ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

אנו מציגים התנהגות הקלטה הקלטה ופרוטוקול המאפשר ניתוח אוטומטי של נמטודות, Caenorhabditis elegans 'העדפת תרכובות מסיסות באסאי מבוסס האוכלוסייה. מאמר זה מתאר את הבנייה של תא התנהגות, פרוטוקול assay התנהגותי, וניתוח וידאו השימוש בתוכנה.

Nematode, Caenorhabditis elegans 'מערכת העצבים קומפקטית של רק 302 נוירונים מבסס רפרטואר מגוון של התנהגויות. כדי להקל על דיסקציה של מעגלים עצביים בבסיס התנהגויות אלה, פיתוח מבחני התנהגות חזקים לשעתקו נחוץ. מחקרים קודמים של C. elegans השתמשו בווריאציות של "בדיקת טיפה", "assay chemotaxis" ו- assay לשמירה על מנת לחקור את התגובה של C. elegans לתרכובות מסיסות. השיטה המתוארת במאמר זה שואפת לשלב את החוזקות המשלימות של שלוש מבחני הנ"ל. בקצרה, מעגל קטן באמצע כל צלחת assay מחולק לארבעה הרביעים עם שליטה פתרונות ניסיוניים להציב לסירוגין. לאחר התוספת של תולעים, צלחות assay נטענים לתוך חדר התנהגות שבו מצלמות מיקרוסקופ להקליט את המפגשים של תולעים עם האזורים המטופלים. ניתוח וידאו אוטומטי מבוצעת לאחר מכןNd נוצר ערך אינדקס מועדף (PI) עבור כל סרטון. רכישת וידאו ותכונות ניתוח אוטומטי של שיטה זו ממזער את מעורבותו של הנסיין ואת כל השגיאות הקשורות. יתר על כן, כמויות זעירות של המתחם ניסיוני משמשים assay ואת ההתקנה של החדר מרובה מצלמה ההתקנה מגדילה את התפוקה הניסויית. שיטה זו שימושית במיוחד לניהול מסכים התנהגותיים של מוטציות גנטיות ותרכובות כימיות חדשות. עם זאת, שיטה זו אינה מתאימה ללימוד ניווט גירוי שיפוע בשל הקרבה של אזורי פתרון ניסיוני. זה גם לא אמור לשמש כאשר רק אוכלוסייה קטנה של תולעים זמין. בעוד מתאים assaying תגובות רק תרכובות מסיסות בצורתו הנוכחית, שיטה זו יכולה להיות שונה בקלות כדי להתאים אינטראקציה חושי multimodal ומחקרים optogenetic. שיטה זו יכולה גם להיות מותאם כדי assay תגובות chemosensory של מינים אחרים nematode.

חיות החיות חייבות לשלב תשומות ממספר שיטות חישה ולבחור אסטרטגיות התנהגותיות מתאימות כדי לנווט בהצלחה את סביבתן. ההבנה כיצד מקבלים תשומות סנסוריות חיצוניות ומועברות לתוך מידע עצבי להנחיית בחירה בפעולה היא מטרה מרכזית בתחום הנוירוביולוגיה. נמטודת הגדילה הגנטית, C. elegans , היא אורגניזם מודל אטרקטיבי שבו ניתן לחקור את המנגנונים העצביים שבבסיס הביולוגיה החושית והאינטגרציה המולטימודלית. למרות C. elegans יש רק 302 נוירונים, הוא יכול לזהות להבחין בין מגוון רחב של גירויים סביבתיים, כולל תרכובות מסיסות, ריחני נדיפים, טמפרטורת הסביבה ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . הNematode C. elegans מסתמך בכבדות על מנגנון chemosensory שלה כדי למקם מקורות מזון להתריע בפני איומים פוטנציאליים. לפיכך, מבחני התנהגות שנועדו לסנן את התגובות של wild-type ומוטנטים C. elegans כדי גירויים כימיים לשחק תפקיד מכריע לנתח את המנגנונים הגנטיים, הסלולר, ואת עצבי ביסוד C. elegans 'יכולות חושיות יוצאת דופן.

כדי לענות על התגובה לתרכובות מסיסות, שלושה סוגים של מבחני תוארו - מבחן ירידה, assay chemotaxis, ואת assay השמירה. במבחן הירידה, טיפה קטנה של המתחם ממוקמת בזנב של תולעת נעה והחלטת התולעת להפוך או להתקדם כאשר הנוזל מגיע למנגנון החושי הקדמי הוא הבקיע ⁴ . מבחן הירידה דורש הכנה ניסיונית קטנה והוא שימושי כאשר גודל המדגם של תולעים הוא קטן, כמו במקרה של תולעים המופעלות באמצעות לייזר. עם זאת, כמו רק תולעת אחתיכול להיות assayed בכל פעם הנסיין חייב להיות נוכח לאורך כל תקופת assay, מבחן ירידה יכול להיות זמן רב. מבחן הירידה הוא גם פגיע וריאציות ירידה משלוח בין כל תולעת בתוך מדגם, אשר עשוי להשפיע על התוצאות הכוללות של assay. מגבלה נוספת של מבחן הירידה היא כי ניתן להשתמש בו רק כדי assay התגובה של תולעת על תרכובות מרתיעה כפי שאי אפשר להפלות בין אפקט אטרקטיבי או נייטרלי של המתחם מהתנועה קדימה של התולעת.

