線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

本発明者らは、集団ベースアッセイにおいて可溶性化合物に対するCaenorhabditis elegansの選好を自動的に分析することができる行動記録設定およびプロトコルを提示する。この記事では、ビヘイビアチェンバーの構築、ビヘイビアアッセイプロトコル、およびビデオ分析ソフトウェアの使用について説明します。

線虫であるCaenorhabditis elegansの唯一の302ニューロンのコンパクトな神経系は、様々な行動のレパートリーの基礎を成しています。これらの挙動の根底にある神経回路の解剖を容易にするために、頑強で再現性のある行動アッセイの開発が必要である。以前のC.エレガンスの行動研究では、可溶性化合物に対するC.エレガンスの応答を調べるために、「落下試験」、「走化性アッセイ」、および「保持アッセイ」のバリエーションを使用しています。この資料に記載されている方法は、前述の3つのアッセイの補完的な強みを組み合わせることを目指しています。簡潔には、各アッセイプレートの中央にある小さな円を、コントロールおよび実験溶液を交互に配置して4つの四分円に分割する。ワームを添加した後、アッセイプレートを行動チャンバに入れ、顕微鏡カメラがワームの遭遇を治療領域と記録する。次に、自動化されたビデオ分析が各ビデオの嗜好指数（PI）値が生成される。この方法のビデオ取得および自動解析機能は、実験者の関与および関連するエラーを最小限に抑える。さらに、アッセイごとに微量の実験化合物を使用し、行動チャンバのマルチカメラ設定は実験スループットを増加させる。この方法は、遺伝的突然変異体および新規化合物の行動スクリーンを実施するのに特に有用である。しかしながら、この方法は、対照および実験溶液領域が近接しているため、刺激勾配ナビゲーションの研究には適していない。また、少数のワームしか利用できない場合には使用しないでください。この方法は、現在の形態の可溶性化合物に対する応答のみをアッセイするのに適しているが、マルチモーダル感覚相互作用および光発生研究に適合するように容易に改変することができる。この方法は、他の線虫種の化学感覚応答をアッセイするためにも適用することができる。

飼育動物は、複数の感覚様式からのインプットを統合し、環境をうまく乗り越えるためには適切な行動戦略を選択する必要があります。外部の感覚入力がどのように受け入れられ、行動選択を導くために神経情報に変換されるのかを理解することは、神経生物学の分野における中心的な目標である。遺伝的に扱いやすい線虫C. elegansは、感覚生物学およびマルチモーダル統合の基礎となる神経メカニズムを研究する魅力的なモデル生物である。 C.エレガンスは、唯一302ニューロンを有しているが、これは検出および可溶性化合物、揮発性臭気物質、周囲温度^{1、2、3、4、5、6、7}を含む環境刺激の多種多様を区別することができます。ザ線虫C. elegansは、食物源を特定し、潜在的な脅威に気づくために、その化学感覚装置に大きく依存する。したがって、野生型および変異体C.エレガンスの化学刺激に対する応答をスクリーニングするように設計された行動アッセイは、 C.エレガンスの顕著な感覚能力の基礎となる遺伝的、細胞性および神経系の解剖において重要な役割を果たす。

可溶性化合物に対する応答をアッセイするために、液滴試験、走化性アッセイ、および保持アッセイの3つのタイプのアッセイが記載されている。落下試験では、化合物の小滴を動くワームの尾に置き、液体が前の知覚装置に到達したら前進または後退するというワームの決定が得られます⁴ 。落下試験はほとんど実験的な準備を必要とせず、レーザー作動ワームの場合のように、ワームのサンプルサイズが小さい場合に有用である。しかし、1つのワーム一度にアッセイすることができ、実験期間中、実験者が存在しなければならない場合、落下試験には時間がかかることがある。ドロップテストは、サンプル内の各ワーム間のドロップデリバリーの変動にも脆弱であり、これはアッセイの全体的な結果に影響する可能性があります。落下試験のもう一つの制限は、ワームの前方への移動からの魅力的または中立的な効果を区別することが不可能であるため、嫌悪化合物に対するワームの反応をアッセイするためにしか使用できないことである。

