ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס. הוא מורכב שתי בלוטות עם המקורות עובריים נפרד פונקציות – את neurohypophysis ולא את adenohypophysis. בלוטת יותרת המוח המתפתח של העכבר הוא קטן ועדין עם צורה של אליפסה מוארכת. מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר.

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג מקטעים הילתית יותרת המוח תקין עם רקמת שהשתמרו ארכיטקטורות מלפתח עכברים. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט כיצד לנתח ולעבד יותרת כראוי מלפתח עכברים. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. אז שלוש טכניקות שונות ויבתר מוחלים כדי להשיג שלמות בלוטות יותרת המוח תלוי בגילו של עכברים. עבור עוברי עכברים מגיל 17.5 ימים עובריים (E)-18.5 ו- neonates עד 4 ימים, האזורים סלה כולו לרבות עצם היתד, בלוטה, המשולש העצבים הם גזור. עבור גורים בגילאי כמחנכת ימים (P) 5-14, בלוטות יותרת המוח הקשורים המשולש העצבים הם גזור בכללותה. עבור עכברים מעל בן 3 שבועות, בלוטות יותרת המוח הם בקפידה גזור ללא תשלום מן הרקמות הסובבות. אנחנו גם להציג כיצד להטביע את בלוטות יותרת המוח בכיוון הנכון באמצעות הרקמות הסובבות כמו ציוני דרך כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. שיטות אלה שימושיים בניתוח תכונות ההתפתחותי היסטולוגית של בלוטות יותרת המוח בפיתוח עכברים.

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס^1,2. מבחינה אנטומית, בלוטת יותרת המוח היא מבנה ' שני-in-one"הכוללת את neurohypophysis, את adenohypophysis. חלקים אלה יש מקורות עובריים שונים, פונקציה אחרת. Neurohypophysis נגזרת של האאקטודרם עצבית, מפריש אוקסיטוצין, הורמון antidiuretic. Adenohypophysis מקורו נרתיק של ראת'קי, אחראי על השחרור של הורמונים לרבות הורמון גדילה, פרולקטין, תירוטרופין, הורמון מגרה זקיק, הורמון מחלמן, הורמון אדרנוקורטיקוטרופי, ו מלנוציט – הורמון מגרה^3,4,5.

בלוטת יותרת המוח נשענת על המשטח הגבי של עצם היתד (אשר) של הגולגולת העכבר ו מחוברת לרצפה של המוח על ידי גבעול שביר. המלון מוקף רוחבית על ידי המשולש העצבים ועל anteriorly ידי הצנטר^6,7. בלוטת יש צורה של אליפסה מוארכת עם ציר זמן בניצב לראש. על השטח הגבי שלה, את neurohypophysis, את adenohypophysis יכול בקלות להיות התחום, עם לשעבר הכובש המדיאלי האזור הגבי ולהרחיב את האחרון רוחבית ולא ventrally. במהלך פיתוח כמחנכת, בגודל של יותרת המוח גדל במהירות בחודש הראשון לאחר הלידה^8,9. בכל זאת, ההיפופיזה העכבר הוא עדיין קטן מאוד בגודלם במשקל ממוצע של 1.9 מ"ג, קוטר ציר זמן של ~ 3 מ מ למבוגרים¹⁰, קוטר ציר זמן של 2-2.5 מ"מ ביום כמחנכת 21 (P21), ולא רק 1-1.5 מ"מ P0.

מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר. עם זאת, כישורים טכניים נדרשים להשיג סיפוק הילתית חלקים ובלוטות יותרת המוח פיתוח עכברים בשל גודל קטן במיוחד שלה האנטומיה ברורה. במאמר זה וידאו, נדגים כיצד לנתח העכבר יותרת ולהכין מקטעים הילתית יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.

C57BL/6 עכברים מובאים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. כל שיטות ניסוי בבעלי חיים הם בהתאם להנחיות אושרה על ידי חיה אכפת ועדת האתיקה-השנייה הצבאי לרפואה של אוניברסיטת.

