aşılanması

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

immün yanıtın uyarılması etkinliğini ve bağışıklık mekanizmaları incelemek için omurgasız çalışmalarda ortak bir araçtır. parçacıklar, bağışıklık sistemi tarafından algılanır ve immün efektör üretimini teşvik edecek şekilde Bu uyarım, böceklerin içine patojenik olmayan partiküllerin enjekte dayanır. Biz sivrisinek Anopheles gambiae içinde melanizm tepkisinin uyarılması burada odaklanır. Melanin koyu bir tabaka ile yabancı partiküllerin ve parazitlerin kapsül içinde melanizm yanıt sonuçları. Bu yanıtı uyarmak için, sivrisinek microcapillary cam tüpler kullanılarak göğüs boşluğunda boncuk ile aşılanır. Daha sonra, 24 saat sonra, sivrisinekler boncuk almak için kesilir. tanenin melanization derecesi görüntü analizi yazılımı kullanılarak ölçülür. Boncuk parazitlerin patojenik etkileri yoktur, ya da kapasite kaçınmak veya immün yanıtı bastırmak için. Bu enjeksiyonlar measu bir yoludurBağışıklık etkinlik ve doğurganlık veya uzun ömürlü gibi diğer yaşam öyküsü özellikleri, immün uyarıların etkisiyle yeniden. Tam doğrudan konak-parazit etkileşimleri inceleyerek aynı değildir, ama bağışıklık ve evrimsel ekoloji incelemek için ilginç bir araçtır.

Kendi manikür ya da orta bağırsak epiteli ⁴ kırmayı ^{3 -} Böcekler parazit ve patojenler ¹ karşı kendilerini korumak için bağışıklık yanıtları güveniyor. Sivrisinekler, bu tepkiler bakteriler ^5, virüs ^6, filarial nematod ⁷ ve sıtma parazitleri ^1,8,9 karşı etkilidir. ^{12 -} sivrisinekler, önemli bir immün yanıt melanin ¹⁰ yabancı parçacıkların kapsülleme olduğunu. ^{12 -} Bu kapsülleme midgut veya sistem ¹⁰ dolaşan hemolimf meydana gelebilir. Bu melanizm yanıtı ön-fenoloksidaz sonucu ¹⁰ kaskad olduğu ^{- 12} ve parazit ölümüne veya fagositoz yol açabilir. Hemocytes hücrelerin sayısı sınırlıdır yetişkin sivrisinek, olarak, melanizm Plasmodium parazitler veya filarial nematod ⁷ karşı gibi bir humoral tepki vardır.Diğer bazı böcekler, bu doğrudan ⁷ melanize için parazitin etrafında toplanıp hemocytes hücredir. Ayrıca melanin da yumurta üretimi ve manikür yaralar ⁷ şifa gibi birçok fizyolojik süreç için gereklidir.

^{18 -} immün yanıtın uyarılması çeşitli tarım ve halk sağlığı modeli sistemlerinde ¹³ böcek bağışıklık incelemek için bir araç olarak kullanılır. ^{16,19 -} konak-parazit etkileşimleri ¹⁴ çalışmak için Anopheles içinde gambiae sivrisinek, Afrika'da sıtma büyük vektör kullanılır. Bu teknikler kendi örüntü tanıma reseptörleri (PRR) ² ile parazit tespit böceklerin kapasitesine dayanmaktadır. Sivrisinekler ayrıca patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) olarak biyoloji ile müdahale diğer molekülleri tespit veya kolajen ve nükleik asitlerin serbest bırakılması nedeniyle kendi hasarlı hücreleri tespit edebilir. Sivrisinek bağışıklık hücresi^{23 -} Bu hemocytes olarak s Tespit ²⁰ kullanılmaktadır. Ana bağışıklık sinyal yolları vardır IMD, Toll, JAK / STAT ²⁴ ve ribonükleik asit enterferans (RNAi) ^25,26. Toll ve IMD yollar Hem melanizm yanıtını etkileyen ve pro-fenoloksidaz ile etkileşim ¹⁰ kaskad ^{- 12.}

