 488 (kapatmaktır tampon, 30 dk, 37 ° C 1:300) ile görselleştirmek.
   5. Counterstain DAPI (50 mg/L PBS) ile çekirdeği oda sıcaklığında 5 min için.
      Not: Tyramide sinyal güçlendirme (TSA) sistemi kullanarak sinyali yükseltmek gerekli olmayabilir. Alternatif olarak, Floresans Birleşik ikincil antikor sinyal görselleştirmek için kullanılabilir.
4. Floresan mikroskop kullanarak edinme görüntüleri 40/0,75 hedefleri ve 5,0 megapiksel kamera DAPI, Texas kırmızı ve FITC filtre setleri, × 4/0,13 × ile donatılmıştır. 360, 488 ve 594 nm lazer dalga boyu görüntüleme DAPI, Alexa 488 - ve kesitler, Alexa 594 lekeli için sırasıyla kullanın. Lazer güç en iyi duruma getirme (0,8 genellikle kullanıldı) ve her kanal için istenilen düzeylere çekim hızı. Görüntü alma yazılımı kontrol altında görüntü yakalama ve daha sonra görüntü işleme yazılımı kullanarak floresan görüntü.

Bu iletişim kuralı fareler gelişmekte olan hipofiz bezleri incelemek için bir yöntem sunuyor. Yenidoğan fare, hipofiz bezi, trigeminal sinir ve iç çamaşırım içeren tüm sella bölgelerin ense kemik kafatası tabanından dışarı disseke. Küçük ve narin hipofiz bezi (şekil 1A) işlemi sırasında olduğu gibi kaldı. 5 günden daha eski fareler için yanal trigeminal sinir bağlı hipofiz bezleri o zamanlar izole. Fare iyi korunmuş P7 izole hipofiz bezi (şekil 1B) brüt yapısı. P21 fare için hipofiz bezi boyutunu oldukça yenidoğan fare kıyasla arttı. Hipofiz bezi onun çevre dokular (şekil 1 c) kaldırılırken görünmez hasar ile başarılı bir şekilde izole edildi.

En büyük bölge adenohipofiz ve nörohipofiz hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için koronal bir bölümü tercih edilir. Disseke hipofiz bezleri koronal bölümleri tatmin elde etmek için düzgün odaklı. H & E de gösterdi boyama korunmuş Morfoloji adenohipofiz ve nörohipofiz P0, P7 ve P21 hipofiz bezleri (Resim 2).

İşlenmiş dilimleri de ayirt etiketleme ile uyumlu idi. Örneğin, adenohipofiz ve GH ve GFAP'nin, belirli immunolabeling sırasıyla gösterdi nörohipofiz (şekil 3).

Şekil 1: Doğum sonrası gelişen hipofiz bezlerinin diseksiyon. Dorsal sayısı disseke hipofiz bezleri ve çevre dokular P0, P7 ve P21 fare üzerinden. A, ön; P, posterior; L, sol; R, doğru; SB, ense kemik; TN, trigeminal sinir; AH, adenohipofiz; NH, nörohipofiz. Ölçek çubukları, 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: fare hipofiz bezlerinin Histoloji. Temsilcisi H & E P0, P7 ve P21 fareler hipofiz koronal bölümleri üzerinde boyama. (A, Bve C) Koronal pituitaries, düşük büyütme görünümler vardır. (D, Eve F) (A, Bve C) içinde belgili tanımlık çerçeveli alan genişleme sırasıyla vardır. Ölçek çubukları = 1 mm içinde (A, B ve C); ve 20 µm (D, E ve F). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: temsilcisi immünfloresan hipofiz bezleri üzerinde boyama. (A)GH (kırmızı) özellikle adenohipofiz P7 fareler gelen içinde ifade. (B) Magnified görüntü A. (C) GFAP'nin (yeşil) çerçeveli alanında özellikle nörohipofiz P21 fareler gelen içinde ifade. (D) Magnified görüntü C. çekirdeği çerçeveli alanında DAPI (mavi) ile lekeli. Ölçek çubuğu = 300 µm (A ve C); ve 30 µm (B ve D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Fare pituitaries geliştirmek için bu küçük ve kırılgan özellikleri ve benzersiz anatomik özellikleri^6,8nedeniyle uygun koronal bölümler elde etmek teknik olarak zor oldu. Bazı araştırma grupları böylece embriyonik ve neonatal hipofiz^11,12morfolojisi çözümlemek için orta-sagittal bölümleri seçti. Yine de hipofiz orta-sagittal bölümünü de anterior, orta gösterilen yeteneğine sahiptir ve bu üç LOB maksimum bir görünüm gösterebilir posterior LOB tek bir dilim içinde koronal bölüm çok tercih edilir. Özellikle, birimin belirlenmesi ve hipofiz bezi ve apoptotik sayılması ve hücreleri, Proliferasyona alanı gibi miktar Etütler koronal bölümleri, temsilcilerine açısından-sagittal bölümlerine üstündür. Burada, hipofiz bezleri teşrih ve fareler gelişmekte olan hipofiz koronal bölümleri hazırlamak yararlı bir yöntem mevcut.

Hipofiz bezleri işlemi sırasında zarar görmesini önlemek için bu protokol için çeşitli teknikler kullanılmıştır. İlk olarak, fare transcardial perfüzyon formaldehit diseksiyon önce tarafından sabitlenir. Bu sabitleştirici sadece organ mimari korumak için aynı zamanda genellikle otomatik Floresans¹³' te neden kırmızı kan hücreleri kaldırmak için yardımcı olur. İkinci olarak, herhangi bir cerrahi zor araçlarıyla hipofiz bezi dokunmaktan kaçının için tüm sella bölge kesmiştim. Çevre dokular hipofiz bezi orijinal konumunda tutmak ve aynı zamanda yönlendirme katıştırma için simge olarak hizmet için yardım. İstihdam bu yöntemler ile daha küçük postnatal pituitaries genç hayvanlar üzerinden istenmeyen zarar olasılığını azaltmak iken disseke.

Bu iletişim kuralı diseksiyon yordamda da perfüzyon tarafından önceden sabit değil fare hipofiz yalıtmak için geçerlidir. Bu durumda, herhangi bir istenmeyen zarar önlemek için daha fazla dikkatli alınmalıdır ve bezi de kısa zamanda disseke.

Gelişmekte olan fare pituitaries boyutu çok küçük olduğundan, onları düzgün Katıştırırken yönlendirmek çok zor olmuştur. Bu protokol trigeminal sinir veya ense kemik yönlendirme adımlar çok daha kolay hale yerler kullanır. Düzgün odaklı pituitaries koronal bölümleri tatmin edici ulaşmak için gereklidir.

Özetle, biz gelişmiş bir hipofiz diseksiyon ve farklı geliştirme aşamalarında fareler için uygun iletişim kuralı katıştırma sağlar. Bu yordamlardan birini uygulama rutin Histoloji, immünhistokimya, in situ hibridizasyon ve gelişimsel araştırma¹⁴analizi için kullanılmak üzere fare hipofiz bezleri koronal bölümlerini tatmin elde edebilirsiniz.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31201086, 31470759 ve 31671219) ve Şangay doğal Bilim Vakfı (12ZR1436900) tarafından desteklenmiştir.