Assay chemotaxis עבור תרכובות מסיסות בדרך כלל מחייב חלוקת צלחת אגר לארבעה הרביעים, עם פתרון ניסיוני מעורב לתוך אגר של שני הרביעים מנוגדים פתרון שליטה מעורבב לתוך שני הרביעים השני ^{8 , 9} . בתחילת assay, טיפה של תולעים המכיל חיץ ממוקם במרכז הצלחת ואת מספר התולעים ב כל רבע הוא הבקיע בנקודות זמן שונות. Assay chemotaxis מספק כוח סטטיסטי גדול יותר בהשוואה לבדיקת ירידה כמו מספר גדול של תולעים נבדקים assay כל. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי הכנת לוחות assay chemotaxis דורש כמויות גדולות של המתחם ניסיוני. זה יקשה על ביצוע מסכי התנהגות בקנה מידה גדול, אם תהליך טיהור מסובך עם תשואות מוגבלות נדרש כדי להשיג את התרכובת של עניין, כמו במקרה של מולקולות איתות ascaroside ¹⁰ . בנוסף, ספירה ידנית של תולעים לאורך assay הוא רגישים שגיאות הפרעות של לוחות במהלך תהליך הספירה עשוי להשפיע על התוצאות.

שלא כמו שתי השיטות הנ"ל, assay שמירה משתמשת חזון המכונה, אשר ממזער שגיאה במהלך תהליך הבקיע ומקטין את ההתערבות של הנסיין במהלך assay > 11. ניתוח ממוחשב של הקלטות וידאו של התנהגות תולעת יכול גם לחשוף דינמיקה התנהגותית מתוחכמת כי יחמיץ כאשר הבקיע מבוצעת רק בכמה נקודות זמן בדידה. ב assay שימור, שתי נקודות כתמים מתווספים בצדדים הנגדיים של תיקון מזון קטן חיידקי עגול ואחריו המיקום של מספר קטן של תולעים באמצע תיקון המזון. התנהגות של תולעים אז הוא נרשם וידאו, ניתח, וערך אינדקס העדפה מחושב בהתבסס על המספר הכולל של פיקסלים תולעת בכל אזור פתרון. למרות נוכחותו של תיקון מזון אטרקטיבי מאפשר אוכלוסיות קטנות של תולעים לשמש assay כל, מזון בעבר הוכח רגיש התנהגויות הימנעות כדי repellants מסיסים ¹² . יתר על כן, תולעים התערוכה תגובה photophobic אור אורך גל קצר ושימוש במקורות אור מיקרוסקופ כי לפלוט אור לבן בהתקנה ההקלטה התנהגות עשוי להשפיע על התנהגותS = "xref"> 13.

מטרת השיטה דנו במאמר זה היא להקליט ולנתח C. העדפת elegans עבור תרכובות מסיסות באמצעות assay מבוסס האוכלוסייה. לשם כך, השיטה הנוכחית משלבת ומשפרת על היבטים מכל שלוש השיטות שנדונו קודם לכן. זה מאפשר אוכלוסיות גדולות של תולעים להיבדק דורש רק כמויות קטנות של הפתרון הניסיוני לשמש בכל assay. בנוסף, assay מתנהל בתוך חדר התנהגות סגורה בנוי עם תאורה אחורית אינפרא אדום LED כדי למזער את ההשפעות של אור אורך גל קצר על ההתנהגות. כל חדר יכול להיות גם outfitted עם מספר רב של מצלמות מיקרוסקופ, אשר מגדיל את התפוקה הניסויית מבלי להתפשר שטח הספסל. לבסוף, תוכנת ניתוח וידאו פלט את ערך מדד ההעדפות עבור כל וידאו, כמו גם תלונת התפיסה הנלווית העלילה לדמיין את התנהגות הדינמיקה האוכלוסייה לאורך זמן. ההגדרה קאמרית ופרוטוקול ssay ניתן לשנות עוד ללמוד תגובות התנהגות multimodal כגון ההשפעה של odorants או טמפרטורה על התנהגויות chemosensory.

מאמר זה מתאר את הבנייה של החדר התנהגות פרוטוקול assay. זה גם מדגים את התועלת של שיטה זו assaying התגובה של תולעים wild-type ו chemosensory מוטנטים פגומים לדוחה מסיסים ידוע, יונים נחושת ⁴ . לבסוף, תהליך ניתוח וידאו באמצעות התוכנה שסופקה מפורטת.

1. ההתנהגות האסיפה הקאמרית

הערה: תא ההתנהגות מורכב מסגרת בצורת קובייה בערך עשוי פסי אלומיניום extruded, מכוסה בשמיכות בד אטום, עם תחתית אקריליק ברור ותומך המצלמה. המפרקים בין מוטות האלומיניום המלוטשים המרכיבים את תא ההתנהגות הם כולם בניצב ומאובטחים באמצעות "L" בפינות בסוגריים בפינה (1 אינץ 'רחב עם רגליים 1 אינץ') אשר להדק רגל אחת פינה פינה לכל סרגל עם ברגים שקופיות- in אגוזים. כל מפרק מאובטח עם אחד או שני סוגריים בפינה כמתואר להלן. הבד מכסה מעל החדר מחוברים המסגרות אלומיניום מסגרת עם ברגים אותו שקופיות ב- T- אגוזים אבל דרך grommets בפינות הבד. ברגים מוכנסים כראוי לתוך הצד countersunk של שקופיות ב- T- אגוזים, לא לתוך הצד עם השפה בולטת. בעת חיבור מכלול בורג / T-Nutn לאגף אלומיניום, החלק את ה- T-Nut לערוץעל הפנים המתאימים של הבר עם ראש הבורג דבק מתוך החריץ.