1. דיסקציה של כמחנכת פיתוח בלוטת יותרת המוח

1. לבצע הרדמה: במקום neonatal עכברים (P0 - P5) על קרח כתוש, כדי ליצור היפותרמיה. עבור עכברים יותר 5 ימים של גיל מבוגר, להזריק urethane 5% (30 µL/g של משקל הגוף) intraperitoneally כדי לגרום הרדמה. להעריך תגובות הזנב toe צובט. להמשיך רק לאחר העכבר אינו מגיב לגירויים יתמודד.
2. לאבטח את העכבר במצב פרקדן (שוכבת על הגב עם הפנים כלפי מעלה) על ידי בעדינות מקליטה את forepaws ואת hindpaws על משטח העבודה כי הוא מסוגל להיות מוצמד (קרי, קלקר) בתוך ברדס fume כימי.
3. לבצע זלוף transcardial.
   1. לחתוך את בית החזה של העכבר עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הלב (ואיברים אחרים בית החזה).
   2. לאבטח את הלב הפועם עם מלקחיים בוטה והכנס מחט 26G (0.45 מ מ) לתוך החדר השמאלי. המחט מחוברת מזרק 10 מ"ל מלא מלוחים heparinized פוספט buffered (PBS; בתוספת 5 מ"ג/מ"ל נתרן חנקיתי ו 10 הפארין U/mL, pH 7.4, לחמם עד 37 ° C לפני השימוש). מיד אטריום ימין עם מספריים בסדר גזורה להתחיל perfuse לגוף PBS חמים עד הנוזל יציאה אטריום ימין ברור.
      הערה: משוער 5-10 mL PBS יש צורך עכברים neonatal ו- 10-20 מ ל PBS עבור עכברים בוגרים.
   3. להשאיר את המחט מקום ושנה נוספת מזרק מלא עם 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7.4). Perfuse 10 mL ו- 20 מיליליטר מקבע עבור neonatal ועכבר P21, בהתאמה.
      התראה: PFA רעיל. הוא עלול לגרום לעור גירויים הנשימה ואת העין נזק. יש ללבוש כפפות ולעבוד תחת ברדס כימי.
4. לערוף את העכבר מחברים-קבוע וחתך את הגולגולת עם מספריים.
   1. הרם בעדינות את hindbrain מבסיס הגולגולת עם מלקחיים קטנים. -הסימן הראשון אשר, להפסיק להרים אך להחזיק hindbrain, חותכים את גבעול יותרת המוח, סיבי עצב התחברות לבסיס של המוח עם מספריים משובחים. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי בלוטת יותרת המוח לא יוסר משם עם המוח.
   2. לאחר מכן להרים את המוח, להסיר את זה. כדי לחשוף את בלוטת יותרת המוח באופן מלא. לחתוך את האזור כולו סלה כולל בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש לרוחב, ו מתחת עצם היתד עם מספריים (כ 3 x 5 מ מ ²).
5. להכניס את הרקמה ביתור תבשיל 35 מ מ או אחד טוב של צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ"ל קר 4% מחברים (pH 7.4). לתקן את הרקמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות בשביל P0 - P7 pituitaries, 1h לציון P14 pituitaries, ה 1.5 עבור P21 - P28 pituitaries, ו- h 3 עבור מבוגרים pituitaries.
6. נוסף דיסוציאציה של יותרת המוח
   1. לרחוץ הרקמה קבוע עם 10 מ"ל PBS, שינויים 5, 15 דקות כל אחד. בלוטת יותרת המוח neonatal יחד עם הרקמות הסובבות שלו ואת מתחת עצם היתד יעובד ישירות על התייבשות. עם זאת, צריך להיות הפומבית יותרת מן העכברים שגילן עולה על 5 ימים נוספים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   2. לשים את הרקמה קבוע לתוך תבשיל 35 מ מ המכיל 1 מ"ל PBS. P5 - P14 pituitaries, להסיר את הקרומים חיבור בין העצבים והעצם עם בסדר. מלקחיים ומספריים, בזהירות לבודד את בלוטת יותרת המוח יחד עם העצבים המשולש לרוחב שלם אלא עוזב את אשר. בלוטת מבודד ועצבים מחוברים באמצעות ממברנות חיבור עם " H "-אוהב את המראה ( איור 1B).
   Pituitaries
   3. עבור P21, מבוגר, להסיר את העצבים ואת ממברנות חיבור מסביב בלוטת יותרת המוח, חופשית בלוטת מן הרקמות הסובבות. עוטפים את רקמת יותרת המוח עם עדשה ניקוי נייר טישו ולשים אותו קלטת ההטבעה.
      הערה: גלישת בלוטת יותרת המוח זעיר עם עדשה ניקוי נייר טישו מסייע למנוע אובדן פוטנציאלי של דגימות לשמר את שלמות רקמות בפרוצדורה הטבעה-פרפין הבאה. זה ייתכן שלא יהיה צורך לעטוף את בלוטת יותרת המוח אם היא מעובדת בבקבוקון קטן בהליך הטמעת הקפאה.