可溶性化合物のための走化性アッセイは、一般に、2つの対向する象限の寒天および他の2つの象限^8,9に混入対照溶液に混合実験溶液で、4つの象限に寒天プレートを分割することを含みます。アッセイの開始時に、ワームを含む緩衝液の一滴をプレートの中央に置き、ワームの数を各象限は、異なる時点で採点される。走化性アッセイは、各アッセイにおいて多数のワームが試験されるため、落下試験と比較してより大きな統計力を提供する。しかしながら、この方法の1つの限界は、走化性アッセイプレートの調製が大量の実験化合物を必要とすることである。これは、アスカロシドシグナル伝達分子^10の場合のように、興味のある化合物を得るために収率が限られた複雑な精製プロセスが必要な場合、大規模な挙動スクリーンを行うことを困難にする。さらに、アッセイ中のワームの手動カウントはエラーの影響を受けやすく、カウントプロセス中のプレートの摂動が結果に影響を与える可能性があります。

前述の2つの方法とは異なり、保持アッセイは、スコアリングプロセス中の誤差を最小にし、アッセイ中の実験者の干渉を減少させる機械視覚を利用する > 11。ワームの行動のビデオ記録のコンピュータ化された分析はまた、スコアリングがいくつかの離散的な時点でのみ行われるときに失われる微妙な行動の力学を潜在的に明らかにする可能性がある。保持アッセイでは、2つの溶液スポットが小さな円形の細菌性食品パッチの反対側に加えられ、続いて少数のワームが食品パッチの中央に配置される。次に、ワームの挙動が記録され、分析され、各解決領域内のワームピクセルの総数に基づいて嗜好指標値が計算される。魅力的な食品パッチが存在すると、各アッセイで使用されるワームの個体数がより少なくなる可能性がありますが、食べ物は以前は可溶性忌避剤¹²への回避行動を感作することが示されていました¹² 。さらに、ワームは、短波長の光に対して光敏感応答を示し、挙動記録設定において白色光を放射する顕微鏡光源の使用は、挙動に影響を及ぼす可能性があるs = "xref"> 13。

この記事で論じる方法の目的は、集団ベースのアッセイを用いた可溶性化合物のC.エレガンスの選好を記録および分析することである。このために、現在の方法は、前述の3つの方法すべてからの態様を統合し、改善する。これは、ワームの大集団を検査することを可能にし、各アッセイで使用される実験溶液の少量のみを必要とする。さらに、アッセイは赤外LEDバックライトを備えた特注の密閉型動作チャンバー内で行われ、短波長光の影響を最小限に抑えます。各チャンバには、複数の顕微鏡カメラを装備することもでき、ベンチスペースを損なうことなく実験のスループットを向上させます。最後に、ビデオ分析ソフトウェアは、各ビデオの嗜好指数値および付随するワーム占有率プロットを出力して、時間の経過とともに人口行動のダイナミクスを視覚化する。チャンバーのセットアップとassayプロトコルは、臭気物質または化学感覚挙動の温度の影響などの多峰性挙動応答を研究するためにさらに修飾することができる。

この記事では、行動チャンバの構築とアッセイプロトコルについて説明します。また、野生型ワームおよび化学感覚欠損突然変異体の既知の可溶性忌避物質銅イオンに対する反応をアッセイする際のこの方法の有用性も実証している⁴ 。最後に、提供されたソフトウェアを使用したビデオ解析プロセスについて詳しく説明します。

1.行動チャンバアセンブリ

注記：ビヘイビアチャンバーは、透明アクリル底面とカメラサポートを備えた、不透明なファブリックカバーで覆われた、押し出されたアルミニウムバーで作られたほぼキューブ形のフレームで構成されています。ビヘイビアチャンバを形成する押出されたアルミニウム棒の間のジョイントはすべて垂直であり、1つのコーナーブラケット脚部を各バーにネジ止めしてスライドインする「L」字型のコーナーブラケット（1インチ幅の脚部）を使用して固定されますTナット。各ジョイントは、後述するように1つまたは2つのコーナーブラケットで固定されています。チャンバー上の布カバーは、同じスクリューとスライドインのTナットで、フレームの角にあるグロメットを通し、アルミフレームバーに取り付けられています。ねじは、スライドインTナットの皿側に正しく挿入され、突出したリップがある側には挿入されません。ネジ/ Tナットファスナーアセンブリをアルミニウムバーに取り付けるときは、Tナットをチャネルに差し込みますネジの頭部がスロットからはみ出しているバーの適切な面に取り付けます。