1. הכן כיסויי בד.
   1. השתמש במספריים כדי לחתוך חמש חתיכות של בד פוליאסטר אטום כדי לכסות את הדף ואת ארבעת הצדדים של החדר.
      1. חותכים אחד מרובע 14 x 14 אינץ 'גיליון ² של בד עבור החלק העליון של החדר. חותכים ארבעה מלבני 11 x 14 אינץ ' ² גיליונות של בד על הצדדים של החדר.
   2. התקן grommets בפינות יריעות בד.
      1. סמן קו התייחסות 0.5 אינץ 'מכל קצה של כל חמש יריעות בד פוליאסטר באמצעות עיפרון ו ישר.
      2. עבור ארבעת הסדינים מלבניים, להשתמש צבת grommet להכניס grommets מרוכז שבו קווי עיפרון מצטלבים בכל פינה (כלומר, 4 grommets לכל גיליון).
      3. עבור גיליון מרובע, הכנס שני grommets לאורך כל קצה עם כל grommet מרוכז על קו העיפרון וממוקם 1.5 אינץ 'מקצה של כל אחדאת ארבע שורות העיפרון (כלומר, 8 grommets סך, שני ליד כל פינה).
   3. הכנס בורג לכל חור grommet ו loosely לצרף T- אגוז לכל אחד.
2. להרכיב ברים מצלמה הר.
   1. השתמש ראה הלהקה או שווה ערך לחתוך אחד 2 חתיכה ארוכה של אלומיניום שחול בר עבור כל מצלמה, הבטחת סוף לחתוך של הבר הוא מאונך על אורך הבר כדי להקל על הרכבה מאוחר יותר.
   2. השתמש במקדחה עם 0.25 אינץ 'קוטר לקדוח קצת לקדוח חור דרך קורי במרכז של כל בר הר המצלמה, 0.75 אינץ' מקצה אחד כזה החור הוא מאונך לפנים העליון והתחתון ועובר דרך קו הבסיס של הבר . לחלופין, לקדוח את החור באמצעות מקדחה חשמלית כף יד עם 0.25 אינץ 'תרגיל קצת, אבל להבטיח כי החור הוא בניצב לפנים העליון והתחתון של הבר.
3. הכן את כל סוגרי הפינות.
   1. הכנס בורג דרך החור פנימהכל רגל פינה בפינה, תוך הכנסת הבורג מהצד הפנימי של הזווית. בחוט רופף T- אגוז על כל בורג.
4. הכן את הרכבה הרכבה המצלמה ( איור 1B , שכבה 2).
   הערה: הרכבה של תושבת המצלמה היא הרכבה בצורת "H" התומכת בשלושת נרתיקי המצלמה.
   1. חבר את מוטות המצלמה למגש המרכזי של מכלול המצלמה.
      1. הניחו את שלושת מוטות הרכבה של המצלמה המפוברקים בשלב 1.2 עם חורים קדוחים בכיוון אנכי. להחליק שתי סוגריים בפינה על הצדדים של כל פס הר בקצה האחרון של החור המקודש.
      2. מקם את פינות הסוגריים עם הרגליים הסגורות עם קצה הבר והדק את הברגים למקומם בנקישה. זה יוצר צורה "T" עם חור קדח בחלק התחתון של "T".
      3. הנח 1 שחול אלומיניום הרגל על ​​משטח העבודה. להחליק את t- אגוזים של מצלמה אחת הר הרMbly (מהצעד הקודם) על צד אחד של הבר 1 מטר. מרכז את סרגל הר לאורך אורך 1 ברגל הרגל להדק את הברגים כדי לאבטח במקום. החלק את שני מוטות ההרים האחרים אל הצד הנגדי של סרגל הרגל.
      4. מקמו את שני מוטות במרחק של באמצע של 1 מטר ברגל, עם סוגריים פינות הפנימי שלהם כ 2.5 ס"מ זה מזה. סובבו פינות פינות על הצדדים של הבר 1 מטר, שניים בכל קצה של הבר. מקם את פינות הסוגריים עם הרגליים הסגורות עם קצוות הבר והדק את הברגים למקומם.
   2. צרף את סרגלי הסיום לסרגל המרכזי.
      1. להחליק שני רגל extrusions אלומיניום על t- אגוזים בכל קצה של הרכבה מן השלב הקודם להרכיב "H" צורה. מרכז כל סרגל בסוף על הבר במרכז מאובטח על ידי הידוק ארבעת הברגים.
      2. החלק ארבע תושבות פינות אל החלק העליון של שני מוטות הקצה שנוספו בשלב הקודם, אחד בכל קצהשל כל בר. מקם את תושבות הפינות עם הרגליים של הסוגריים עם הקצוות של הסורגים והדק את הברגים למקומם.
   3. צרף את המצלמה ואת הנרתיקים למצלמה הרכבה הרכבה.
      1. עבור כל אחד משלושת המצלמה מיקרוסקופ עומד, להסיר את נרתיק המצלמה על ידי שחרור התרוממות ואת החלקה את מוט לעמוד.
      2. עבור כל פס הר של המצלמה (מאובטח כעת לסרגל המרכזי של ה "H"), הכניסו מכונת כביסה אחת על בורג עגול, החלקו את הבורג דרך החור המקדח שבמכשיר הר של המצלמה והכניסו מכונת כביסה נוספת על הבורג . פתיל את החור tapped של המצלמה לעמוד מוט למטה על הבורג, הידוק מאובטח נגד פס הר המצלמה.
      3. חזור על שלבים 14.3.2 עבור שני פסילי המצלמה האחרים.
      4. להחליק נרתיק מצלמה על כל מוט לעמוד המצלמה עם פתיחת רחב יותר לכיוון בר הר המצלמה בורג. באופן זמני לאבטח את הנרתיק למצב המתנה של המצלמהOd עם אקדח של נרתיק.
         הערה: עמדת ההפעלה הסופית תוגדר בסעיף 2.
5. להרכיב את מסגרת החדר התנהגות ( איור 1 א ).
   הערה: כדי להקל על הבנייה, להרכיב את המסגרת במהופך, החל "העליון" של המסגרת של החדר על משטח העבודה ( איור 1 ב , שכבה 1) ועבודה כלפי מעלה לכיוון "הרגליים" של המסגרת ( איור 1B , שכבת 3).
   1. כדי להרכיב את השכבה העליונה של החדר התנהגות, לצרף 4 ברים אלומיניום extruded 1 מטר לסדין פוליאסטר מרובע ( איור 1B , שכבה 1).
      1. החלק בר אחד אל שני אגוזי ה- T לאורך כל קצה של יריעת הבד, ומרכז את הבר לאורך רוחב האריג. הדק את המחברים כדי לאבטח את יריעת הבד על כל עמוד.
      2. מורחים את גיליון פוליאסטר מרובע על משטח העבודה wiארבעת מוטות אלומיניום המצורפת למעלה. להחליק שמונה בסוגריים פינה על המשטחים העליון של ארבעת מוטות אלומיניום, אחד בכל קצה של כל בר. מקמו את תושבות הפינות על הסורגים עם הרגליים האנכיות של הסוגריים עם הקצוות של הסורגים. מאובטח על ידי הידוק הברגים לתוך T- אגוזים.
   2. בתורו בכל פינה, לעמוד נוסף שחול אלומיניום רגל 1 זקוף, מחליק את שחול מעל T- אגוזים על שתי רגליים סוגר בפינה.
   3. אבטח את הסרגל הישר אל הסרגלים האופקיים על ידי הידוק המחברים, ובכך תצטרף לשני הסרגלים האופקיים הסמוכים.
      הערה: כאשר השלמת, שמונה extrusions (ארבעה אופקי וארבע אנכי) יהוו טבעת מרובע על השולחן עם ארבע הודעות דבק כלפי מעלה ( איור 1B , שכבה 1).
   4. החלק את ה - T-nuts המשוחררים של הרכבה הרבועה של המצלמה "H" מסעיף 1.4 כלפי מטה, לתוך הזוויות של המסגרת מהצעד הקודם. תן את "H &34; להחליק כל הדרך למטה לנוח על גבי פינות בפינה בכל פינה של המסגרת. אבטח את מכלול המצלמה למקומו באמצעות הידוק ארבעת הברגים.
   5. להרכיב את השכבה התחתונה של החדר באמצעות הסופי ארבעה 1 ברים אלומיניום extruded אלומיניום ( איור 1B , שכבה 3).
      1. החלק קצה אחד של פינה על כל קצה של כל אחד מהרגליים, מקם את תושבות הפינות עם הרגליים של הסוגריים עם קצוות הבר והדק את הברגים למקומם.
      2. החלק את הסורגים בין מסגרת המסגרת עם אגוזי ה- T הרופפים בערוצי הזרוע. הצב את הסורגים כך שהקצוות העליונים של סוגרי הפינות שלהם יהיו 1 אינץ 'מתחת לקצה הפתוח של המגדלים ויבטיחו את מקומם על ידי הידוק הברגים.
6. החלק את T- אגוזים של ארבעת הסדינים פוליאסטר מלבני למטה לתוך ערוצי ברים שחול זקוף כדי לכסות את הצדדים של chambeR ו להדק את מחברים כדי לאבטח במקום.
7. בחר צד אחד כדי להיות דלת לגישה הפנים של החדר ולהסיר את שני ברגים ואגוזים T בשכבה התחתונה של החדר.
   הערה: כאשר המסגרת הופכת זקופה, החלק התחתון של המכסה ייתקע רופף בתחתית ויכול להיות מורם כדי לגשת אל תא החדר.
8. מניחים מכסה פלסטיק בקצה העליון של כל חבר פינה כדי לשמש כרגליים עבור המסגרת הושלמה. סובב את המסגרת בצד ימין למעלה. הכנס שני מחזיקי לוח לכל צד בתוך מסגרת הבסיס שכבת טוויסט לאבטח אותם במקום ( איור 1 ב , שכבה 3). מניחים 12 x 12 אינץ 'חתיכת ² של אקריליק ברור על גבי בעלי לוח לספק שלב עבור לוחות assay ( איור 1B , שכבה 3).

