Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

Nematodun, Caenorhabditis elegans'ın , nüfusa dayalı bir deneyde çözünür bileşikler için tercihinin otomatik analizini sağlayan bir davranış kayıt kurulumu ve protokolü sunuyoruz. Bu makale bir davranış odasının inşasını, davranışsal analiz protokolünü ve video analiz yazılımının kullanımını anlatıyor.

Nematod, Caenorhabditis elegans'ın sadece 302 nöron kompakt sinir sistemi, çeşitli davranış repertuarının altında yatıyor. Bu davranışların altında yatan sinirsel devrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için sağlam ve tekrarlanabilir davranışsal testlerin geliştirilmesi gereklidir. Önceki C. elegans davranış araştırmaları, C. elegans'ın çözünebilir bileşiklere verdiği tepkiyi araştırmak için bir "düşme testi", "kemotaksis testi" ve "tutma testi" varyasyonlarını kullandı. Bu makalede açıklanan yöntem, yukarıda belirtilen üç tahlilin tamamlayıcı güçlerini birleştirmeyi amaçlamaktadır. Kısaca, her tahlil plakasının ortasındaki küçük bir daire, kontrol ve deneysel solüsyonlar dönüşümlü olarak yerleştirilen dört kadrana bölünür. Solucanlar ilâve edildikten sonra, tahlil plâkaları, mikroskop kameralarının solucanların muamele görmüş bölgelerle olan karşılaşmalarını kaydeden bir davranış odasına yüklenir. Otomatik video analizi daha sonraNd her video için bir tercih indeksi (PI) değeri oluşturulur. Bu yöntemin video edinimi ve otomatik analiz özellikleri deneycinin katılımını ve ilişkili hataları en aza indirir. Ayrıca, test başına dakikalık deney bileşiği miktarı kullanılır ve davranış odasının çok kamera kurulumu deneysel çıktı miktarını artırır. Bu yöntem, genetik mutantların ve yeni kimyasal bileşiklerin davranışsal ekranlarının yürütülmesi için özellikle yararlıdır. Bununla birlikte, bu yöntem, kontrol ve deneysel çözelti bölgelerinin yakınlığına bağlı olarak uyaran gradyan navigasyonunun incelenmesi için uygun değildir. Sadece küçük bir solucan popülasyonu mevcut olduğunda da kullanılmamalıdır. Mevcut formdaki çözünebilir bileşiklere verilen cevapların sadece test edilmesi için uygun olmakla birlikte, bu yöntem çok modlu duyusal etkileşimi ve optogenetik çalışmaları kolaylaştıracak şekilde kolayca modifiye edilebilir. Bu yöntem, diğer nematod türlerinin kemo-duyarlı tepkilerini denemek için de uyarlanabilir.

Hayvancılık hayvanları, çoklu duyu yöntemlerinden gelen girdileri entegre etmeli ve çevreye başarıyla gitmek için uygun davranış stratejilerini seçmelidir. Hareketli seçimi yönlendirmek için harici duyusal girdilerin sinirsel bilgiye nasıl ulaştığını ve aktarıldığını anlamak, nörobiyoloji alanında merkezi bir hedeftir. Genetik olarak eğitilebilen nematod C. elegans , duyusal biyoloji ve multimodal entegrasyonun altında yatan sinirsel mekanizmaları incelemek için çekici bir model organizmasıdır. C. elegans'ın sadece 302 nöronu olmasına rağmen, çözünebilir bileşikler, uçucu koku maddeleri ve ortam sıcaklığı ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} dahil çok çeşitli çevresel uyarıları tespit edebilir ve ayrım yapabilir.Nematod C. elegans , besin kaynaklarını lokalize etmek ve potansiyel tehditlere karşı kendisini uyarmak için kimyasal duyu aygıtına dayanır. Bu nedenle, vahşi tip ve mutant C. elegans'ın kimyasal uyaranlara verdiği yanıtları taramak için tasarlanmış davranış testleri, C. elegans'ın dikkat çekici duyusal yeteneklerinin altında yatan genetik, hücresel ve sinirsel mekanizmaların ayrılmasında hayati bir rol oynamaktadır.

Çözünür bileşiklere verilen cevabı test etmek için, düşme testi, kemotaksis tahlili ve tutma tayini olmak üzere üç tip tahlil tarif edilmiştir. Düşme testinde, bileşimin küçük bir damlası, hareket eden bir solucanın kuyruğuna yerleştirilir ve ön solunum cihazına sıvı ulaştığında solucan ileri geri veya ters hareket etme kararı verilir ⁴ . Düşme testi, çok az deneysel hazırlık gerektirir ve solucanların örnek boyutu küçük olduğunda (lazerle çalışan solucanlar gibi) kullanışlıdır. Bununla birlikte, yalnızca bir solucan gibiBir seferde denenebilir ve deneyci testin süresi boyunca mevcut olmalı, damla testi zaman alıcı olabilir. Düşme testi ayrıca, bir numunedeki her solucan arasındaki damla aktarımındaki varyasyonlara karşı savunmasızdır ve bu da tahlilin genel sonuçlarını etkileyebilir. Düşme testinin bir diğer kısıtlaması, bileşiğin solucan ileri hareketinden çekici veya nötr bir etki arasında ayrım yapmanın mümkün olmadığı için yalnızca solucanın aversive bileşiklere verdiği tepkiyi tahlil etmek için kullanılabilmesidir.