1. 布カバーを準備する。
   1. はさみを使用して、不透明なポリエステル生地5枚を切断して、チャンバの上部と4つの側面をカバーします。
      1. チャンバーの上部に1平方メートルの14×14インチ²枚の布をカットします。チャンバーの側面のための4つの長方形の11 x 14インチ²枚の布をカットします。
   2. ファブリックシートのコーナーにグロメットを取り付けます。
      1. 鉛筆とまっすぐな部分を使用して、5つのポリエステル生地シートの各端から0.5インチの基準線をマークします。
      2. 4つの長方形のシートの場合は、グロメットのプライヤーを使用して、鉛筆の線が各コーナーで交差する中心にグロメットを挿入します（つまり、シートあたり4グロメット）。
      3. 正方形のシートの場合は、各辺に沿って2つのグロメットを挿入し、グロメットを鉛筆の線の中央に置き、それぞれの端から1.5インチ4本の鉛筆の線（合計8本のグロメット、各コーナーの近くに2本）。
   3. 各グロメットの穴にネジを差し込み、それぞれにTナットを緩く取り付けます。
2. カメラマウントバーを製作します。
   1. バンドソーまたは等価物を使用して、各カメラ用に2インチの長さのアルミニウム押出バーを1つ切り取り、バーの切断端がバーの長さに対して垂直になるようにして、後での組み立てを容易にします。
   2. 直径0.25インチのドリルビットを備えたドリルプレスを使用して、各カメラマウントバーの中央ウェブに穴を穿孔します。穴の一端から0.75インチは、穴が上下面に垂直で、バーの中心線を通ります。必要に応じて、0.25インチのドリルビット付きハンドヘルド電気ドリルを使用して穴をドリルしますが、穴がバーの上下面に垂直であることを確認してください。
3. すべてのコーナーブラケットを準備します。
   1. 穴にネジを差し込みます各コーナーブラケットの脚は、スクリューを内側の角度側から挿入します。各ネジにTナットをゆっくりとねじ込みます。
4. カメラマウントアセンブリを準備します（ 図1B 、レイヤー2）。
   注：カメラマウントアセンブリは、3つのカメラホルスタをサポートする「H」型アセンブリです。
   1. カメラマウントバーをカメラマウントアセンブリのセンターバーに取り付けます。
      1. 手順1.2で製作した3つのカメラマウントバーを、穴が垂直になるように配置します。ドリル穴から最も遠い端にある2つのコーナーブラケットを各マウントバーの側面に滑らせます。
      2. ブラケットの脚がバーの端と同じ高さになるようにコーナーブラケットを置き、ネジを締めて所定の位置に固定します。これは、「T」の底部に穿孔された「T」形状を形成する。
      3. 作業面に1フィートのアルミ押出材を置きます。 1つのカメラマウントバーのTナットを滑らせるmbly（前のステップから）を1フィートのバーの片側に移動します。 1フィートバーの長さに沿ってマウントバーをセンタリングし、ネジを締めて所定の位置に固定します。他の2つのマウントバーを1フィートバーの反対側に滑らせます。
      4. 2本のバーを1フィートのバーの中央から等距離に配置し、内側のコーナーブラケットを約2.5インチ離して配置します。 1フィートのバーの両側にコーナーブラケットを滑らせます。バーの両端に2個あります。ブラケットの脚をバーの端と同じ高さにしてコーナーブラケットを置き、ネジを締めて所定の位置に固定します。
   2. エンドバーをセンターバーに取り付けます。
      1. 前のステップからアセンブリの各端のTナットに2フィートの1フィートのアルミ押出材を「H」字形に滑らせます。センターバーの各エンドバーをセンタリングし、4本のネジを締めて固定します。
      2. 前のステップで追加された2つのエンドバーの上端に、4つのコーナーブラケットを両端に1つずつ挿入します各バーのブラケットの脚がバーの端と同じ高さになるようにコーナーブラケットを置き、ネジを締めて所定の位置に固定します。
   3. カメラスタンドとホルスターをカメラマウントアセンブリに取り付けます。
      1. 3つの顕微鏡カメラスタンドのそれぞれについて、つまみネジを緩めてスタンドロッドからスライドさせて、カメラホルスターを取り外します。
      2. 各カメラマウントバー（これは "H"のセンターバーに固定されています）のために、ワッシャを丸いネジの上に置き、ネジをカメラマウントバーのドリル穴に通し、別のワッシャをネジの上に置きます。カメラスタンドロッドのネジ穴をネジの上に通し、カメラマウントバーにしっかりと締め付けます。
      3. 他の2つのカメラマウントバーについても手順14.3.2を繰り返します。
      4. カメラホルダーを各カメラスタンドロッドにスライドさせ、より広い開口部をカメラマウントバーとネジの方向に向けます。ホルスターをカメラスタンドに一時的に固定するrホルスターのつまみネジで固定します。
         注記：最終動作位置はセクション2で設定します。
5. ビヘイビアチェンバーフレームを組み立てます （ 図1A ）。
   注：作業を簡単にするために、作業面（ 図1B 、レイヤー1）のチャンバーフレームの「上」からフレームを逆さまに組み立て、フレームの「足」に向かって上に向かって作業します （ 図1B 、レイヤー3）。
   1. ビヘイビアチェンバーの最上層を組み立てるには、四角形のポリエステルシート（ 図1B 、レイヤー1）に4本の1フィート押し出しアルミ棒を取り付けます。
      1. ファブリック幅に沿ってバーをセンタリングして、ファブリックシートの各端に沿って2つのTナットに1つのバーをスライドさせます。ファスナーを締めて、ファブリックシートを各バーに固定します。
      2. 正方形のポリエステルシートを作業面上に広げる上に4つの取り付けられたアルミニウム棒。 8本のコーナーブラケットを、各バーの両端に1本、4本のアルミバーの上面に滑らせます。ブラケットの垂直脚をバーの端と同一平面にして、コーナーブラケットをバーに置きます。ネジをTナットに締め付けて固定します。
   2. 各コーナーで、1フィートのアルミ押出材を垂直に立て、2つのコーナーブラケット脚のTナットに押し出します。
   3. ファスナを締めて水平バーに直立バーを固定し、隣接する2本の水平バーを結合します。
      注：完了すると、8つの押出形材（4つの水平および4つの垂直材）が、4つのポストが上に張り付いている（ 図1B 、層1）テーブルの四角いリングを形成します。
   4. 「H」形のカメラマウントアセンブリの緩いTナットをセクション1.4から前のステップのフレームの直立フレームに滑り込ませます。 "H＆＃34;フレームの各隅のコーナーブラケットの上に残ります。 4本のコーナーブラケットのネジを締めて、カメラマウントアセンブリを所定の位置に固定します。
   5. 最後の4つの1フィート押し出しアルミニウム棒（ 図1B 、層3）を使用して、チャンバーの底層を組み立てます。
      1. 1フィートのバーの両端に1つのコーナーブラケットを滑り込ませ、コーナーブラケットをブラケットの脚がバーの端と同じ位置になるように合わせ、ネジを締めて所定の位置に固定します。
      2. 直立のチャンネルにある緩いTナットでフレームの直立部分とフレームの間にバーを滑らせます。コーナーブラケットの上端が直立の開放端より1インチ下になるようにバーを配置し、コーナーブラケットのネジを締めて所定の位置に固定します。
6. 4つの長方形のポリエステルシートのTナットを直立押出バーの溝の中にスライドさせて、チャンバーの側面を覆うrを締め、ファスナーを締めて所定の位置に固定します。
7. チャンバーの内部にアクセスするための扉となる片側を選択し、チャンバーの最下層にある2本のネジとTナットを取り外します。
   注：フレームを直立させると、このカバーの底部が底に緩く垂れ下がり、持ち上げてチャンバの室内にアクセスできます。
8. プラスチック製のキャップを各コーナー部材の上端に置いて、完成したフレームのフィートとして使用します。フレームを右に上に回します。フレームのベースレイヤーの内側に2つのパネルホルダーを1つずつ挿入し、ねじ込んで固定します（ 図1B 、レイヤー3）。アッセイプレート（ 図1B 、層3）のためのステージを提供するために、12×12インチの²枚の透明なアクリルをパネルホルダーの上に置きます。