2. שעוות פרפין Embedding ו Sectioning

1. מייבשים דגימות ב הטבעה קלטות עם 50%, 65%, 75% ו-95% אתנול פתרונות למשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן מייבשים עם 3 שינויים של כוהל טהור, 3 דקות כל עבור P0 - P4 בלוטות, 4 דקות לכל עבור P5 - בלוטות P14, ו 5 דקות כל עבור P21 ובלוטות בוגרים. מעונן חלקית עם קסילן, 3 משתנה, 3 דקות כל עבור P0 - P4 בלוטות, 4 דקות לכל עבור P5 - בלוטות P14, ו 5 דקות כל עבור P21 ובלוטות בוגרים. לחדור עם מותך פרפין, שינויים 3, 7 דקות כל עבור P0 - בלוטות P4, ואחריו 8 דקות פעמיים 6 דקות פעם עבור P5 ובלוטות מבוגר.
   הערה: פרמטרים אופטימליים לעיבוד רקמות יכול להיות מדעית מותאם. כדי להשיג חלקים באיכות גבוהה, יש להימנע התייבשות לא מספיקות או נגמר. הדבר נכון עבור ניקוי הרקמה באמצעות קסילן.
2. התמצאות בעת הטבעה
   1. על טישו הטמעת מערכת מסוף, להסיר את הדגימה הקלטת ומקם אותה לתוך תבנית הבסיס מלא למחצה עם מותך פרפין. כיוון נכון של בלוטת יותרת המוח ההטבעה חיוני סיפוק מקטעים הילתית.
   בלוטות יותרת המוח
   2. עבור P21, מבוגר, מקם את בלוטת יותרת המוח עם ציר קצר בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס (המטוס סעיף). להשתמש היתד עצמות ועצבים המשולש בתור ציוני אנטומיים P0 - P4, P5 - P14 pituitaries, בהתאמה. אוריינט דגימות עם המשולש העצבים או פרופריה חציה של היתד עצמות בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס שלהם.
   עם מלקחיים בסדר ומחוממת,
   3. החזק בעדינות את הרקמה במיקום הרצוי עד שהשעווה הופך מוצק למחצה על צלחת קירור. למעלה למעלה את התבנית עם מותך פרפין. לאפשר לבלוק פראפין להתקרר עד השעווה לחלוטין פני השטח למוצק.
      הערה: בלוטת יותרת המוח ביום עובריים 18.5 (E18.5) יכולים להיות מטופלים באופן זהה כמו בלוטת יותרת המוח neonatal. אבל pituitaries (ראת'קי ' s שקיות) יותר צעיר ממה צריך להיות מוטבע עם הראש כולו, מונחה עם הציר הסאגיטלי (מתוך הפה כדי occiput) בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס E16.5.
3. להירגע לבלוק פראפין ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות ולאחר מכן לחתוך אותו לתוך דק לפרוסות (עובי 4 מיקרומטר הוא מועדף) עם מיקרוטום. כדי לקבל את המקטעים הילתית משביע רצון, לכוונן את המיקום של פרפין בלוקים במהלך חלוקתה. לטעון את הפרוסות רקמות על גבי זכוכית מצופים polylysine שקופיות כדי למנוע התנתקות של פרוסות בהליכים הבאים.
   הערה: לחלופין, דגימות יכול להיות מיובש ב 15%, 30% (W/V) פתרונות סוכרוז (ב- PBS) ב 4 ° C עד הם שוקעים לתחתית, משובצים במתחם הטבעה-הקפאה באמצעות אותה שיטה שבה התמצאות, במהירות קפוא בקרח יבש. ואז חותכים את רקמת קפוא פרוסות של 8-10 מיקרומטר באמצעות cryostat. המורפולוגיה של הקפאה-מקטעים, עם זאת, לעיתים קרובות נחות הפרפין מקטעים.