2. מצלמה ומצב תבנית הבמה

1. הורד והתקן את המצלמה מיקרוסקופ וידאו רכישת תוכנה על גבי המחשבמאתר היצרן.
2. להחליק מצלמה מיקרוסקופ לתוך כל אחד משלושת נרתיקי מצלמה עם המצלמה אופטיקה הצביע למטה לעבר הבמה אקריליק תאורת רקע. חבר את המצלמות ליציאות ה- USB של המחשב. מקמו את התאורה האחורית של תאורת LED אינפרא אדום מתחת למסגרת, וממוקדת מתחת לבמה. חבר את לוח התאורה האחורית להפעלה.
3. הדפס את התבניות המוצעות - מיקום ותצוגת יישור צלחת על גיליונות שקיפות (ראה קובץ משלים ).
   הערה: על תבנית מיקום הפתרון, המעגל ההיקפי של הצלחת הוא 3.8 ס"מ קוטר ואת האזור הפנימי של המעגל עניין הוא 0.9 ס"מ קוטר.
4. גזור לאורך קווי הרשת כדי להשיג חתיכות שקוף מלבני המקיף את תבניות עגול.
5. הפעל את תוכנת רכישת הווידאו ולחץ על התמונות הממוזערות הממוספרות בחלק העליון של החלון כדי להציג את הזנות המצלמות.
6. התאמת יישור המצלמה מיקרוסקופ והגדלה.
   1. מיקום תבנית יישור צלחת תחת עדשת המצלמה מיקרוסקופ ( איור 2 ב ).
   2. שנה את מרחק העבודה על-ידי הזזה אנכית של נרתיק המצלמה לאורך מוט המצלמה, והזן את הגדלת המצלמה על-ידי סיבוב חיוג ההגדלה של המצלמה עד שסמני המספרים של התבנית נראים בבירור בשולי שדה התצוגה של המצלמה.
   3. קלטת תבנית יישור צלחת לשלב אקרילי.
   4. מניחים צלחת מדגם של תולעים על הצלחת יישור תבנית מתחת למצלמה מיקרוסקופ ועוד לחדד את ההגדלה ואת מרחק העבודה עד תמונה חדה של תולעים מושגת תוך שמירה על מספר סמנים בתחום התצוגה.
   5. חזור על שלבים 2.6.1-2.6.4 עבור שתי מצלמות מיקרוסקופ אחרות.

3. נמטודות צמיחה וסינכרון

1. ארבעה ימים לפני הניסויים, זרע עשרים וארבע 60 מ"מNematode צמיחה מדיה (NGM) צלחות אגר עם 50 μL של OP50 Escherichia coli ב Luria-Bertani מרק (LB) מרק (ראה סעיף 5 למתכון).
   הערה: כל צלחת 60 מ"מ יספק מספיק תולעים עבור צלחת assay אחד. רוכשת שישה משכפלים לכל טיפול או גנוטיפ מומלץ.
2. השאירו את צלחות seeded להתייבש זקוף עם מכסים על, לילה בטמפרטורת החדר.
3. למחרת, מעבירים חמישה עשר הרמפארודיטים כבדים על כל צלחת זרעים ומאפשרים תולעים להטיל ביצים במשך שש שעות. זה יניב> 360 ביצים לכל צלחת.
4. לאחר 6 שעות, להסיר תולעים של צלחות seeded ולתת הצאצאים לגדול במשך שלושה ימים למבוגרים ב 20 ° C.

4. Asshem העדפה Chemosensory

1. יום לפני הניסוי, להכין 35 מ"מ NGM אגר assay צלחות.
   1. הכן 250 מ"ל של אגר NGM (ראה סעיף 5 למתכון).
   2. מסדרים עשרים ושמונה צלחות 35 מ"מ ריקות בערימות של חמישה או פחות על סו שטוחהRface. ממלאים כל צלחת assay עם 5 מ"ל של אגר NGM. השאירו צלחות assay להתייבש זקוף עם מכסים על, לילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: ככלל אצבע, להכין צלחת אחת נוספת assay עבור כל טיפול או גנוטיפ להיות assayed במקרה של contingencies.
2. ביום הניסוי, להדליק את התאורה האחורית, אתחול המחשב, ולהפעיל את המצלמה מצלמת מיקרוסקופ ללכוד תוכנה.
3. חבר מצלמת מיקרוסקופ למחשב והתאם את הגדרות הקלטת הווידאו.
   1. לחץ על התמונה הממוזערת של המצלמה הממוקמת בחלק העליון של חלון התוכנה כדי להציג את העדכון החי של המצלמה.
   2. משוך למטה את התפריט 'פורמט וידאו' בפינה השמאלית העליונה של הזנת המצלמה ובחר 'MJPG 1280 x 1024'. משוך למטה את התפריט 'תיקייה' ליד התפריט 'וידאו פורמט' ובחר תיקייה שבה לשמור את קבצי הווידאו.
   3. לחץ על הסמל 'חשיפה אוטומטית' בפינה השמאלית העליונה שלהמצלמה להאכיל לכבות את החשיפה האוטומטית. לחץ על סמל 'LED' מיד בצד ימין של 'חשיפה אוטומטית' סמל לכבות את המצלמה מובנית מיקרוסקופ LEDs. לחץ על האייקון 'הגדרות' הסמוך: בחר 'מונוכרום', למקסם 'ניגודיות', ולהתאים 'בהירות' עד תולעים להיראות שונה מהרקע.
4. רכישת קטעי וידאו כיול.
   1. יישר תבנית פתרון מיקום על גבי תבנית צלחת יישור שלב ( איור 2 א ). לחץ על 'זמן וידאו שבורים' סמל ההקלטה בצד שמאל של הזנת המצלמה והזן '5' s למשך ו '1' s עבור מרווח כדי להקליט וידאו 5 של 1 מסגרת 1 / s. לחץ על 'התחל' כדי להתחיל להקליט וידאו.
5. חזור על שלבים 4.3 ו -4.4 עבור שתי מצלמות מיקרוסקופ אחרות.
6. הסר את תבנית פתרון המיקום מהתא.
7. לשטוף תולעים שלוש פעמים עם חיץ לשטוף כדי להסיר מזון.
   1. השתמש 5 מ"ל פיפטה זכוכית להוסיף 1.2 מ"ל של חיץ NGM לצלחת של תולעים מסונכרנים בעדינות להסעיר את הצלחת כדי לעקור את התולעים לתוך המאגר. פיפטה למעלה חיץ מהצלחת לוותר תולעים במאגר לתוך צינור microcentrifuge נקי.
      הערה: תולעים רגישות לסטיות מ ריכוז שלהם אגר culturing תרבותי ¹⁴ . כדי למזער את השינויים בריכוז מלח אגר לאחר מיקום תולעת, מומלץ להשתמש במאגר NGM עבור תהליך הכביסה (ראה סעיף 5 למתכון). אין להשתמש פיפטות פלסטיק כדי להסיר תולעים מן הצלחות, כמו תולעים ידבק הצדדים. הכן מספר שווה של צינורות כמו מספר של לוחות assay להפעלה בו זמנית.
   2. תנו את שלוש צינורות לעמוד 1-2 דקות כדי לאפשר תולעים להתיישב לתחתית. השתמש קצה פיפטה פלסטיק להסיר ככל לשטוף חיץ מן צינורות ככל האפשר מבלי להפריע גלולה של צוברתולעים אדומות בתחתית הצינורות. מילוי צינורות עם 1 מ"ל של חיץ NGM נקי כל אחד.
   3. חזור על שלב 4.7.2 פעם אחת.
8. הוסף 10 מ"מ CuCl ₂ ו M13 פתרונות חיץ לוחות assay (ראה סעיף 5 עבור מתכונים).
   1. קלטת תבנית פתרון מיקום על גבי הבמה של מיקרוסקופ לנתח.
   2. מניחים רצועה דו צדדית קלטת משני צדי תבנית יישור צלחת. ודא שהקלטת חופפת עם המעגל היקפי של הלוח, אך אינה כוללת את אזור ההקלטה של ​​העניין במרכז התבנית.
   3. יישר את המערכת של צלחת assay עם המעגל על ​​תבנית יישור צלחת ולחץ למטה עד התבנית שומרת על החלק התחתון של הצלחת. ליישר את הצלחת assay תבנית מספר סמנים עם פתרון מיקום סמנים תבנית על מיקרוסקופ לנתח.
   4. השתמש פיפטה P2 ופלסטיק קצה למקום 1 μL של חיץ M13 כל ברבע 1 ו 4 ( איור 2 א). השתמש טיפ חדש למקום 1 μL של 10 מ"מ CuCl ₂ פתרון כל ברבעונים 2 ו 3 ( איור 2 א ).
   5. חזור על שלבים 4.8.2-4.8.4 עבור שני לוחות assay אחרים.
9. לאחר טיפות הפתרון כבר נקלטו לחלוטין לתוך אגר, השתמש פיפטה פסטר זכוכית להעביר תולעים שטף מכל צינור microcentrifuge לצלחת assay המקביל.
10. מניחים טיפה של תולעים על כל האזור מעל ומתחת לאזור המעוגל. מקפלים רקמה ארבע פעמים ולהשתמש קצה קהה לספוג חיץ לשטוף עודף על כל לוחות assay.
11. מיד לסדר את שלוש צלחות assay תחת המצלמות מיקרוסקופ בחדר ההתנהגות על ידי יישור המספרים בפינות תבנית. המתן 2-3 דקות כדי לאפשר את התולעים כדי acclimate כדי צלחות assay.
    הערה: ודא שדלת דלת תא ההתנהגות סגורה לפני תחילת הקלטת הווידאו בשלב הבא.
12. לחץ על סמל ההקלטה 'Time-Lapsed Video' בצד שמאל של הזנת המצלמה והזן '10 דקות' למשך פרק זמן ו '1' למשך מרווח כדי להקליט סרטון של 10 דקות במסגרת אחת לשנייה. לחץ על 'התחל' כדי להתחיל להקליט וידאו. לאחר קטעי וידאו נרשמו ונשמרו, להסיר את לוחות assay מן החדר.
13. חזור על שלבים 4.7-4.12 עבור הסיבוב הבא של צלחות assay. רכשו לפחות שישה משכפלים או שני סיבובים של הקלטה עבור כל טיפול או גנוטיפ.

5. הכנה מגיב

1. הכן אגר NGM חיץ.
   1. בקבוק 1 ליטר זכוכית, להוסיף 1.5 גרם של נתרן כלורי, 8.5 גרם של אגר, ו 1.25 גרם של פפטון. מוסיפים 500 מ"ל מים מזוקקים, ומערבבים על הבקבוק. חיטוי בקבוק עם תוכן.
   2. מניחים את הבקבוק על צלחת ומערבבים את הפונקציה ומערבבים.
   3. הוסף לפי שימוש בטכניקה סטרילית: 0.5 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול, 0.5 מ"ל של 1 M סידןכלוריד, 0.5 מ"ל של 1 מגנזיום גופרתי, ו 12.5 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט.
   4. חזור על שלבים 5.1.1 כדי 5.1.2 לעשות חיץ NGM אבל לעזוב את אגר פפטון בשלב 5.1.1.
2. הכינו מרק LB.
   1. בבקבוק זכוכית 1 ליטר, מוסיפים 5 גרם טריפטון, 2.5 גרם של תמצית שמרים, 2.5 גרם של נתרן כלורי, 500 מ"ל של מים מזוקקים, ו 0.5 מ"ל של 1 N נתרן hydroxide. חיטוי בקבוק עם תוכן.
3. הכן חיץ M13.
   1. בקבוק 1 ליטר זכוכית, להוסיף 1.817 גרם של Tris, 2.922 גרם של נתרן כלורי, 0.373 גרם של אשלגן כלורי, ו 500 מ"ל של מים מזוקקים. Autoclave את הבקבוק עם תוכן.
4. הכן נחושת כלוריד (CuCl ₂ ) פתרון.
   1. לשקול את 0.134 גרם של CuCl ₂ . הוסף מומס 10 מ"ל של חיץ M13 בצינור פלסטיק 15 מ"ל לעשות 100 מ"מ CuCl ₂ פתרון המניות. הפוך את צינור פלסטיק עד שכל המומס יש disso.
   2. השתמש מזרק 0.2 מיקרומטר מסנן מיקרומטר לסנן לטהר את הפתרון 100 מ"מ CuCl ₂ לתוך צינור פלסטיק נקי 15 מ"ל.
   3. כדי להפוך את הפתרון 10 מ"מ CuCl ₂ , להוסיף 900 ​​μL של חיץ M13 ו 100 μL של 100 מ"מ CuCl ₂ פתרון המניות לצינור microcentrifuge. הפוך את הצינור microcentrifuge לערבב היטב.

6. ניתוח וידאו

1. הורד את Python 3 (https://www.python.org/downloads/) ואת ספריית התוכנה של OpenCV (http://opencv.org/downloads.html).
2. הורד את שלושת הסקריפטים של Python לניתוח (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   הערה: ודא שכל קבצי הווידאו שישמשו הם בפורמט mp4 לפני שתמשיך.
3. כדי להציג את הפונקציה ואת התיאורים פרמטר, הקלד 'עזרה (הזן שם פונקציה)' במסוף ופגע Enter. לדוגמה, הקלד 'עזרה (כיול)' ולחץ על Enter.
4. הפעל את פונקציית הכיולעם פרמטרים קלט להגדיר את אזורי הווידאו של עניין (החזר ROI).
   1. הזן את שם הקובץ של סרטון הכיול שנלקח בסעיף 4 עבור המשתנה 'mp4filename'. כלול מרכאות בעת הזנת שם הקובץ.
   2. התחל עם הערכים 600 ו- 360 עבור המשתנים 'Q * x' ו- Q * y. * הזן מספרים ברבע 1 עד 4. התחל עם הערך 310 עבור המשתנה 'rad'. התאם את ערכי המשתנים עד שמסכות ה- ROI יתיישרו עם קווי המתאר של הרבע על התבנית.
   3. רשום את המספר הכולל של הפיקסלים בכל החזר ROI שיודפס במסוף עם ביצוע פעולה זו. הזן ערך זה עבור הפרמטר 'ROI_size' בפונקציה preferences_index.
5. בצע את הפונקציה threshold_constant כדי לקבוע את קבוע סף המתאים. להתאים את הערך "קבוע" עד תולעים (לבן) ניתן לראות בבירור ויש רעש מלח ופלפל מינימלי ברקע (שָׁחוֹר).
6. בצע את פונקציית ההעדפה_index כדי ליצור גליון נתונים של csv, אינדקס ההעדפות של הסרטון, וכן את תכונת התפוסה של התולעת הנלווית.
   1. השתמש בערכים 'Q' x ',' Q 'y', 'rad', 'ROI_size' ו- 'קבוע' שנקבעו על פי השלבים 6.4 ו -6.5 כפרמטרים של קלט עבור הפונקציה ההעדפה.
      הערה: עבור כל מסגרת וידאו, הפונקציה ההעדפה_index סופרת את מספר פיקסלים התולעים בכל ROI ומחשבת את אחוז פיקסלים התולעים מתוך המספר הכולל של פיקסלים ROI. לאחר מכן הפונקציה מייצרת ערך אינדקס מועדף עבור כל מסגרת וידאו באמצעות הנוסחה:
      
      הערה: לאחר שהתוכנה ניתחה את כל המסגרות בסרטון, ערך אינדקס מועדף ממוצע נוצר עבור הסרטון. תולעת התולעת העלילה עם המדד העדפה של וידאו מודפס בראש וכן גיליון נתונים csv המכילתולעת פיקסל, אחוז אחוזי התפוסה ערכים, ואת מדד ההעדפה עבור כל מסגרת וידאו יישמרו בתיקייה המיועד לאחר התוכנית סיימה לפעול.

איור 3 א מציג את ערכי מדד ההעדפה המתקבלים עבור גנוטיפ שונים זוגות הטיפול. ערך אינדקס מועדף של 1 מציין נקודת משיכה חזקה לפתרון המוצב בחזר ה- ROI הניסיוני, בעוד שערך מדד ההעדפה של -1 מציין דחייה חזקה. מדד העדפה של 0.02 התקבל כאשר הפתרון M13 חיץ הוצב הן את השליטה ואת ההחזר על ההשקעה ניסיוני, הוכחת כי אין הטיה מרחבית כלפי החזר ההשקעה או. N2 תולעים נמנע מאוד יונים נחושת וכתוצאה מכך מדד ההעדפה של -0.67, אשר מאמת הממצאים הקודמים כי יונים נחושת הם רפלנט חזק ( סרט משלים 1 ) ⁴ . מוטציות אוסמו-3 , אשר חסר מבנה תקין של קטעים דיסטלי של אברי החוש, הראו ירידה משמעותית של יונים נחושת (PI = -0.19) ¹⁵ . Ocr-2 מוטציות, אשר דה (FI = 0.19) ( סרט משלים 2 ) ¹⁶ .

איור 3 ב מציג נציג התופסן תולעים מגרשים, אשר מצביעים על צפיפות של תולעים בשליטה לעומת החזר ROIs ניסיוני לאורך זמן בכל וידאו. ככל שהצבע כהה יותר, כך יגדל מספר הפיקסלים בתולעת החזר ה- ROI. חלקת התפוסה עבור תולעים N2 שטופלו עם חיץ M13 מראים כי מספר התולעים בשני החזרים להשקעה נשאר דומה לאורך כל assay. עם זאת, החלקה התפוסה עבור תולעים N2 מטופלים עם יונים נחושת עולה כי התולעים חזק בעקביות למנוע את ההחזר על ההשקעה ניסיוני לאורך assay.

Gimg "src =" / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg "/>
איור 1: תמונה וייצוג סכמטי של עיצוב התנהגות קאמרית. ( א ) מבט הקדמי של הגדרת החדר קאמרית (משמאל) וייצוג סכמטי המקביל של מסגרת קאמרית (מימין). סדינים פוליאסטר אטומים להקיף את החדר על כל הפרצופים למעט בפנים התחתונה, המאפשרת אור דרך הפנס תאורה אחורית אינפרא אדום. המספרים 1, 2 ו -3 תואמים את שכבות ההבלטה ב (B). ( ב ) סכמטי של תצוגה העליון של שכבות שחול המהווה את מסגרת החדר התנהגות. זה כולל את השכבה העליונה (1), באמצע המצלמה הר הרכבה שכבת (2), ואת השכבה שלב התחתון (3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: תבניות מיקום-מיקום ויישור יישור. ( א ) לתבנית המיקום של פתרון יש ארבעה רבעים וסמני יישור מספרים. פתרון הבקרה ממוקם בצד שמאל העליון התחתון ימין quadrants ואילו הפתרון הניסיוני ממוקם העליון הימני ואת התחתון משמאל quadrants. ( ב ) תבנית יישור צלחת יש רק מספר סמנים יישור כדי למזער חסימה של התולעים בתחום התצוגה במהלך הקלטת וידאו וניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: נתונים לדוגמה שנאספו באמצעות Assay זה. ( A ) ערכי ההעדפה (PI) ערכים עבור wild-type N2 ו מוטציה C. elegans M> בתגובה למאגר M13 ו 10 מ"מ CuCl ₂ . תולעי N2 לא הראו כל העדפה בין בקרה לבין החזר ROI ניסיוני, כאשר פתרון בקרת M13 הושם בשני החזרים להשקעה, אך נמנע מאוד מהחזר ה- ROI הניסויי כאשר יונים נחושת הונחו בו (PI = 0.02 ו- -0.67, בהתאמה). ( מוטציות ) ו -3 ocr -2 ( מוטציות ak47) הראו ירידה משמעותית בהימנעות מיוני נחושת בהשוואה ל- N2 (PI = -0.1 ו -0.2, בהתאמה). N = 6 מבחני כל זיווג טיפול גנוטיפ, 360 תולעים לכל assay, ברים שגיאה מצביעים ± 1 SEM, *** p <0.001, חד כיווני ANOVA ואחריו פוסט הוק הוקרה משמעותי הבדל משמעותי (HSD) הבדיקה. ( ב ) נציג תולעת התפקידים מגרשים עבור N2 תולעים עם חיץ M13 בשני ROIs (למעלה) ו N2 תולעים עם חיץ M13 ב ROI ההשקעה ויונים נחושת ההחזר על ההשקעה ניסיוני (התחתון). סולם הצבעים שמתחת לכל חלקת תפוסה מייצג את מספר פיקסלים התולעים.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט משלים 1: תגובה התנהגותית של תולעים N2 ל 10 מ"מ כלוריד נחושת. תולעים נמשכים לרבעי הבקרה עם חיץ M13 (שמאל עליון וימני תחתון), אך נמנעים מאוד מהרבעים המכילים יונים נחושת מומסים במאגר M13 (ימין עליון ותחתון משמאל). וידאו הוקלט ב 1 מסגרת לשנייה ו sped up 15x. לחץ כאן להורדת הקובץ.

סרט משלים 2: תגובה התנהגותית של ocr-2 (ak47) תולעים 10 מ"מ כלוריד נחושת. תולעים לשוטט במידה שווה בערך בשני הרביעים שליטה עם חיץ M13 (השמאלי העליון והתחתון מימין) ואת הרבעS המכיל יונים נחושת מומס במאגר M13 (השמאלית העליונה והתחתית השמאלית) לאורך משך ההקלטה. מוטציות התערוכה עדיפות קלה עבור הרביעים המכילים יונים נחושת בתחילת ההקלטה. וידאו הוקלט ב 1 מסגרת לשנייה ו sped up 15x. לחץ כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים: פתרון-מיקום ויישור תבניות יישור. לחץ כאן להורדת הקובץ.

צעד קריטי בפרוטוקול הוא להבטיח כי צלחות assay יש רמה עקבית של יובש על פני ימים ניסיוניים שונים. רמות יובש שונות יגרמו לשיעורי דיפוזיה שונים של הפתרון לתוך אגר וכתוצאה מכך, שינויים בתוצאות ההתנהגותיות. לפיכך, צלחות assay תמיד צריך להיות טרי על אחר הצהריים לפני ניסויים. מספר תולעים נבדק לכל assay צריך גם להיות מוסדר עבור הקלות השוואה בין טיפולים. עבור התייחסות, תולעת wild-type מטילה 4-10 ביצים / h על התשואה הממוצע> 360 תולעים לכל assay אם פרוטוקול סינכרון תולעת לעיל הוא אחריו ¹⁷ . אם זנים מסוימים מוטציה הם ביצים הנחת פגום, לבחור יותר תולעים מבוגר גרב לביצה להטיל להגיע למספר היעד של הצאצאים. צעד חשוב נוסף בפרוטוקול הוא לטפל בתולעים בעדינות במהלך תהליך הכביסה ותולעת. תולעים רגישות לגירויים מכניים, אשר מעוררים תגובות מתח כגון היפוך מעכבי ביצים ¹⁸ . יתר על כן, יש להקפיד להגדיר את ההחזר על ההשקעה במדויק ולקבוע את הערך האופטימלי סף קבוע עבור תנאי תאורה ספציפיים לפני שתמשיך עם ניתוח וידאו. כמו כן, מומלץ לחזור על תהליך הכיול ותהליך הסף אם חלף פרק זמן ממושך מאז הפעלת הניסוי האחרון.

מגבלה של שיטה זו היא כי היא אינה מתאימה assaying תולעים קטנות אוכלוסיות. עם זאת, אם הבקרות המתאימות כדי לקבוע את ההשפעה של נוכחות של מזון על התנהגות חושית מבוצעות, ולאחר מכן ניצול מזון כדי להגביל את המיקום הגלישה מרחבית תולעים כמו assay השמירה אפשרי גם עם ההתקנה הזו. בנוסף, שיטה זו אינה מיועדת ללימוד ניווט גירויים גירוי בשל הקרבה ואת כמויות קטנות של שליטה וטיפות פתרון ניסיוני בשימוש.

למחברים אין מה לגלות.

כמה זנים סופקו על ידי המרכז הגנטיקה Caenorhabditis (CGC), אשר ממומן על ידי NIH משרד תוכניות מחקר מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכת על ידי הווארד יוז רפואי המכון, שבו PWS הוא חוקר.