Çözünür bileşikler için kemotaks analizi genellikle bir agar plakasının dört kadrana bölünmesini içerir, deneysel solüsyon iki karşıt bölmenin agarına karıştırılır ve kontrol solüsyonu diğer iki kadran ^{8 , 9'a karıştırılır} . Deneyin başlangıcında solucanlar içeren bir damla tampon plakanın ortasına yerleştirilir ve solucan sayısı Her kadran farklı zaman noktalarında puanlanır. Kemotaksis tahlili, her deneyde çok sayıda solucan test edildiği için düşme testine kıyasla daha fazla istatistiksel güç sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemin bir kısıtlaması, kemotaksis tahlil plakalarının hazırlanmasının deneysel bileşiğin büyük miktarlarını gerektirmesidir. Ascaroside sinyal molekülleri ^10'da olduğu gibi ilgilenilen bileşimi elde etmek için sınırlı miktarda karmaşık bir saflaştırma işlemi gerekiyorsa, bu, büyük ölçekli davranış ekranları yürütmeyi zorlaştıracaktır. Ek olarak, solucanların deneme boyunca manuel olarak sayılması hatalara açıktır ve sayma işlemi sırasında plakaların bozulması sonuçları etkileyebilir.

Sözü geçen iki yöntemin aksine, tutma deneyi, puanlama işlemi sırasında hatayı en aza indiren ve deneme sırasında deneycinin girişimini azaltan makine görme özelliğini kullanır > 11. Solucan davranışının video kayıtlarının bilgisayar ortamında analizi potansiyel olarak, puanlama sadece birkaç ayrı zaman noktasında gerçekleştirildiğinde kaçılacak daha belirsiz davranışsal dinamikleri ortaya çıkarabilir. Tutulum testinde, küçük yuvarlak bakteriyel yemeğin karşı taraflarına iki çözelti lekesi eklendikten sonra, yem yamasının ortasında az sayıda solucan yerleştirildi. Solucanlar 'davranışları daha sonra video kaydedilir, analiz edilir ve bir tercih endeksi değeri her solüsyon bölgesindeki toplam solucan piksel sayısına göre hesaplanır. Çekici bir yeme örneğinin bulunması, her tahlilde daha küçük popülasyon solucanları kullanılmasına rağmen, gıda, daha önce çözünebilir iticilere karşı kaçınma davranışlarını hassaslaştırdığı gösterilmiştir ¹² . Ayrıca, solucanlar kısa dalga boyundaki ışığa karşı fotofobik bir tepki gösterir ve davranış kaydı ayarında beyaz ışık yayan mikroskop ışık kaynaklarının kullanımı davranışları etkileyebilirS = "xref"> 13.

Bu makalede ele alınan yöntemin amacı, C. elegans'ın çözünür bileşikler için popülasyona dayalı bir tahlil tercihini kaydetmek ve analiz etmektir. Bu amaca yönelik olarak, mevcut yöntem, daha önce tartışılan yöntemlerin her üçünün yönlerini de bütünleştirir ve geliştirir. Büyük solucan popülasyonlarının test edilmesini sağlar ve her deneyde sadece az miktarda deneysel çözelti kullanılmasını gerektirir. Buna ek olarak, analiz, kısa dalga boylu ışığın davranış üzerindeki etkilerini en aza indirgemek için kızılötesi LED arka aydınlatması ile birlikte özel olarak hazırlanmış kapalı bir davranış odasında yürütülür. Her hazne aynı zamanda, tezgah alanından ödün vermeden deneysel verimi artıran çoklu mikroskop kameralarıyla donatılabilir. Son olarak, video analiz yazılımı, zamanla popülasyon davranış dinamikleri görselleştirmek için her video için tercih endeksi değerinin yanı sıra eşlik eden bir solucan doluluk arsa çıktısını verir. Oda konfigürasyonu ve birSsay protokolü, odorantların veya sıcaklığın kemosensör davranışlara etkisi gibi multimodal davranış tepkilerinin incelenmesi için daha da modifiye edilebilir.

Bu makale, davranış odasının yapısını ve tahlil protokolünü anlatmaktadır. Aynı zamanda, bilinen suda çözülebilir itici yabani tip solucanlar ve kimyasal duyu kusurlu mutantlar, bakır iyonları ⁴ tepkisinin değerlendirilmesinden bu yöntemin kullanımını göstermektedir. Son olarak, verilen yazılımı kullanarak video analiz süreci detaylandırılmıştır.

1. Davranış Odası Meclisi

NOT: Davranış odası, ekstrüzyonla işlenmiş alüminyum çubuklardan yapılmış, opak kumaş kapaklarla kaplı, şeffaf bir akrilik taban ve kamera destekleri bulunan yaklaşık küp şeklindeki bir çerçeveden oluşur. Davranış haznesini oluşturan ekstrüzyonla işlenmiş alüminyum çubuklar arasındaki bağlantılar, hepsi dikeydir ve bir köşe dirsek bacağını vidalarla ve sürgülü olarak her bir çubuğa sabitleyen "L" şeklinde köşe dirsekleri (1 inç genişliğinde 1 inç genişlikli köşe parantezleri) kullanılarak sabitlenmiştir T-somun. Her ek, aşağıda açıklandığı gibi bir veya iki köşe dirseği ile sabitlenir. Odanın üstündeki kumaş örtüleri, aluminyum çerçeve çubuklarına, aynı vidalarla ve sürgülü somunlarla fakat kumaşın köşelerindeki gırnaklarla tutturulmaktadır. Vidalar, çıkıntılı dudak ile yan tarafta değil, gömülü T-somunlarının gömme kenarı tarafına düzgün şekilde yerleştirilir. Bir alüminyum çubuğa bir vida / T-somun tutturma düzeneği takarken, T-somunu kanalın içine kaydırınVidanın kafası yuvadan çıkıp çubuğun uygun yüzüne yerleştirin.