3. H & E מכתים ולקרוא Immunofluorescence

1. חמים השקופיות על חום לחסום ב 55 ° C ו- dewax עם קסילן, 2 שינויים, 4 דקות כל אחד. מייבשים את הדגימות עם 95% אתנול פעמיים, 75% אתנול פעמיים, 3 דקות כל אחד. לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים למשך 5 דקות על מטרף.
2. עבור H & E מכתים, כתם בסעיפים אלום hematoxylin פתרון 6 דקות, לשטוף בשחקן פוטבול פועלing מי ברז למשך 2 דקות, להבדיל במים אמוניה 0.2% 45 s ו מחדש לשטוף במים למשך 2 דקות. לאחר מכן מייבשים הסעיפים עם אתנול 95% 1 דקות, הכתם עם אאוזין עבור 2 דק ברצף מייבשים, נקה, ואת הר-
3. Immunofluorescence תיוג
   1. פנקו הסעיפים עם מתנול המכיל 3% H ₂ O ₂ ו- 0.01% נאן ₃ עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשבית peroxidases אנדוגני. לאחזר אנטיגנים על ידי הרתחה ובסעיף המאגר אחזור (EDTA 1 מ"מ ו 1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4) בסיר לחץ במשך 2 דק Incubate הסעיפים באמצעות מאגר חסימה (סרום עיזים 5% ב- PBS) במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
   2. דגירה מקטעים עם הארנב הורמון אנטי-גדילה (GH) נוגדנים (1:2, 000) או ארנב נוגדן anti-גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) (1:2, 000) מדולל במאגר חסימה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס
   3. תקופת דגירה מקטעים עם נוגדנים משניים (עז נגד הארנב IgG-HRP, 1:300 במאגר חסימה) של 35 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
   4. להגביר את האותות באמצעות Biotinyl Tyramide (1:50 בתוך תמיסת מלח טריס באגירה מלאה המכילה ₂ O 0.3% H ₂) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, והמחש עם Streptavidin-Alexa594 או 488 (1:300 בחסימה מאגר, 30 דקות, 37 ° C).
   5. Counterstain הגרעינים עם דאפי (50 מ"ג/ליטר ב- PBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: לא יתכן צורך להגביר את האות באמצעות מערכת הגברה האות Tyramide (TSA). לחלופין, ניתן להשתמש נוגדנים משניים מצומדת פלורסצנטיות להמחיש את האות.
4. רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד דאפי, טקסס ואדום, מערכות סינון FITC, × 4/0.13 כדי × 40/0.75 יעדים, 5.0 מגה פיקסל מצלמה. השתמש ה-360, 488, 594 ננומטר לייזר אורכי גל עבור הדמיה דאפי, אלקסה 488 - ומקטעי שהוכתמו 594 אלקסה, בהתאמה. למטב את עוצמת הלייזר (0.8 היה משמש בדרך כלל), זמן החשיפה לרמות הרצויות לכל ערוץ. ללכוד את התמונה תחת השליטה של תמונה רכישת תוכנה, כיסוי הדימויים פלורסצנטיות לאחר מכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה-

פרוטוקול זה מציג שיטה לנתח יותרת מלפתח עכברים. עבור העכבר neonatal, האזורים סלה שלם המכיל את בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש, במסווה עצם היתד היו גזור החוצה מבסיס הגולגולת. בלוטת יותרת המוח קטן ועדין נותרו על כנן במהלך התהליך (איור 1 א'). בלוטות יותרת המוח קשורה העצבים המשולש לרוחב עכברים שגילן עולה על 5 ימים, היו אז מבודד. המבנה ברוטו של בלוטת יותרת המוח מבודד את P7 העכבר השתמר היטב (איור 1B). עבור העכבר P21, בגודל של בלוטת יותרת המוח היה גדל במידה ניכרת בהשוואה לזה של העכבר neonatal. בלוטת יותרת המוח הופרדה בהצלחה עם נזק בלתי נראה בעת הסרת הרקמות הסובבות שלו (איור 1C).

כדי להציג את האזור המרבי של adenohypophysis והן neurohypophysis בפרוסה אחת של בלוטת יותרת המוח, מקטע הילתית היא עדיפה. בלוטות יותרת המוח ביתור היו מכוונת כראוי כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. H & E מכתים הראה גם נשמר מורפולוגיה של adenohypophysis ושל neurohypophysis בלוטות יותרת המוח P0, P7 ו- P21 (איור 2).

הפרוסות מעובד היו גם תואם immunofluorescence תיוג. כדוגמה, את adenohypophysis ואת neurohypophysis הראה immunolabeling ספציפיים של GH ו- GFAP, בהתאמה (איור 3).

איור 1: דיסקציה של בלוטות יותרת המוח המתפתח כמחנכת. נופים הגבי של ביתור בלוטות יותרת המוח ואת הרקמות הסובבות מ P0, P7 ו- P21 עכברים. A, קדמי; P, אחורי; L, משמאל; R, נכון; SB, עצם היתד; TN, העצב; אה, adenohypophysis; מלון NH, neurohypophysis. גודל ברים, 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: היסטולוגיה של העכבר יותרת. נציג H & E מכתים במקטעי הילתית יותרת המוח של עכברים P0, P7 ו- P21. (A, Bו- C) נשקף נוף הגדלה נמוכה של pituitaries הילתית. (D, Eו- F) הם הגדלה של האזורים ממוסגרות (A, Bו- C) בהתאמה. גודל ברים = 1 מ מ ב (A, B ו- C); ו- 20 מיקרומטר (D, E ו- F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: צביעת immunofluorescent נציג על בלוטות יותרת המוח- GH (A) (אדום) בא במיוחד לידי את adenohypophysis מ- P7 עכברים. (B) Magnified תמונה של אזור מתוחם בא (ג) GFAP (ירוק) בא במיוחד לידי את neurohypophysis מ- P21 עכברים. (ד) Magnified תמונה של אזור מתוחם ב ג גרעינים היו מוכתמים דאפי (כחול). סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר (A ו- C); 30 מיקרומטר (B ו- D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לפיתוח מאתר pituitaries, עברו טכנית קשה להשיג מקטעים הילתית נכונה עקב שלהם תכונות זעירים, שברירית, מאפיינים אנטומיים ייחודיים^6,8. כמה קבוצות מחקר ולכן בחרה מקטעים מאמצע-הווריד כדי לנתח את המורפולוגיה של עובריים ו neonatal יותרת המוח^11,12. למרות המקטע מאמצע-הווריד של יותרת המוח הוא גם מסוגל להראות את הקדמי, ביניים, אונות האחורי בפרוסה אחת, המקטע הילתית מועדף מאוד מכיוון שהוא מאפשר להציג תצוגה המרבי של אלה משלוש אונות. בפרט, ללימודים כמת, כגון נחישות של אמצעי האחסון, שטח של בלוטת יותרת המוח, ספירת מספר אפופטוטיים להיפגע, מתרבים תאים, סעיפים הילתית נעלים על סעיפים מאמצע-הווריד במונחים של נציג שלהם. כאן, אנו מציגים שיטה שימושית לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

כדי למנוע פגיעה בלוטות יותרת המוח במהלך התהליך, מספר טכניקות נעשה שימוש בפרוטוקול זה. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. זה מקבע מסייע לא רק לשמר את הארכיטקטורה איברים אלא גם כדי להסיר תאי דם אדומים אשר לעיתים קרובות לגרום אוטומטי פלורסצנטיות¹³. שנית, האזור כולו סלה זה גזור כדי להימנע מלגעת בלוטת יותרת המוח עם כל כלי הקשה-ניתוח. הרקמות הסובבות לעזור לשמור את בלוטת יותרת המוח במצב המקורי גם לשמש ציוני דרך להטבעת התמצאות. באמצעות שיטות אלה המועסקים, יכול ניסויים קטנים כמחנכת pituitaries מבעלי חיים צעירים תוך הפחתת ההסתברות לנזק בלתי רצויה.

ההליך דיסקציה של פרוטוקול זה חל גם לבודד את יותרת המוח מאתר זה לא קדם תוקנה על ידי זלוף. במקרה הזה, יותר זהירות יש לנקוט כדי למנוע נזק בלתי רצויה, גם צריך להיות גזור בלוטת מהר ככל האפשר.

מאז pituitaries מאתר המתפתח הם מאוד קטנים בגודלם, עבר מאוד קשה להתמצא בהם כראוי בעת הטבעה. פרוטוקול זה משתמש את המשולש העצבים או עצמות היתד ציוני דרך, ביצוע השלבים התמצאות הרבה יותר קל. Pituitaries מונחה כראוי חיוניים להשגת סיפוק מקטעים הילתית.

לסיכום, אנו מספקים ניתוח יותרת המוח משופרת של הטמעת נהלים, אשר מתאים עכברים בשלבי התפתחות שונים. יישום של נהלים אלה ניתן להשיג סיפוק הילתית חלקים מאתר בלוטות יותרת המוח כדי לשמש לניתוח של היסטולוגיה שגרתית, אימונוהיסטוכימיה, בחיי עיר הכלאה מחקר התפתחותי¹⁴.

המחברים אין לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31201086, 31470759 ו- 31671219) וקרן מדעי הטבע שנגחאי (12ZR1436900).