melanizm yanıtını uyarmak için kullanılan standart bir araç göğüs boşluğunun hemolimf içine küçük bir boncuk ile bir sivrisinek aşılama olduğunu. Melanin kapsülleme derecesi daha sonra sivrisinek diseksiyon ile boncuk aldıktan sonra ¹⁹ ölçülebilir. Birçok çalışmada, tek bir kordon sivrisinek ^15,16,27 başına enjekte edilmiştir, ancak daha fazla boncuk enjekte melanizm yanıtı ¹⁹ sınırlarını incelemek için mümkündür. Bu boncuklar sivrisinek fizyolojisi rahatsızlık sınırlamak için bir enjeksiyon çözeltisi (serum fizyolojik) kullanılarak enjekte edilir vesivrisinek ^15,16,27 kurutulması. Bir boya boncuk seçimi kolaylaştırmak için bu çözeltiye ilave edilir. Bu boncuk ^15,16,27 almak için kullanılan disseksiyon çözeltisi için aynıdır.

Patojenik olmayan uyaranlara böcekleri aşılamak avantajı immün yanıt üzerinde doğrudan etkisi odaklanmak yeteneğidir. ³¹ ya da bağışıklık kaçırma ^{- 31 - 34} sebebiyle parazit patojenite ²⁸ immünsupresyonun ²⁹ hiçbir komplike etkileri vardır. Ayrıca, bu tür uzun ömürlü ya da doğurganlık gibi diğer yaşam öyküsü özellikleri üzerinde uyarıların sonuçları da ele alınabilir. Böylece, evrimsel ekoloji okuyan araştırmacılar bu tür araçları ^2,35,36 gerektirebilir. Örneğin, bağışıklık meydan bombus arıları açlık altında kısaltılmış ömre sahiptir. Bağışıklık uyarılara ve dağıtımları Benzer olumsuz etkileri genellikle kısa sonuçlanan farklı omurgasız modellerin gözlenmiştirer ömrü ya da daha az üreme başarısı ^13,27,37. Bu tür çalışmalar, değişen ortamlarda ^2,4,38 gerçekleştirilebilir. Bağışıklık uyarıcı da İmmünopatolojiye ^39,40 doğrudan odaklanan olanlara ilgi çekicidir.

Bu protokol, melanizm yanıtı uyarmak ve doğrudan melanin miktarını ölçmek için sivrisinek ile boncukların aşılama dayanır. Bu, farklı deneysel ortamlarda melanizm yanıtı nicel ve nitel çalışma sağlar. Böyle bir araç, bu tür antibakteriyel yanıt olarak diğer bağışıklık tepkilerinin uyarılması için uzatılabilir bakteriler ⁴¹ ısı ile öldürdü. Aynı zamanda pek çok ekolojik ortamlarda yapılabilir.

Enjeksiyon ve Diseksiyon 1. Tuzlu Çözüm

1. PH = 6.8 de 1.3 mM NaCI, 0.5 mM KCI, 0.2 mM _CaCl2 elde etmek üzere distile su NaCl, KCl, _ve CaCl2 eklenerek tuz çözeltisi hazırlayın.
2. Şeffaf boncuk renk tuz çözeltisi için 99 mililitre% 0.1 metil yeşil çözelti 1 ml. Bu% 0.001 metil yeşil "enjeksiyon çözüm" dir.
3. Daha sonra, tuzlu su çözeltisi, 45 ml% 0.1 metil yeşil çözelti 5 ml. Bu% 0.01 metil yeşil "diseksiyon çözüm" Diseksiyon sırasında boncuk renklerini ve gözlem kolaylaştırmak için 10 kat daha fazla konsantre metil yeşil olduğunu.
   NOT: Gerekirse Filtre tampon sterilize edin.

2. Kılcal Hazırlık

1. Isı çekme microcapillary cam tüpler küçük boncuklar (φ = 40 um) ⁴² biraz daha büyük bir çok ince bir ipucu elde etmek için.
2. Açık veCımbız ile ucu kırarak ya da ucu kapalı testere ile her kılcal djust.

3. Sivrisinek Yetiştirme

1. 26 ± 1 ° C'de arka A. gambiae, 70 ±% 5 bağıl nem ve 12:12 saat ışık: karanlık döngüsü. yetişkin kadın tutmak ve onlara% 10 şeker çözeltisi erişim sağlar.