2.カメラとステージテンプレートの位置決め

1. 顕微鏡カメラビデオ取得ソフトウェアをダウンロードしてコンピュータにインストールする製造元のウェブサイトから入手してください。
2. 3つのカメラホルスタのそれぞれに顕微鏡カメラを挿入し、カメラの光学系をアクリルステージとバックライトの方に向けます。カメラをコンピュータのUSBポートに接続します。赤外線LEDバックライトパネルをフレームの下に置き、ステージの真下に配置します。バックライトパネルを接続して電源を入れます。
3. 提供されたソリューションプレースメントおよびプレートアライメントテンプレートを透明シートに印刷します （ 補足ファイルを参照）。
   注：溶液配置テンプレートでは、プレート円周は直径3.8 cmであり、関心円の内側領域は直径0.9 cmです。
4. グリッド線に沿ってカットして、円形のテンプレートを囲む長方形の透明部分を取得します。
5. ビデオ取得ソフトウェアを起動し、ウィンドウの上部にあるサムネイルの番号をクリックすると、カメラのフィードが表示されます。
6. 顕微鏡カメラの位置合わせと倍率を調整します。
   1. 顕微鏡カメラのレンズの下にプレートアラインメントテンプレートを配置します （ 図2B ）。
   2. カメラホルダーに沿ってカメラホルスターを垂直方向にスライドさせて作業距離を変更し、カメラの視野の端にテンプレートの番号マーカーがはっきりと見えるように、カメラの拡大ダイヤルを回してカメラの倍率を調整します。
   3. プレートアライメントテンプレートをアクリルステージに貼り付けます。
   4. 顕微鏡カメラの下のプレートアライメントテンプレート上にワームのサンプルプレートを置き、視野内の番号マーカーを維持しながら、ワームの鮮明な画像が得られるまで倍率と作動距離をさらに絞り込みます。
   5. 他の2台の顕微鏡カメラについては、ステップ2.6.1〜2.6.6を繰り返します。

3.線虫の成長と同期

1. 実験の4日前に、24個の60mmLuria-Bertani（LB）ブロス（レシピについてはセクション5を参照）中の50μLのOP50 大腸菌（Escherichia coli ）を含む線虫成長培地（NGM）寒天プレート上で培養した。
   注：各60 mmプレートは、1つのアッセイプレートに十分なワームを提供します。 1回の治療または遺伝子型につき6回の反復を取得することが推奨される。
2. 播種したプレートを蓋を付けて直立させ、室温で一晩乾燥させる。
3. 翌日、15匹の十分に給餌された妊娠した雌雄同体を各播種プレートに移し、虫が6時間卵を産むことを可能にする。これは1プレートあたり360個以上の卵を生み出すでしょう。
4. 6時間後、播種したプレートから虫を取り除き、子孫を20℃で成虫に3日間生育させる。

4.化学感覚嗜好アッセイ

1. 実験の前日に、35mm NGM寒天アッセイプレートを調製する。
   1. 250mLのNGM寒天を調製する（レシピについてはセクション5を参照）。
   2. 平らな上に5枚以下のスタックで28枚の空の35mmプレートを配置する顔。各アッセイプレートに5mLのNGM寒天を充填する。アッセイプレートを蓋を付けて直立させ、室温で一晩乾燥させる。
      注意：経験則として、偶発事象が発生した場合には、各治療法または遺伝子型をアッセイするための追加のアッセイプレートを1つ用意してください。
2. 実験の当日、バックライトをオンにしてコンピュータを起動し、顕微鏡カメラビデオキャプチャソフトウェアを起動します。
3. 顕微鏡カメラをコンピュータに接続し、ビデオ録画設定を調整します。
   1. ソフトウェアウィンドウの上部にある番号の付いたカメラのサムネイルをクリックすると、カメラのライブフィードが表示されます。
   2. カメラフィードの左上隅にある「ビデオフォーマット」メニューをプルダウンし、「MJPG 1280 x 1024」を選択します。 「ビデオフォーマット」メニューの横にある「フォルダ」メニューをプルダウンし、ビデオファイルを保存するフォルダを選択します。
   3. 右上隅の[自動露出]アイコンをクリックします。カメラの電源を入れ、自動露出をオフにします。内蔵の顕微鏡カメラのLEDを消すには、 'Auto Exposure'アイコンのすぐ右側にある 'LED'アイコンをクリックします。隣接する「設定」アイコンをクリックします。「モノクロ」を選択し、「コントラスト」を最大にし、ワームがバックグラウンドとは区別されるまで「明るさ」を調整します。
4. 較正ビデオを入手する。
   1. ステージプレートアライメントテンプレートの上にソリューション配置テンプレートを配置します （ 図2A ）。カメラのフィードの左側にある 'Time-Lapsed Video'録画アイコンをクリックし、1フレーム/秒で5秒のビデオを録画するには、 '5'を入力し、間隔を '1'に入力します。ビデオ録画を開始するには、「開始」をクリックしてください。
5. 他の2台の顕微鏡カメラについては、4.3と4.4の手順を繰り返します。
6. チャンバーから溶液配置テンプレートを取り出します。
7. ワームを洗浄バッファーで3回洗浄して、食物を除去する。
   1. 5mLのガラスピペットを使用して、1.2mLのNGM緩衝液を同期した虫のプレートに加え、穏やかにプレートを攪拌して、虫を緩衝液に置換する。プレートからバッファーをピペットで取り出し、緩衝液中のワームを清潔なマイクロ遠心チューブに分注する。
      注：ワームは、培養寒天塩濃度¹⁴からの偏差に敏感です。ワームの配置後の寒天濃度の変化を最小限に抑えるには、洗浄プロセスにNGMバッファーを使用することを推奨します（レシピについてはセクション5を参照）。ワームが側面にくっつくため、プラスチックピペットを使用してプレートからワームを除去しないでください。同時に実行するアッセイプレートの数と同数のチューブを準備する。
   2. 3本のチューブを1〜2分間放置して、ワームを底に沈める。プラスチックピペットチップを使用して、凝集塊のペレットを妨げることなくできるだけ多くの洗浄バッファーをチューブから除去するチューブの底にある虫。 1mLのきれいなNGM緩衝液でチューブをそれぞれ補充する。
   3. ステップ4.7.2を1回繰り返します。
8. アッセイプレートに10 mM CuCl ₂およびM13バッファー溶液を加えます（レシピについてはセクション5を参照）。
   1. 解剖顕微鏡のステージの上部に溶液配置テンプレートを貼り付けます。
   2. プレートアライメントテンプレートの両面に両面テープを貼り付けます。テープがプレート外周円と重なっていることを確認しますが、テンプレートの中心に関心のある記録領域は遮らないようにしてください。
   3. アッセイプレートの周辺をプレートアラインメントテンプレートの円と整列させ、プレートの下にテンプレートが付着するまで押し下げます。アッセイプレートテンプレート番号マーカーを解剖顕微鏡上の溶液 - 配置テンプレートマーカーと整列させる。
   4. P2ピペットとプラスチックチップを使用して、1μLのM13バッファーをそれぞれ1および4象限に配置します（ 図2A）。新しいチップを使用して、10 mM CuCl ₂溶液1μLをそれぞれ象限2と3に配置します（ 図2A ）。
   5. 他の2つのアッセイプレートについては、ステップ4.8.2-4.8.4を繰り返します。
9. 溶液の滴が寒天に完全に吸収されたら、ガラス製のパスツールピペットを用いて洗浄した虫を各マイクロ遠心管から対応するアッセイプレートに移す。
10. 円形処理された領域の上下の領域にそれぞれ一滴のワームを置きます。組織を4回折り畳み、平滑末端を使用して、すべてのアッセイプレート上の過剰の洗浄バッファーを吸収する。
11. 直ちに、3つのアッセイプレートを、テンプレートコーナーで番号を整列させることによって、挙動チャンバ内の顕微鏡カメラの下に配置する。ワームをアッセイプレートに順応させるために2〜3分間待つ。
    注記：次のステップでビデオ録画を開始する前に、ビヘイビアチェンバーのドアフラップが閉じていることを確認してください。
12. カメラのフィードの左側にある[Time-Lapsed Video]録画アイコンをクリックし、1秒間に10フレームのビデオを録画するには、「10分」、「1分」を入力します。ビデオ録画を開始するには、「開始」をクリックしてください。ビデオを記録して保存した後、アッセイプレートをチャンバーから取り出します。
13. 次のラウンドのアッセイプレートについて、ステップ4.7-4.12を繰り返す。治療または遺伝子型毎に少なくとも6回の複製または2回の記録を獲得する。

5.試薬の調製

1. NGM寒天および緩衝液を調製する。
   1. 1Lのガ​​ラス瓶に、1.5gの塩化ナトリウム、8.5gの寒天、および1.25gのペプトンを添加する。 500mLの蒸留水と攪拌棒をボトルに加える。内容物を含むオートクレーブボトル。
   2. ボトルを攪拌プレートに置き、攪拌機能をオンにします。
   3. 滅菌技術を用いて順番に加える：0.5mLの5mg / mLコレステロール、0.5mLの1Mカルシウム0.5Mの1M硫酸マグネシウム、および12.5mLの1Mリン酸カリウムを添加した。
   4. ステップ5.1.1〜5.1.2を繰り返してNGMバッファーを作成するが、ステップ5.1.1で寒天とペプトンは除外する。
2. LBブロスを調製する。
   1. 1Lのガ​​ラス瓶に、トリプトン5g、酵母エキス2.5g、塩化ナトリウム2.5g、蒸留水500mL、1N水酸化ナトリウム0.5mLを加える。内容物を含むオートクレーブボトル。
3. M13バッファーを調製する。
   1. 1Lのガ​​ラス瓶に、1.817gのトリス、2.922gの塩化ナトリウム、0.373gの塩化カリウム、および500mLの蒸留水を加える。ボトルを内容物でオートクレーブする。
4. 塩化銅（CuCl ₂ ）溶液を調製する。
   1. 0.134gのCuCl _2を秤量する。 100mM CuCl ₂原液を調製するために、15mLプラスチックチューブ中のM13緩衝液10mLに溶質を添加する。すべての溶質がdissoになるまでプラスチックチューブを逆さにするlved。
   2. シリンジと0.2μmメンブレンフィルターを使用して100 mM CuCl ₂溶液をクリーン15 mLプラスチックチューブに浄化します。
   3. 10mM CuCl ₂溶液を作製するために、900μLのM13バッファーおよび100μLの100mM CuCl ₂ストック溶液をマイクロ遠心管に加える。微量遠心チューブを反転させてよく混和させます。

ビデオ分析

1. Python 3（https://www.python.org/downloads/）とOpenCVソフトウェアライブラリ（http://opencv.org/downloads.html）をダウンロードしてください。
2. 分析用の3つのPythonスクリプト（https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm）をダウンロードしてください。
   注：続行する前に、使用するすべてのビデオファイルがmp4形式であることを確認してください。
3. 関数とパラメーターの説明を表示するには、コンソールに「help（function nameを入力）」と入力してEnterキーを押します。たとえば、「help（calibration）」と入力してEnterキーを押します。
4. キャリブレーション機能を実行する関心のあるビデオ領域（ROI）を定義するための入力パラメータを備えています。
   1. 変数 'mp4filename'に対してセクション4で取得したキャリブレーションビデオのファイル名を入力します。ファイル名を入力するときは引用符を含めます。
   2. 'Q * x'と 'Q * y'変数の値600と360から始めます。 *象限番号1から4を入力します。「rad」変数の値310から始めます。 ROIマスクがテンプレートの象限アウトラインに揃うまで、変数値を調整します。
   3. この機能の実行時にコンソールに印刷される各ROIの総ピクセル数を記録します。 preference_index関数の 'ROI_size'パラメータにこの値を入力します。
5. threshold_constant関数を実行して、適切な閾値化定数を決定します。ワーム（白い）がはっきりと見えるようになるまで「一定」の値を調整し、背景には塩と胡椒の騒音が最小限に抑えられます（黒）。
6. preference_index関数を実行して、csvデータシート、ビデオの優先順位インデックス、および付随するワーム占有プロットを生成します。
   1. preference_index関数の入力パラメータとして、ステップ6.4および6.5から決定された 'Q * x'、 'Q * y'、 'rad'、 'ROI_size'および 'constant'値を使用します。
      注記：各ビデオフレームについて、preference_index関数は各ROI内のワームピクセルの数をカウントし、ROIピクセルの総数のうちワームピクセルの割合を計算します。この関数は、次の式を使用して各ビデオフレームの優先インデックス値を生成します。
      
      注記：プログラムがビデオ内のすべてのフレームを分析すると、ビデオの平均嗜好インデックス値が生成されます。ワーム占有率プロットは、ビデオの優先度インデックスが上に印刷され、csvデータシートにはワームのピクセル、ワーム占有率の割合、および各ビデオフレームの設定インデックスは、プログラムの実行が終了すると指定されたフォルダに保存されます。

図3Aは、異なる遺伝子型および治療対において得られた嗜好指標値を示す。嗜好指数値1は、実験ROIに置かれた解に対する強い誘引力を示し、嗜好指数値-1は、強い反発力を示す。 M13緩衝溶液を対照ROIおよび実験ROIの両方に配置した場合、0.02の嗜好指数が得られ、いずれのROIに対しても空間的偏りがないことが実証された。 N2虫は銅イオンを強く避け、嗜好指数は-0.67であり、これは銅イオンが強力な忌避剤であるという以前の知見を裏付けている（ 補遺1 ） ⁴ 。感覚繊毛の遠位部分の適切な形成を欠いているosm-3突然変異体は、銅イオン（PI = -0.19）の有意に減少した回避を示した¹⁵ 。 ocr-2変異体は、de銅回避を含む多くのASH仲介侵害受容応答において有害であり、銅イオン（PI = 0.19）に対する軽度の誘引も有意に減少した（ 補助映画2 ） ¹⁶ 。

図3Bは、代表的なワーム占有率のプロットを示しています。これは、コントロール内のワームの密度と各ビデオの経時的な実験的ROIを示しています。描画領域の色が濃いほど、ROI内のワームピクセルの数が多くなります。 M13緩衝液対照で処理したN2虫の占有率プロットは、両方のROIにおける虫の数がアッセイを通して同様のままであることを示している。しかし、銅イオンで処理されたN2虫の占有率プロットは、ワームが、アッセイを通して試験ROIを強く一貫して回避することを示しています。

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図1：行動室設計の写真と図式表現。 （ A ）挙動チャンバのセットアップの正面図（左）およびチャンバフレームの対応する概略図（右）。不透明なポリエステルシートは、底面を除くすべての面にチャンバを囲み、赤外線バックライトパネルからの光を通過させる。数字1,2および3は（B）の押出層に対応する。 （ B ）挙動チャンバフレームを構成する押出層の平面図。これには、最上層（1）、中間カメラマウントアセンブリ層（2）、および最下段層（3）が含まれる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2：ソリューション配置とプレート配置テンプレート （ A ）ソリューション配置テンプレートには、4つの象限と番号整列マーカーがあります。対照溶液を左上および右下象限に入れ、実験溶液を右上および左下の四分円に入れる。 （ B ）プレートアラインメントテンプレートは、ビデオ記録および分析中に視野内のワームの閉塞を最小限に抑えるための番号整列マーカーのみを有する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3：このアッセイを使用して収集されたデータの例 （ A ）野生型N2および変異体C.エレガンス（C. elegans ）の優先順位指数（PI）値 M13緩衝液および10mM CuCl ₂に応答してm>。 N2虫は、M13対照溶液を両方のROIに入れたときに対照と実験ROIの間に優位性は示さなかったが、銅イオンが置かれたときに実験ROIを強く避けた（PI = 0.02および-0.67）。 osm-3（p802）突然変異体およびocr-2（ak47）突然変異体は、N2と比較して銅イオンの回避が有意に減少した（PI = -0.1および0.2）。各遺伝子型 - 治療ペアリングについてN = 6アッセイ、検定当たり360ワーム、エラーバーは±1SEM、***p <0.001、一方向性ANOVA、ポストホックTukey Honestly Significant Difference（HSD）試験を示す。 （ B ）対照ROIにはM13バッファ、実験ROIには銅イオン（下）の両方のROI（上）およびN2ワームにM13バッファを有するN2ワームの代表的なワーム占有率プロット。各占有プロットの下のカラースケールは、ワームピクセルの数を表します。pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

補遺ムービー1：10mM塩化銅に対するN2虫の行動応答。ワームはM13バッファー（左上と右下）でコントロール四分円に引き付けられますが、M13バッファーに溶解した銅イオンを含む四分円（右上と左下）を強く避けます。ビデオは毎秒1フレームで記録され、15倍高速化されました。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。

補足ムービー2： 10mM塩化銅 に対する ocr-2（ak47） ワームの 行動応答 。ワームは、M13バッファー（左上と右下）とコントロール四分円の両方でおよそ等しい程度までローミングし、M13バッファー（右上と左下）に溶解した銅イオンを含有しています。突然変異体は、記録の開始時に銅イオンを含有する象限に対してわずかな選択性を示す。ビデオは毎秒1フレームで記録され、15倍高速化されました。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。

補足ファイル：ソリューション配置およびプレートアライメントテンプレート。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。

このプロトコルの重要なステップは、アッセイプレートが異なる実験日間にわたって一貫したレベルの乾燥度を有することを保証することである。乾燥レベルが異なると、溶液の寒天への拡散速度が異なり、結果として行動結果が変化する。したがって、アッセイプレートは実験前に常に午後に新鮮にしなければならない。アッセイ間の比較を容易にするために、アッセイごとに試験したワームの数もまた規制しなければならない。上記ウォーム同期プロトコルは^17に従っている場合、参照のために、野生型のワームは、アッセイ当たりの平均得> 360のワームに4-10個の卵/時間を産みます。特定の突然変異系統が産卵欠損である場合、産卵のためにより多くの妊娠した成虫の虫を拾い、子孫の標的数に達するようにする。このプロトコルのもう一つの重要なステップは、洗浄プロセスとワームの配置中にワームを静かに処理することです。ワームは機械的刺激に敏感で、ストレス反応を誘発する逆転と産卵阻害¹⁸ 。さらに、ROIを正確に定義し、ビデオ解析を進める前に、特定の照明条件に対する最適な閾値設定定数を決定するように注意する必要があります。また、最後の実験が実行されてから長い時間が経過した場合には、較正としきい値処理のプロセスを繰り返すことをお勧めします。

この方法の限界は、小さなワーム集団をアッセイするのには適していないということである。しかし、食べ物の存在が感覚行動に及ぼす影響を決定するための適切なコントロールが行われた場合、食物を利用して保持アッセイと同様にワームの空間的探索位置を制限することも可能である。加えて、この方法は、接近しているために刺激勾配ナビゲーションを研究するためのものではなく、少量の対照溶液および実験的溶液滴を使用した。

著者は何も開示することはない。

いくつかの株は、NIH Office of Research Infrastructure Programs（P40 OD010440）の資金提供を受けているCaenorhabditis Genetics Center（CGC）によって提供された。この作業は、PWSが調査者であるHoward Hughes Medical Instituteによってサポートされています。