1. Kumaş kapakları hazırlayın.
   1. Odanın üst ve dört yanını örterek opak polyester kumaşın beş parçasını kesmek için makas kullanın.
      1. Haznenin üstü için bir kare 14 x 14 inç ² kumaş tabakasını kesin. Bölmenin kenarları için dört dikdörtgen 11 x 14 inç ² kumaş tabakasını kesin.
   2. Kumaş tabakalarının köşelerine gırnaklar yerleştirin.
      1. Beş kurşun kalem ve düzle kullanarak beş polyester kumaş sayfasının her kenarından bir referans çizgisini 0.5 inç işaretleyin.
      2. Dört dikdörtgen sac için, kurşun kalem çizgilerinin her köşede kesiştiği yerde (diğer bir deyişle yaprak başına 4 gromet) merkezlenmiş yuvarlak çubuklu kerpeten kullanın.
      3. Kare levha için, her bir kenar boyunca iki parmağınızı takın ve her parmaklık kalem çizgisinin üzerinde ortalanır ve her birinin ucundan 1.5 inçDört kalem çizgisi (toplam 8 grommet, her köşenin yanında iki).
   3. Her grommet deliğine bir vidayı takın ve her birine bir T-somunu gevşekçe takın.
2. Kamera montaj çubuklarını hazırlayın.
   1. Her kamera için bir adet 2 inç uzunluğunda bir alüminyum ekstrüzyon çubuğunu kesmek için bir bant testeresi veya eşdeğeri kullanın, daha sonra montajı kolaylaştırmak için çubuğun kesim ucunun çubuk uzunluğuna dik olduğundan emin olun.
   2. Her bir kamera montaj çubuğunun merkez ağları boyunca delik açmak için bir ucundan 0,75 inç, delik üst ve alt yüzeylere dik olacak ve çubuğun merkez çizgisinden geçecek şekilde bir delik açmak için 0,25 inç çapında bir matkap ucu bulunan bir matkap kullanın. . İsteğe bağlı olarak, 0.25 inç matkap ucuyla elle kullanılan bir elektrikli matkapla deliği delin, ancak deliğin çubuğun üst ve alt yüzeylerine dik olduğundan emin olun.
3. Tüm köşe parantezlerini hazırlayın.
   1. Içindeki delikten bir vidayı takın.Her bir köşe dirsek bacağını, vidayı iç açılı taraftan sokun. Her vidaya bir T-somunu gevşekçe geçirin.
4. Kamera montaj düzeneğini hazırlayın ( Şekil 1B , kat 2).
   NOT: Fotoğraf makinesi montaj düzeneği, üç kamera kılıfını destekleyen "H"-şeklinde bir yapıdır.
   1. Kamera montaj çubuklarını kamera montaj aksamının orta çubuğuna takın.
      1. Adım 1.2'de üretilen üç kamera montaj çubuğunu dikey olarak yönlendirilmiş deliklerle yerleştirin. Delikli deliğin en uzak ucundaki her montaj çubuğunun iki köşe dirseğini kaydırın.
      2. Kelepçelerin bacakları çubuğun ucuyla aynı hizada olacak şekilde köşe parantezlerini yerleştirin ve yerine sabitlemek için vidaları sıkın. Bu, "T" nin altındaki matkap deliği ile "T" şekli oluşturur.
      3. Çalışma yüzeyinde 1 ayak alüminyum ekstrüzyon yerleştirin. Bir kamera montaj çubuğunun asma kilidini asse kaydırınMbly (önceki adımdan) 1 fitlik çubuğun bir tarafına yerleştirin. Montaj çubuğunu 1 ayak çubuğunun uzunluğunun ortasına ortalayın ve yerine sabitlemek için vidaları sıkın. Diğer iki montaj çubuğunu 1 ayak çubuğunun zıt tarafına kaydırın.
      4. İki çubuğu, iç ayak parantezleri yaklaşık 2,5 inç aralıklarla, 1 fitlik çubuğun ortasından eşit mesafede konumlandırın. Çubuğun her iki ucunda köşe parantezini 1 fitlik çubuğun kenarlarına kaydırın. Kelepçelerin bacakları çubuğun uçları ile aynı hizada olacak şekilde köşe parantezlerini yerleştirin ve yerine sabitlemek için vidaları sıkın.
   2. Uç çubuklarını orta çubuğa takın.
      1. İki basamaklı alüminyum ekstrüzyonu, önceki adımdan bir "H" şekli oluşturan montajın her iki ucundaki T somunlarına kaydırın. Orta çubuktaki her uç çubuğunu ortalayın ve dört vidayı sıkarak sabitleyin.
      2. Dört köşe parantezini bir önceki adımda eklenen iki uç çubuğunun üstüne, her iki ucundan birer birer kaydırınHer barın. Kelepçelerin bacakları çubukların uçlarıyla aynı hizada olacak şekilde köşe parantezlerini yerleştirin ve yerine sabitlemek için vidaları sıkın.
   3. Kamera askılıklarını ve kamış tutucularını kamera montaj askısına takın.
      1. Üç mikroskobik fotoğraf makinesi standının her biri için, parmak izi vidasını gevşeterek ve ayak çubuğunu kaydırarak fotoğraf makinesi kılıfını çıkarın.
      2. Her kamera montaj çubuğu için (şimdi "H" nin merkez çubuğuna sabitlenmiştir) bir yuvarlak kafalı vidayın üzerine yerleştirin, vidayı kamera montaj çubuğundaki delikli delikten geçirin ve vidanın üzerine başka bir pul koyun . Kamera çubuğunun vurma deliğini vidaya vidalayın, kamera montaj çubuğuna sıkıca sıkıştırın.
      3. Diğer iki kamera montaj çubuğu için adım 14.3.2'yi tekrarlayın.
      4. Bir fotoğraf makinesi kılıfını her kamera çubuğu üzerine kaydırın, daha geniş olan açıklık kamera montaj çubuğuna ve vidaya doğru yönlendirilir. Kılıfı kamera standına geçici olarak sabitleyinKılıfın parmak vidası ile.
         NOT: Nihai çalışma konumu Bölüm 2'de ayarlanacaktır.
5. Davranış odası çerçevesini monte edin ( Şekil 1A ).
   NOT: Yapının kolay olması için çerçeveyi, çalışma yüzeyindeki haznenin çerçevesinin üst kısmından başlayarak ( Şekil 1B , tabaka 1) başlayıp çerçevenin "ayaklarına" doğru yukarı doğru hareket ettirerek yerleştirin ( Şekil 1B , tabaka 3).
   1. Davranış odasının üst katmanını birleştirmek için, dörtlü 1 fitli ekstrüzyon yapılmış alüminyum çubukları kare polyester tabakasına ( Şekil 1B , tabaka 1) takın.
      1. Çubuğu, kumaş genişliğinin ortasında ortalayarak, kumaş tabakasının her iki kenarı boyunca iki T-somuna üzerine bir çubuk kaydırın. Kumaş tablasını her bir çubuğa sabitlemek için bağlantı elemanlarını sıkın.
      2. Kare polyester levhayı çalışma yüzeyinin üzerine yayın.Üstteki dört adet takılı alüminyum çubuk. Sekiz köşe dirseklerini dört çubuğun üst yüzeylerine, birer birer her çubuğun ucuna kaydırın. Parantezlerin dikey ayakları çubukların uçlarıyla aynı hizada olacak şekilde köşe parantezlerini çubukların üzerine yerleştirin. Vidaları T somunlarına sıkıştırarak sabitleyin.
   2. Her köşede sırt üstü ilave 1 ayak alüminyum ekstrüzyon dikin ve ekstrüzyonu iki köşe dirsek bacasındaki T somunlarının üzerinden kaydırın.
   3. Bağlantı çubuklarını sıkıştırarak dikey çubuğu yatay çubuklara sabitleyin, böylece iki bitişik yatay çubuğu birleştirin.
      NOT: Tamamlandığında, sekiz ekstrüzyon (dört yatay ve dört dikey), dört direk yukarı doğru yapıştığında masada bir kare halka oluşturacaktır ( Şekil 1B , tabaka 1).
   4. "H" şeklindeki fotoğraf makinesi montaj düzeneğinin gevşek somunlarını 1.4. Bölümden bir önceki adımdaki çerçevenin dikeylerine kaydırın. Bırakın "H & #34; Çerçevenin her köşesindeki köşe parantezlerinin üzerine oturmak için tamamen aşağı kaydırın. Dört köşeli braket vidasını sıkarak kamera montajı düzeneğini yerine sabitleyin.
   5. Son dört 1 ayak ekstrüzyon alüminyum çubuk ( Şekil 1B , tabaka 3) kullanarak odanın alt katını birleştirin.
      1. Her bir 1 fitlik çubuğun her iki ucuna bir köşe dirsekleri kaydırın, köşebent dirseklerini çubukların uçları ile birlikte parantezin bacaklarıyla aynı hizaya getirin ve yerine sabitlemek için vidaları sıkın.
      2. Çubuk dikmeleri arasında dikey kanalların gevşek T-somunları ile çubukları aşağı doğru kaydırın. Çubukları köşe parantezlerinin üst kenarları dikey açıklıkların 1 inç altına olacak şekilde yerleştirin ve köşe braketi vidalarını sıkarak yerlerine sabitleyin.
6. Dört dikdörtgen poliester tabakasının T-somunlarını, şablonun kenarlarını örtmek için dikey ekstrüzyon çubuklarındaki kanallara kaydırınR ve yerine sabitlemek için bağlantı elemanlarını sıkıştırın.
7. Odanın içine erişmek için bir kapı olarak bir taraf seçin ve odanın alt katındaki iki vidayı ve T somunu çıkarın.
   NOT: Çerçeve dik dururken, bu kapağın alt kısmı alt kısımda gevşek olacak ve bölmenin iç kısmına erişmek için kaldırılabilir.
8. Tamamlanan çerçeve için ayak olarak işlev görmek üzere her köşe elemanının üst ucuna plastik bir başlık koyun. Çerçeveyi sağa-yukarı bakacak şekilde çevirin. Çerçevenin taban katmanının her bir yanına iki panel tutacağı yerleştirin ve yerine sabitlemek için bükün ( Şekil 1B , kat 3). Tahlil plakaları ( Şekil 1B , tabaka 3) için bir sahne sağlamak için panel tutucuların üzerine 12 x 12 inç ² parça net akrilik yerleştirin.

