Method Article
אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.
בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס. הוא מורכב שתי בלוטות עם המקורות עובריים נפרד פונקציות – את neurohypophysis ולא את adenohypophysis. בלוטת יותרת המוח המתפתח של העכבר הוא קטן ועדין עם צורה של אליפסה מוארכת. מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר.
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג מקטעים הילתית יותרת המוח תקין עם רקמת שהשתמרו ארכיטקטורות מלפתח עכברים. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט כיצד לנתח ולעבד יותרת כראוי מלפתח עכברים. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. אז שלוש טכניקות שונות ויבתר מוחלים כדי להשיג שלמות בלוטות יותרת המוח תלוי בגילו של עכברים. עבור עוברי עכברים מגיל 17.5 ימים עובריים (E)-18.5 ו- neonates עד 4 ימים, האזורים סלה כולו לרבות עצם היתד, בלוטה, המשולש העצבים הם גזור. עבור גורים בגילאי כמחנכת ימים (P) 5-14, בלוטות יותרת המוח הקשורים המשולש העצבים הם גזור בכללותה. עבור עכברים מעל בן 3 שבועות, בלוטות יותרת המוח הם בקפידה גזור ללא תשלום מן הרקמות הסובבות. אנחנו גם להציג כיצד להטביע את בלוטות יותרת המוח בכיוון הנכון באמצעות הרקמות הסובבות כמו ציוני דרך כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. שיטות אלה שימושיים בניתוח תכונות ההתפתחותי היסטולוגית של בלוטות יותרת המוח בפיתוח עכברים.
בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס1,2. מבחינה אנטומית, בלוטת יותרת המוח היא מבנה ' שני-in-one"הכוללת את neurohypophysis, את adenohypophysis. חלקים אלה יש מקורות עובריים שונים, פונקציה אחרת. Neurohypophysis נגזרת של האאקטודרם עצבית, מפריש אוקסיטוצין, הורמון antidiuretic. Adenohypophysis מקורו נרתיק של ראת'קי, אחראי על השחרור של הורמונים לרבות הורמון גדילה, פרולקטין, תירוטרופין, הורמון מגרה זקיק, הורמון מחלמן, הורמון אדרנוקורטיקוטרופי, ו מלנוציט – הורמון מגרה3,4,5.
בלוטת יותרת המוח נשענת על המשטח הגבי של עצם היתד (אשר) של הגולגולת העכבר ו מחוברת לרצפה של המוח על ידי גבעול שביר. המלון מוקף רוחבית על ידי המשולש העצבים ועל anteriorly ידי הצנטר6,7. בלוטת יש צורה של אליפסה מוארכת עם ציר זמן בניצב לראש. על השטח הגבי שלה, את neurohypophysis, את adenohypophysis יכול בקלות להיות התחום, עם לשעבר הכובש המדיאלי האזור הגבי ולהרחיב את האחרון רוחבית ולא ventrally. במהלך פיתוח כמחנכת, בגודל של יותרת המוח גדל במהירות בחודש הראשון לאחר הלידה8,9. בכל זאת, ההיפופיזה העכבר הוא עדיין קטן מאוד בגודלם במשקל ממוצע של 1.9 מ"ג, קוטר ציר זמן של ~ 3 מ מ למבוגרים10, קוטר ציר זמן של 2-2.5 מ"מ ביום כמחנכת 21 (P21), ולא רק 1-1.5 מ"מ P0.
מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר. עם זאת, כישורים טכניים נדרשים להשיג סיפוק הילתית חלקים ובלוטות יותרת המוח פיתוח עכברים בשל גודל קטן במיוחד שלה האנטומיה ברורה. במאמר זה וידאו, נדגים כיצד לנתח העכבר יותרת ולהכין מקטעים הילתית יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.
C57BL/6 עכברים מובאים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. כל שיטות ניסוי בבעלי חיים הם בהתאם להנחיות אושרה על ידי חיה אכפת ועדת האתיקה-השנייה הצבאי לרפואה של אוניברסיטת.
1. דיסקציה של כמחנכת פיתוח בלוטת יותרת המוח
2. שעוות פרפין Embedding ו Sectioning
3. H & E מכתים ולקרוא Immunofluorescence
פרוטוקול זה מציג שיטה לנתח יותרת מלפתח עכברים. עבור העכבר neonatal, האזורים סלה שלם המכיל את בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש, במסווה עצם היתד היו גזור החוצה מבסיס הגולגולת. בלוטת יותרת המוח קטן ועדין נותרו על כנן במהלך התהליך (איור 1 א'). בלוטות יותרת המוח קשורה העצבים המשולש לרוחב עכברים שגילן עולה על 5 ימים, היו אז מבודד. המבנה ברוטו של בלוטת יותרת המוח מבודד את P7 העכבר השתמר היטב (איור 1B). עבור העכבר P21, בגודל של בלוטת יותרת המוח היה גדל במידה ניכרת בהשוואה לזה של העכבר neonatal. בלוטת יותרת המוח הופרדה בהצלחה עם נזק בלתי נראה בעת הסרת הרקמות הסובבות שלו (איור 1C).
כדי להציג את האזור המרבי של adenohypophysis והן neurohypophysis בפרוסה אחת של בלוטת יותרת המוח, מקטע הילתית היא עדיפה. בלוטות יותרת המוח ביתור היו מכוונת כראוי כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. H & E מכתים הראה גם נשמר מורפולוגיה של adenohypophysis ושל neurohypophysis בלוטות יותרת המוח P0, P7 ו- P21 (איור 2).