Kapiller 4. Boncuk Seçimleri

1. 5 santimetrelik bir petri tabağına negatif yüklü boncuklar (çapı 40-120 um) ve 0.009 g dökün ve önceden enjeksiyon çözeltisi, 30 dakika içinde 5 mL.
   NOT: amaç boya kolay enjeksiyon için boncuk seçim yapmak için boncuk renk izin vermektir. onlar steril kavanoz gelmediği takdirde boncuk otoklavlayın.
2. Bir kılcal pipet ampul monte edilmiş bir kılcal kullanarak, görsel bir binoküler mikroskop altında tuzlu su çözeltisi 0.1 ul küçük boncuk seçin.
   NOT: Aynı anda birden fazla boncuk aşılamak zaman 0.1 ul toplam hacmi üç boncuk seçin.

5. Sivrisinek Taşıma ve Aşılama

1. Bir böcek aspiratör kullanılarak, 50 ml bir tüp içinde, her sivrisinek yerleştirin.
2. ezilmiş buz (2-5 dk) tüp koyarak kısaca her sivrisinek Chill.
3. binoküler mikroskop altında sağ tarafta bir sivrisinek yerleştirin.
4. Bir stereomikroskop altında, sıkıca göğüs boşluğu manikür sol tarafında delip ardından sıvı ve boncuk enjekte ederek kılcal sivrisinek aşılamak.
   NOT: mümkün olduğunca sivrisinek olarak dik kılcal tutarak uçuş kaslarının zarar vermemeye özen gösterin.
5. kılcal çıkarın.
6. tüy entomoloji forseps kullanarak, ayrı ayrı sivrisinek örgü ile kaplı bir 180 ml'lik plastik bir kap içinde her kadın yerleştirin; Onlara% 10 şeker çözeltisi erişim sağlar.
   NOT: sivrisinek şeker çözeltisi damla takılıyorum olabilir Dikkat, şeker çözeltisi ile gereklidir.

6. SivrisinekDiseksiyon ve Boncuk Fotoğrafçılık

1. Sivrisinekler 24 saat aşılamadan sonra hayatta olup olmadığını kontrol edin. Eğer öyleyse, onların durumunu kontrol ve uçabiliyor sadece sivrisinek tutmak.
2. -20 ° C'de bu sivrisinek dondurun.
   NOT: Gerekirse Onlar diseksiyon aylar önce birkaç gün muhafaza edilebilir.
3. 32X büyütmede bir binoküler mikroskop altında cımbız kullanarak sivrisineklerin kanatları kaldırın. saydam bant ile cam slaytlar üzerine kanatlarını sabitleyin. her sivrisinek için kullanılan kodunu yazın.
4. Bir tarayıcı cam slaytlar koyun ve 1.200 dpi onları tarayın.
   Not: kod her sivrisinek için okunabilir olup olmadığını kontrol edin.
5. cam bir mikroskop lamı üzerine ve diseksiyon çözeltisi içinde, baş ve karın toraks ayırmak için forseps kullanabilir.
6. boncuk almak için forseps ile toraks açın.
   NOT: Boncuk karın hareket etmiyor, birbirleri ile temas halinde değildir ve çoğu t serbestçe yüzenO Hemolimf. olmayan bir melanized boncuk bulmak zor olabileceğinden, forseps ile boncuk kırmak için değil dikkatli olun. Boncuklar rengi elde etmek için 1 ilâ 5 dakika bekleyin.
7. resmi çekmeden önce, bir cam mikroskop lamı üzerine diseksiyon çözümün bir damlacık boncuk aktarın.
   NOT: boncuk yıkamak gerek yok.
8. Bir kamera ile donatılmış bir mikroskop kullanarak, standart bir aydınlatma ayarı ve 400X büyütmede her boncuk bir dijital görüntü almak.
   NOT: kendi karşılaştırma yapabilmek için farklı resim arasındaki aydınlatma değiştirmeyin.

7. Resim Analizi: Boncuk melanization

1. Görüntü analiz yazılımı açın. "Dosyasında" üzerine tıklayın ve ardından "açık" bir boncuk görüntüyü bulmak için.
2. Tıklayın "analiz edin." Tıklayın "set ölçümlerin." "Set ölçümler" penceresinde "gri ortalama değer" kutusunu işaretleyin.
3. daire seçim aracı simgesini tıklayın. boncuk çevresini seçin; kalırboncuk yan ve çevresinde aydınlık halo kaçının.
4. "Analiz" menüsünü tıklayın. Tıklayın "tedbir." boncuk enine kesit alanının ortalama gri değer ve boyutunu elde edilir.
   1. "- Gri değerini ortalama 256.": Her boncuk melanizm değerini elde etmek için, bir hesap makinesi veya hesap yazılımını kullanarak aşağıdaki işlemi gerçekleştirmek melanizm tedbir 0 tamamen beyaz bir görüntü temsil eden, 0 ile 256 arasında bir değerdir.

Bazı boncuk diğerlerinden daha az melanin (Şekil 1) ile kaplandı sivrisineklerin aynı şekilde boncuklar melanize tüm yoktu. Gerçekten de, bazı boncuklar (Şekil 1), diğerleri tamamen karanlık oysa, çünkü melanization eksikliği mavi kalmıştır. Melanizm değeri (mavi ve unmelanized boncuğa karşılık), 0 ile 100 (koyu ve ağır melanized boncuğa karşılık gelir) (Şekil 2a ve 2b) arasında bir değere doğrusal interpolasyon tarafından standartlaştırılmıştır. Bu değerler, bu şekilde boncukların melanization derecesine ve bağışıklık tepkisinin gücünü gösterir.

Biz onların melanizm değerlerini karşılaştırarak birbirlerine boncuk karşılaştırabilirsiniz. melanizm tepkisi genellikle ANOVA veya Gauss GLM gibi klasik istatistiksel analizler sağlayan bir Gauss dağılımı, izler.

Boncuk sayısı (F ŞEKIL 2) artmış inoküle zaman ortalama boncuk melanizm değeri 50 71 düşmüştür. Bağışıklık meydan artıran bir sivrisinek melanizm yanıt bazı sınırlar vardır. Ayrıca, melanizm tepkisi, sırasıyla bir ile üç arasında boncuk 35 71, her bir sivrisinek en az melanized boncuk azalmıştır. Ancak, en güçlü melanized boncuk melanizm değeri yaklaşık sabit kaldı. melanization değişkenliği tanelerin sayısı ile artar. melanizm çaba, belirli bir sivrisineğin tüm boncuklar arasında üniforma değildibir boncuk diğerleri üzerinde öncelikli olduğu gibi. Bu enjeksiyon tekniği sivrisinek bağışıklık tepkilerinin değişkenliği incelemek için yararlı olan.

Şekil 1: olmayan bir melanized resmi örnekleri, kısmen melanized ve son derece melanized boncuk diseksiyonu sonra. sol, orta ve sağ tarafta sırasıyla olmayan bir melanized boncuk, kısmen melanized boncuk ve bir çok melanized boncuk vardır.

Şekil 2: aşılanmış tanelerin sayısının bir fonksiyonu olarak boncuk melanizm. (A) Her bir nokta (ağır melanized olanlar için 100 olmayan melanized boncuklar için 0 kadar melanizm değerleri ile) tek bir kordon ve puan her bir sütunun melanization gösteren tek bir sivrisinek temsil etmektedir. Her mosquito bir, iki ya da üç boncuklar ile aşılandı. Katı noktaları, çapraz noktalar ara melanizm değeri temsil sivrisinek başına en yüksek melanizm değerini temsil eder ve boş noktalar düşük melanizm değeri temsil eder. düz çizgiler ortalama melanizm başına boncuk tedavisi temsil kesik çizgiler en yüksek melanization ortalamasını gösterir, ve noktalı çizgiler düşük melanization ortalamasını gösterir. (B) Ortalama ve melanization, en yüksek melanization ve boncuk aşılama tedavisi başına en düşük melanization standart hata. Black (ağır melanized olanlar için 100 olmayan melanized boncuklar için 0 kadar melanizm değerleri ile) boncuk sayısının bir fonksiyonu olarak ortalama boncuk melanization temsil etmektedir. kırmızı nokta yüksek melanization ortalamasını temsil etmektedir. mavi üçgen düşük melanization ortalamasını temsil etmektedir. çubukları standart hatalardır. Referans ¹⁹ modifiye.

Bu enjeksiyon tekniği teşvik ve sivrisinek melanizm tepkisini incelemek için yararlıdır. Örneğin, burada bağışıklık uyaranlar yükün etkisi incelenmiştir.

Bu prosedürde kritik adım düzgün sivrisinek aşılamak etmektir. Uçuş kaslara veya sivrisinek kendisine herhangi bir aşırı hasar besleme gelen sivrisinek önleyebilir veya diseksiyonu önce öldürebilir. İkinci önemli bir adım onları öldürmeden onları dışarı vurmak için yeterince uzun buz üzerinde sivrisinek tutmaktır. Küçük bir kap kolaylaştırmak ve buz ile daha yakın temas sağlayan olarak, süreci hızlandırmak olacaktır. cımbız, aksi takdirde boncuk kırılabilir Son olarak, özel bakım, diseksiyon sırasında ihtiyaç vardır. daha uzun sürebilir sivrisinek dokusunda gömülü Boncuk diseksiyon çözümünün renkli edilecek.

onlar m olarak (gibi nötr, pozitif veya negatif yüklü boncuklar veya cam boncuklar), farklı sonuçlara yol açacaktır boncuk birden türlü kullanmaAy aynı derecede ^27,43 için melanized değildir. Nitekim, nötr yüklü boncuklar ile karşılaştırıldığında, negatif yüklü boncuklar sivrisinekler ²⁷ arasında melanizm yanıt daha değişkenlik yol açar. Cam boncuklar, diğer taraftan, sivrisinek atıl olan ve ²⁷ ° melanizm yanıt tetiklemezler. Negatif yüklü taneler bu şekilde tercih edilebilir, ancak farklı halkalar arasında karşılaştırmalar da ilgili olabilir. Ancak, kordonun türüne bağlı olarak, farklı boya püskürtme ve diseksiyon çözümü için gerekli olabilir; cam boncuklar ²⁷ kullanıldığında, örneğin, kresil violet boyası yerine, metil yeşili kullanılmalıdır.

Bu enjeksiyon tekniği sivrisinek için invaziv. hasar ve yaralanma minimize ve kontrol edilebilir olsa bile, alternatif araçlar deneysel tasarım bağlı daha iyi bir seçenek olabilir. Aynı sivrisinek çeşitli immün yanıtları teşvik eden ve aynı zamanda ölçülmesi zordur. İşimmün yanıtların ²⁸ arasındaki korelasyon bakarken aile ya da sivrisinek grupları üzerinde ing gerekmektedir. Bunun yanı sıra, taneler, sadece bir böcek parazitlerin fiili varlığı kısmen benzerdir.

İlk olarak, bağışıklık tepkisi uyarılır ve daha sonra elde edilen fenotipik yanıt kapsülleme ölçülür, ama arasında olur bilinmemektedir. Fizyolojik veya moleküler araçlar ¹⁰ ile enjeksiyonları Kaplin ^{- 12} Bu melanizm yanıt anlayışımızı artırabilir. ^{12 -} melanizm tepkisinin altında yatan mekanizmaları incelemek için, anahtar enzimleri ya da ön-fenoloksidaz kaskad sırasında üretilen moleküllerin ifadesi ¹⁰ ölçülebilir. Ancak, nihai kapsülleme gerçek sonuçları bilmeden, Yukarı veya aşağı ayarlanmasını bu tür moleküllerin sadece odaklama, melanizm sürecinin doğru değerlendirilmesine neden olabilir. Bu nedenle, eğitim ENCApsulation ve birlikte moleküler mekanizmalar ayrı ayrı kullanıldığında her bir geçerli bilimsel teknik olmasına rağmen, son derece bilgilendirici olacaktır.

Sonuç olarak, bu bağışıklık ve bağışıklığın evrimini incelemek için bir tekniktir. sıtma parazitlerinin insektisit direnci ve sivrisinek hassasiyeti arasında bir bağlantı elde edilen kanıtlar, örneğin vardır. Bu enjeksiyon tekniği alan denemelerinde hem de böyle bir bağlamda kullanılabilir. İkinci çalışma yönü detaylı olarak bağışıklık yolları incelemek için gen knockdowns ile bağışıklık uyarımı birleştirmek olacaktır.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.