2. Kamera ve Sahne Şablonu Konumlandırma

1. Mikroskop kamerası video edinme yazılımını bilgisayara indirin ve yükleyinÜreticinin web sitesinden.
2. Kamera optiklerini akrilik sahne ve arka ışığa doğru soktuğunuzda, bir mikroskop kamerayı üç kamera kılıfının her birine kaydırın. Kameraları bilgisayarın USB bağlantı noktalarına bağlayın. Kızılötesi LED arka aydınlatma panelini çerçevenin altına, sahnenin altında ortalayın. Açmak için arka aydınlatma panelini takın.
3. Sağlanan çözüm yerleşimi ve plaka hizalama şablonlarını asetat yapraklarına yazdırın (bkz. Ek Dosya ).
   NOT: Çözelti yerleştirme şablonu üzerinde, plaka çevresinin çemberi 3.8 cm çapındadır ve ilgili iç bölge çapı 0.9 cm'dir.
4. Dairesel şablonları çevreleyen dikdörtgen şeffaflık parçaları elde etmek için kılavuz çizgileri boyunca kesin.
5. Video edinme yazılımını başlatın ve kameraların beslemelerini görüntülemek için pencerenin üst kısmındaki numaralı küçük resimlere tıklayın.
6. Mikroskop kamera hizalamasını ve büyütülmesini ayarlayın.
   1. Bir plaka hizalama şablonunu mikroskop kamera lensinin altına yerleştirin ( Şekil 2B ).
   2. Kamera kılıfını kamera çubuk çubuğu boyunca dikey olarak kaydırarak çalışma mesafesini değiştirin ve kameranın büyütme kadranı, şablonun sayı işaretleri kamera görüş alanının kenarlarında net bir şekilde görünene kadar döndürerek kameranın büyütmesini ayarlayın.
   3. Plaka hizalama şablonunu akrilik katına bantlayın.
   4. Mikroskop kameranın altındaki plakalı hizalama şablonuna bir solucan örneği yerleştirin ve görüş alanındaki sayı işaretlerini korumaya devam ederken solucanların keskin bir görüntü elde edilinceye kadar büyütme ve çalışma mesafesini daha da rafine edin.
   5. Diğer iki mikroskop kamerası için 2.6.1-2.6.4 adımlarını tekrarlayın.

3. Nematod Büyüme ve Senkronizasyon

1. Deneylerden dört gün önce, yirmi dört adet 60 mmNematod Büyütme Ortamı (NGM), Luria-Bertani (LB) suyunda 50 μL OP50 Escherichia coli ile agar plakaları (tarifi için bölüm 5'e bakınız).
   NOT: Her 60 mm'lik tabaka, bir tahlil plakası için yeterli solucan sağlayacaktır. Tedavi veya genotip başına altı kopya edinilmesi önerilir.
2. Tohum tabakalarını oda sıcaklığında gece boyunca kapaklarla dik duracak şekilde bırakın.
3. Ertesi gün, on beş beslenmiş gravid hermafroditi her bir tohumlanmış plakaya aktarın ve solucanlara altı saat yumurta bırakmalarına izin verin. Bu plaka başına> 360 yumurta verecektir.
4. 6 saat sonra solucanları tohumlanmış plakalardan çıkarın ve soyların 20 ° C'de yetişkinlere üç gün boyunca büyümesine izin verin.

4. Kemoterapi Tercihi Testi

1. Deneyden bir önceki gün 35 mm'lik NGM agar assay plate'lerini hazırlayın.
   1. 250 mL NGM agar hazırlayın (tarifi için bölüm 5'e bakın).
   2. Yirmi sekiz boş 35 mm plakaları düz suda beş veya daha az desta yerleştirinrface. Her tahlil plakasını 5 mL NGM agar ile doldurun. Deney plakalarını, oda sıcaklığında gece boyunca kapaklarla dik duracak şekilde bırakın.
      NOT: Başlıca kural olarak, ihtimal dahilinde tahlil edilecek her bir tedavi veya genotipe ayrı bir tahlil plakası hazırlayın.
2. Deney günü, arka ışığı açın, bilgisayarı önyükleyin ve mikroskop kamera video yakalama yazılımı başlatın.
3. Bilgisayara bir mikroskop kamera bağlayın ve video kayıt ayarlarını yapın.
   1. Fotoğraf makinesinin canlı yayınını görüntülemek için yazılım penceresinin üst kısmındaki numaralı kamera küçük resmini tıklayın.
   2. Kamera beslemesinin sol üst köşesindeki 'Video Format' menüsünü aşağı çekin ve 'MJPG 1280 x 1024' seçeneğini seçin. 'Video Format' menüsünün yanındaki 'Klasör' menüsünü aşağı çekin ve video dosyalarının hangi klasöre kaydedileceğini seçin.
   3. 'Nın sağ üst köşesindeki' Otomatik Pozlama 'simgesini tıklayın.Kamera beslenir ve otomatik pozlamayı kapatır. Dahili mikroskop kamera LED'lerini kapatmak için 'Otomatik Pozlama' simgesinin hemen sağındaki 'LED' simgesini tıklayın. Bitişik 'Ayarlar' simgesini tıklayın: Solucanlar arka plandan farklı görünene kadar 'Tek Renkli'yi seçin,' Kontrastı en yüksek düzeye getirin 've' Parlaklık 'ayarını yapın.
4. Kalibrasyon videolarını edinin.
   1. Bir aşama plakası hizalama şablonunun üzerine bir çözüm-yerleştirme şablonu hizalayın ( Şekil 2A ). Kamera beslemesinin sol tarafındaki 'Zaman Aşımına Uğramış Video' kayıt simgesini tıklayın ve süresi için 5'i ve 1 çerçeve / s'de 5 saniyelik bir videoyu kaydetmek için '1' değerini girin. Video kaydına başlamak için 'Başlat' düğmesine tıklayın.
5. Diğer iki mikroskop kamerası için 4.3 ve 4.4 adımlarını tekrarlayın.
6. Çözelti yerleştirme şablonunu bölmeden çıkarın.
7. Yiyecekleri çıkarmak için solucanları yıkama tamponuyla üç kez yıkayın.
   1. Senkronize edilmiş solucanlardan oluşan bir tabakaya 1.2 mL NGM tamponu eklemek için 5 mL'lik bir cam pipet kullanın ve solucanları tampona yerleştirmek için yavaşça plakayı çalkalayın. Tamponu plakadan pipetleyin ve solucanları tamponda temiz bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın.
      NOT: Solucanlar kültür agar tuz konsantrasyonundan sapmalara duyarlı ¹⁴ . Solucan yerleştirildikten sonra agar tuz konsantrasyonundaki değişiklikleri en aza indirgemek için, yıkama işlemi için NGM tamponu kullanılması önerilir (tarifi için bölüm 5'e bakınız). Solucanlar taraflara yapışacak şekilde plakalardan solucanları çıkarmak için plastik pipet kullanmayın. Eşzamanlı olarak çalıştırılacak tahlil plakaları sayısı kadar tüp hazırlayın.
   2. Solucanlar altına oturmasına izin vermek için üç tüpe 1-2 dakika bekletin. Agrega peletini rahatsız etmeden mümkün olduğunca tüplerden bir miktar yıkama tamponu çıkarmak için bir plastik pipet kullanınTüplerin altındaki solucanlar. Tüpleri her biri 1 mL'lik temiz NGM tamponu ile doldurun.
   3. Adım 4.7.2'yi bir kez tekrarlayın.
8. Plakaları (tarifler için bölüm 5) tayin etmek için, 10 mM _CuCl2 ve M13 tampon çözeltileri ekleyin.
   1. Dekontan mikroskop sahnesinin tepesine bir çözüm yerleştirme şablonu sarın.
   2. Bir plaka hizalama şablonunun her iki tarafına bir çift taraflı bant şeridi yerleştirin. Bantın plaka çevre çemberiyle çakıştığından emin olun, ancak şablonun merkezinde ilgi çeken kayıt bölgesini tıkamaz.
   3. Tahlil plakasının çevresini plaka hizalama şablonu üzerindeki daire ile hizalayın ve şablon plakanın tabanına yapışana kadar bastırın. Analiz plakası şablon sayı işaretlerini, ayırıcı mikroskopta bulunan çözelti yerleştirme şablon işaretleyicileri ile hizalayın.
   4. Her biri 1. ve 4. kadranda M13 tamponunun 1 μL'sini yerleştirmek için P2 pipet ve plastik ucu kullanın ( Şekil 2A). Kadranın 2 ve 3 (Şekil 2A) içinde 10 mM _CuCl2 çözeltisi her birinden 1 uL yerleştirmek için yeni bir uç kullanın.
   5. Diğer iki tahlil plakası için 4.8.2-4.8.4 adımlarını tekrarlayın.
9. Çözelti damlaları agarda tamamen emildikten sonra, yıkanmış solucanları her bir mikrosantrifüj tüpünden ilgili tahlil plakasına aktarmak için bir cam Pasteur pipeti kullanın.
10. Dairesel olarak işlenmiş bölgenin üstündeki ve altındaki alana birer solucan yerleştirin. Doku dört kez katlayın ve tüm tahlil plakalarında aşırı yıkama tamponunu absorbe etmek için künt kenarı kullanın.
11. Şablon köşelerinde sayıları hizalayarak, davranış hücresindeki mikroskop kameraları altında üç tahlil plakasını derhal ayarlayın. Solucanlar tahlil plakalarına alışmak için 2-3 dakika bekleyin.
    NOT: Bir sonraki adımda video kaydı başlatmadan önce, davlumbaz kapı kanadının kapalı olduğundan emin olun.
12. Fotoğraf makinesinin sol tarafındaki 'Zaman Aşımına Uğramış Video' kayıt simgesini tıklayın ve saniyede 1 karede 10 dakikalık bir video kaydı yapmak için süre için '10' dak ve '1' aralığını girin. Video kaydını başlatmak için 'Başlat' düğmesine tıklayın. Videolar kaydedildikten ve kaydedildikten sonra bölmeden tahlil plakalarını çıkartın.
13. Bir sonraki test tabakları için 4.7-4.12 adımlarını tekrarlayın. Her tedavi veya genotip için en az altı kopya veya iki kayıt turu edinin.

5. Reaktif Hazırlama

1. NGM agar ve tampon hazırlayın.
   1. 1 L'lik bir cam şişede, 1.5 g sodyum klorür, 8.5 g agar ve 1.25 g pepton ilave edin. 500 mL damıtılmış su ve şişeye bir karıştırma çubuğu ekleyin. İçerikli otoklav şişesi.
   2. Şişeyi bir karıştırma plakasına yerleştirin ve karıştırma işlevini açın.
   3. Steril teknik kullanılarak sırayla ekleyin: 0.5 mL 5 mg / mL kolesterol, 0.5 mL 1 M kalsiyumKlorür, 0.5 mL 1 M magnezyum sülfat ve 12.5 mL İM potasyum fosfat ihtiva eder.
   4. NGM tampon yapmak için adım 5.1.1 ila 5.1.2'yi tekrarlayın, ancak adım 5.1.1'de agar ve pepton bırakın.
2. LB suyu hazırlayın.
   1. 1 L'lik bir cam şişede, 5 gr tripton, 2.5 gr maya ekstraktı, 2.5 gr sodyum klorür, 500 mL damıtılmış su ve 0.5 mL İN sodyum hidroksit ilave edin. İçerikli otoklav şişesi.
3. M13 tamponunu hazırlayın.
   1. 1 L'lik bir cam şişeye, 1.817 g Tris, 2.922 g sodyum klorür, 0.373 g potasyum klorür ve 500 mL damıtılmış su ilave edin. Şişeyi içeriği ile otoklavlayın.
4. Bakır klorür _(CuCl2) çözeltisi hazırlayın.
   1. _CuCl2 0.134 g tartılır. 100 mL CuCl ₂ stok solüsyonu yapmak için 15 mL'lik bir plastik tüpteki 10 mL M13 tampon çözeltisi ekleyin. Plastik boruyu, tüm çözünen madde parçalanana kadar ters çevirinlved.
   2. Temiz bir 15 mL plastik tüp içine 100 mM CuCl ₂ solüsyonunu filtrelemek için bir şırınga ve 0.2 um membran filtresi kullanın.
   3. , 10 mM _CuCl2 solüsyon yapmak M13 900 uL tampon eklemek ve bir mikro santrifüj tüpüne, 100 mM _CuCl2, stok çözeltisi 100 uL için. Mikro santrifüj tüpünü iyice karıştırmaya çevirin.

6. Video Analizi

1. Python 3'ü (https://www.python.org/downloads/) ve OpenCV yazılım kitaplığını (http://opencv.org/downloads.html) indirin.
2. Analiz için üç Python komut dosyasını indirin (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   NOT: Devam etmeden önce kullanılacak tüm video dosyalarının mp4 formatında olduğundan emin olun.
3. İşlev ve parametre açıklamalarını görüntülemek için, konsola 'help (işlevi adı girin)' yazın ve enter tuşuna basın. Örneğin, 'yardım (kalibrasyon)' yazın ve enter tuşuna basın.
4. Kalibrasyon işlevini yürütün(ROI) tanımlamak için giriş parametreleri ile birlikte.
   1. 'Mp4filename' değişkeni için bölüm 4'te çekilen kalibrasyon videosunun dosya adını girin. Dosya adını girerken tırnak işaretleri ekleyin.
   2. 'Q * x' ve 'Q * y' değişkenleri için 600 ve 360 ​​değerleri ile başlayın. * Çeyrek sayıları 1 ila 4 girin. 'Rad' değişkeni için 310 değeri ile başlayın. ROI maskeleri şablonun çeyrek ana hatlarına hizalanana kadar değişken değerlerini ayarlayın.
   3. Bu işlevi uyguladıktan sonra konsoldan yazdırılacak her ROI'ye toplam piksel sayısını kaydedin. Preference_index işlevinde 'ROI_size' parametresi için bu değeri girin.
5. Uygun eşik sabitini belirlemek için threshold_constant işlevini yürütün. Solucanlar (beyaz) net bir şekilde görülebilecek ve arka planda en az tuz-biber gürültüsü oluşana kadar 'sabit' değerini ayarlayın (siyah).
6. Bir csv veri sayfası, video tercih endeksi ve eşlik eden solucan doluluk arsa oluşturmak için preference_index işlevini yürütün.
   1. 6.4 ve 6.6 adımlarından belirlenen 'Q * x', 'Q * y', 'rad', 'ROI_size' ve 'sabit' değerlerini preference_index işlevi için giriş parametreleri olarak kullanın.
      NOT: Her video karesi için, preference_index işlevi, her ROI'deki solucan piksel sayısını sayar ve toplam piksel ROI sayısından solucan piksellerinin yüzdesini hesaplar. Fonksiyon, daha sonra, aşağıdaki ifadeyi kullanarak her video çerçevesi için bir tercih endeksi değeri üretir:
      
      NOT: Program videodaki tüm kareleri analiz ettikten sonra, video için ortalama tercih endeksi değeri oluşturulur. Videonun tercih indeksinin en üstte basıldığı bir solucan doluluk tablosu yanı sıra bir CSV veri sayfasıSolucan pikseli, yüzde solucan doluluk değerleri ve her video çerçevesi için tercih endeksi, program çalışmaya başladıktan sonra belirlenen klasöre kaydedilir.

Şekil 3A , farklı genotip ve tedavi çiftleri için elde edilen tercih indeksi değerlerini göstermektedir. Bir tercih endeksi değeri 1, deneysel ROI'ye yerleştirilen çözüme güçlü bir cazibe gösterdiğini gösterirken -1 tercih endeksi değeri, güçlü itme gösterir. M13 tampon solüsyonu hem kontrol hem de deneysel ROI'lara yerleştirildiğinde, ROI'ye yönelik herhangi bir mekansal önyargı olmadığını gösteren 0.02 bir tercih indeksi elde edildi. N2 solucanlan güçlü bakır iyonları güçlü itici (Ek Film 1) ⁴ olduğu, önceki bulguları doğrulamaktadır -0.67 bir tercih endeksi elde bakır iyonu kaçınılmalıdır. Osm-3 mutantları, duyu kılıcının distal bölümlerinin düzgün oluşumundan yoksundur, bakır iyonlarının kaçınılması önemli ölçüde azalmıştır (PI = -0.19) ¹⁵ . Ocr-2 mutantları, bunlar Ayrıca önemli ölçüde kaçınma azalma sergileyen ve bakır iyonları (PI = 0.19), hatta bazı hafif gözde (Ek Film 2) ^16, bakır önlenmesi dahil birçok ASH aracılı nosiseptif yanıtlarda Güneylilerin.

Şekil 3B , her videodaki deneysel ROI'lere kıyasla kontrollerde solucan yoğunluğunu gösteren, solucan doluluk alanlarını temsil eden örnekleri göstermektedir. Çizim alanının rengi ne kadar koyu renkte olursa, ROI'daki solucan piksel sayısı o kadar yüksek olur. M13 tampon kontrolü ile tedavi edilen N2 solucanları için doluluk arsası, her iki ROI'deki solucan sayısının test boyunca benzer kaldığını göstermektedir. Bununla birlikte, bakır iyonlarıyla muamele edilen N2 solucanları için doluluk alanı, solucanlar tahlil boyunca deneysel ROI'yı kuvvetli ve sürekli olarak önlediğini göstermektedir.

Gimg "src =" / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg "/>
Şekil 1: Davranış Odası Tasarımının Fotoğraf ve Şematik Temsilciliği. ( A ) Davranış odası tertibatının ön görünümü (sol) ve hazne çerçevesinin ilgili şematik gösterimi (sağ). Opak olmayan polyester plakalar alt yüzü dışındaki tüm yüzleri kapsar ve kızılötesi arka aydınlatma panelinden ışık akışı sağlar. Rakamlar 1, 2 ve 3, (B) 'de ekstrüzyon katmanlarına karşılık gelir. ( B ) Davranış odası çerçevesi içeren ekstrüzyon katmanlarının üstten görünüş şeması. Buna, üst katman (1), orta kamera montaj montaj katmanı (2) ve alt katman katmanı (3) dahildir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Çözüm Yerleştirme ve Plaka Hizalama Şablonları. ( A ) Çözüm yerleştirme şablonunun dört kadran ve sayı hizalama işaretleri vardır. Deney çözümü sağ üst ve alt sol kadranlara yerleştirilirken kontrol solüsyonu sol üst ve sağ alt kadranlara yerleştirilir. ( B ) Levha hizalama şablonu, video kaydı ve analizi sırasında solucanların görüş alanındaki oklüzyonunu en aza indirgemek için yalnızca sayı hizalama işaretlerine sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Bu Testi Kullanarak Toplanan Verilerin Örnekleri. ( A ) Vahşi tip N2 ve mutant C. elegans için Tercih İndeksi (PI) değerleri M13 tamponu ve 10 mM _CuCl2 yanıt olarak, m>. N2 solucanlar, M13 kontrol solüsyonu her iki ROI'ye yerleştirildiğinde kontrol ve deneysel ROI'ler arasında hiçbir tercih göstermedi; ancak bakır iyonları yerleştirildiğinde deneysel ROI'dan şiddetle kaçınıldı (sırasıyla PI = 0.02 ve -0.67). Osm-3 (p802) mutantları ve ocr-2 (ak47) mutantları, N2'ye kıyasla bakır iyonlarından kaçınılması önemli ölçüde azalmıştır (sırasıyla PI = -0.1 ve 0.2). Her bir genotip-muamele eşleşmesi için N = 6 tahlil, tahlf başına 360 kurt solüsyon, hata çubukları ± 1 SEM, *** p <0.001, tek yönlü ANOVA, ardından post-hoc Tukey Dürüstçe Anlamlı Fark (HSD) testi. ( B ) ROI'lerde (üstte) M13 tamponu ve kontrol ROI'de M13 tamponu ve deneysel ROI'da (alttaki) bakır iyonları ile N2 solucanları bulunan N2 solucanları için temsilci solucan doluluk arsaları. Her doluluk arsındaki renk ölçeği solucan piksel sayısını temsil eder.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürden daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Film 1: N2 solucanlarının 10 mM Bakır Klorid'e Davranışsal Yanıtları. Solucanlar M13 tamponu (üst sol ve sağ alt) ile kontrol kadranlara çekilir ancak M13 tamponunda çözünmüş bakır iyonlarını (sağ üst ve alt sol) güçlü bir şekilde önlerler. Video saniyede 1 kare kaydedildi ve 15 kat arttı. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Film 2: ocr-2 (ak47) Solucanlarının 10 mM Bakır Klorid'e Davranışsal Davranışı . Solucanlar, hem M13 tamponlu (üst sol ve sağ alt) kontrol kadranı hem de çeyrekte kabaca eşit derecede dolaşıyorlar(Sağ üst ve alt solda) çözünmüş bakır iyonlarını içeren bir sodyum klorid çözeltisi. Mutantlar, kayıt başlangıcında bakır iyonları içeren kadranlar için hafif bir tercih sergilemektedir. Video saniyede 1 kare kaydedildi ve 15 kat arttı. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya: Çözüm Yerleştirme ve Plaka Hizalama Şablonları. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Protokolde kritik bir adım, tahlil plakalarının farklı deneysel günler boyunca tutarlı bir kuruma seviyesine sahip olmasını sağlamaktır. Farklı kuruluk seviyeleri, çözeltinin agara farklı difüzyon hızlarına ve dolayısıyla davranışsal sonuçlarda değişikliğe neden olacaktır. Böylece, deney plakaları daima deneyler öncesinde öğleden sonra taze yapılmalıdır. Her tahlil için test edilen solucanlar sayısı, tedaviler arasında karşılaştırma kolaylığı için düzenlenmelidir. Referans olarak, bir vahşi tipi sonsuz 4-10 yumurta / gr ortalama h> deney başına 360 solucanlar üzerinde sonsuz senkronizasyon protokol ¹⁷ takip olup olmadığını belirlemektedir. Bazı mutant suşlar yumurta atma yeteneğine sahipse, hedef yavru sayısına ulaşmak için daha yumuşak tavuk yumurtacı solucanları seçin. Protokolün bir diğer önemli adımı, yıkama işlemi ve solucan yerleşimi sırasında solucanları hafifçe tutmaktır. Solucanlar mekanik uyaranlara duyarlıdır ve bu tür stres tepkileri ortaya çıkar S tersinme ve yumurta bırakma inhibisyonu ¹⁸ . Ayrıca, video analizine başlamadan önce ROI'yi doğru bir şekilde tanımlamak ve belirli aydınlatma koşulları için optimum eşik sabitini belirlemek için özen gösterilmelidir. Ayrıca, son denemenin çalıştırılmasından bu yana geçen uzun bir süre geçtikten sonra kalibrasyon ve eşik değerleme işlemlerinin tekrarlanması önerilir.

Bu yöntemin bir kısıtlaması, küçük solucan popülasyonlarını denemek için uygun değildir. Bununla birlikte, gıda varlığının duyusal davranış üzerindeki etkisini belirlemek için uygun kontroller yapılırsa, solucanların uzaysal keşif yerlerini kısıtlamak için, tutma tahlilinde olduğu gibi gıda kullanımı da mümkündür. Buna ek olarak, bu metot, kullanılan yakın kontrol ve deneysel solüsyon damlaları yakınlığı ve küçük miktarları nedeniyle uyaran gradyan navigasyonunu incelemek için tasarlanmamıştır.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bazı suşlar NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetics Centre (CGC) tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma, PWS'nin araştırmacı olduğu Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından desteklenmektedir.