הפרוסות מעובד היו גם תואם immunofluorescence תיוג. כדוגמה, את adenohypophysis ואת neurohypophysis הראה immunolabeling ספציפיים של GH ו- GFAP, בהתאמה (איור 3).
איור 1: דיסקציה של בלוטות יותרת המוח המתפתח כמחנכת. נופים הגבי של ביתור בלוטות יותרת המוח ואת הרקמות הסובבות מ P0, P7 ו- P21 עכברים. A, קדמי; P, אחורי; L, משמאל; R, נכון; SB, עצם היתד; TN, העצב; אה, adenohypophysis; מלון NH, neurohypophysis. גודל ברים, 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: היסטולוגיה של העכבר יותרת. נציג H & E מכתים במקטעי הילתית יותרת המוח של עכברים P0, P7 ו- P21. (A, Bו- C) נשקף נוף הגדלה נמוכה של pituitaries הילתית. (D, Eו- F) הם הגדלה של האזורים ממוסגרות (A, Bו- C) בהתאמה. גודל ברים = 1 מ מ ב (A, B ו- C); ו- 20 מיקרומטר (D, E ו- F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: צביעת immunofluorescent נציג על בלוטות יותרת המוח- GH (A) (אדום) בא במיוחד לידי את adenohypophysis מ- P7 עכברים. (B) Magnified תמונה של אזור מתוחם בא (ג) GFAP (ירוק) בא במיוחד לידי את neurohypophysis מ- P21 עכברים. (ד) Magnified תמונה של אזור מתוחם ב ג גרעינים היו מוכתמים דאפי (כחול). סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר (A ו- C); 30 מיקרומטר (B ו- D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
לפיתוח מאתר pituitaries, עברו טכנית קשה להשיג מקטעים הילתית נכונה עקב שלהם תכונות זעירים, שברירית, מאפיינים אנטומיים ייחודיים6,8. כמה קבוצות מחקר ולכן בחרה מקטעים מאמצע-הווריד כדי לנתח את המורפולוגיה של עובריים ו neonatal יותרת המוח11,12. למרות המקטע מאמצע-הווריד של יותרת המוח הוא גם מסוגל להראות את הקדמי, ביניים, אונות האחורי בפרוסה אחת, המקטע הילתית מועדף מאוד מכיוון שהוא מאפשר להציג תצוגה המרבי של אלה משלוש אונות. בפרט, ללימודים כמת, כגון נחישות של אמצעי האחסון, שטח של בלוטת יותרת המוח, ספירת מספר אפופטוטיים להיפגע, מתרבים תאים, סעיפים הילתית נעלים על סעיפים מאמצע-הווריד במונחים של נציג שלהם. כאן, אנו מציגים שיטה שימושית לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.
כדי למנוע פגיעה בלוטות יותרת המוח במהלך התהליך, מספר טכניקות נעשה שימוש בפרוטוקול זה. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. זה מקבע מסייע לא רק לשמר את הארכיטקטורה איברים אלא גם כדי להסיר תאי דם אדומים אשר לעיתים קרובות לגרום אוטומטי פלורסצנטיות13. שנית, האזור כולו סלה זה גזור כדי להימנע מלגעת בלוטת יותרת המוח עם כל כלי הקשה-ניתוח. הרקמות הסובבות לעזור לשמור את בלוטת יותרת המוח במצב המקורי גם לשמש ציוני דרך להטבעת התמצאות. באמצעות שיטות אלה המועסקים, יכול ניסויים קטנים כמחנכת pituitaries מבעלי חיים צעירים תוך הפחתת ההסתברות לנזק בלתי רצויה.
ההליך דיסקציה של פרוטוקול זה חל גם לבודד את יותרת המוח מאתר זה לא קדם תוקנה על ידי זלוף. במקרה הזה, יותר זהירות יש לנקוט כדי למנוע נזק בלתי רצויה, גם צריך להיות גזור בלוטת מהר ככל האפשר.
מאז pituitaries מאתר המתפתח הם מאוד קטנים בגודלם, עבר מאוד קשה להתמצא בהם כראוי בעת הטבעה. פרוטוקול זה משתמש את המשולש העצבים או עצמות היתד ציוני דרך, ביצוע השלבים התמצאות הרבה יותר קל. Pituitaries מונחה כראוי חיוניים להשגת סיפוק מקטעים הילתית.
לסיכום, אנו מספקים ניתוח יותרת המוח משופרת של הטמעת נהלים, אשר מתאים עכברים בשלבי התפתחות שונים. יישום של נהלים אלה ניתן להשיג סיפוק הילתית חלקים מאתר בלוטות יותרת המוח כדי לשמש לניתוח של היסטולוגיה שגרתית, אימונוהיסטוכימיה, בחיי עיר הכלאה מחקר התפתחותי14.
המחברים אין לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31201086, 31470759 ו- 31671219) וקרן מדעי הטבע שנגחאי (12ZR1436900).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tools/Equipment | |||
Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Urethane | BBI | EB0448 | |
NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
NaNO2 | Sigma | 237213 | |
Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Ethanol | SCR | 10009218 | |
Xylene | SCR | 10023418 | |
Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
antibody | Pituitary Program | ||
Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved