inoculando

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

La stimolazione della risposta immunitaria è un attrezzo comune negli studi invertebrati per esaminare l'efficacia ei meccanismi di immunità. Questa stimolazione è basato sull'iniezione di particelle non patogeni in insetti, come le particelle vengono rilevati dal sistema immunitario e indurrà la produzione di effettori immunitari. Ci concentriamo qui sulla stimolazione della risposta melanizzazione nella zanzara Anopheles gambiae. I risultati di risposta melanizzazione nel incapsulamento di particelle estranee e parassiti con uno strato scuro di melanina. Per stimolare questa risposta, le zanzare vengono inoculati con perline all'interno della cassa toracica utilizzando tubi di vetro microcapillari. Poi, dopo 24 ore, le zanzare sono sezionati per recuperare le perline. Il grado di melanizzazione del cordone viene misurata utilizzando il software di analisi delle immagini. Beads non hanno gli effetti patogeni di parassiti, o la loro capacità di eludere o sopprimere la risposta immunitaria. Queste iniezioni sono un modo per misure efficacia immunitario e l'impatto della stimolazione del sistema immunitario su altri tratti della storia di vita, come ad esempio la fecondità e la longevità. Non è esattamente lo stesso di studiare direttamente le interazioni ospite-parassita, ma è uno strumento interessante per studiare l'immunità e la sua ecologia evolutiva.

Gli insetti si basano su risposte immunitarie per proteggersi contro i parassiti e patogeni ^{1 - 3} che violano attraverso la loro cuticola o il loro midgut dell'epitelio ^4. In zanzare, queste risposte sono efficaci contro i batteri, virus ^{5 6,} nematodi filarial ^7, e parassiti della malaria ^1,8,9. In zanzare, una risposta immunitaria chiave è l'incapsulamento di corpi estranei con la melanina ^{10 - 12.} Questo incapsulamento può accadere nel midgut o in emolinfa sistema di circolazione ^{10 - 12.} Questa risposta melanizzazione è il risultato del pro-phenoloxidase cascata ^{10 - 12,} e può portare alla morte dei parassiti o alla loro fagocitosi. In zanzare adulte, in cui viene limitato il numero di cellule ematociti concentrati, melanizzazione è una risposta umorale, come contro i parassiti Plasmodium o nematodi filarial ^7.In alcuni altri insetti, è direttamente le cellule hemocytes che si riuniscono intorno al parassita di melanize loro ^7. Inoltre, la melanina è essenziale anche per molti altri processi fisiologici come la produzione di uova e ferite cuticola guarigione ^7.

La stimolazione della risposta immunitaria è utilizzato come strumento per studiare l'immunità insetto in diversi sistemi modello sanità pubblica agricola e ^{13 - 18.} E 'utilizzato in Anopheles gambiae zanzare, il principale vettore della malaria in Africa, per studiare le interazioni ospite-parassita ^{14 - 16,19.} Queste tecniche si basano sulla capacità di insetti per individuare parassiti con i loro recettori pattern recognition (PRR) ^2. Le zanzare possono anche rilevare altre molecole che interferiscono con la loro biologia come modelli molecolari associati ai patogeni (PAMPs), o rilevare le proprie cellule danneggiate a causa del rilascio di collagene ed acidi nucleici. La cellula immunitaria della zanzaras quali gli emociti sono utilizzati per la rilevazione ^{20 - 23.} Le principali vie di segnalazione immunitario sono Imd, Toll, JAK / STAT ^24, e l'interferenza acido ribonucleico (RNAi) ^25,26. Sia Toll e percorsi IMD influenzano la risposta melanizzazione e interagiscono con il pro-phenoloxidase cascata ^{10 - 12.}

Lo strumento standard utilizzato per stimolare la risposta melanizzazione è l'inoculazione di una zanzara con un piccolo tallone nel emolinfa della cavità toracica. Il grado di melanina incapsulamento può quindi essere misurato ¹⁹ dopo aver ottenuto il tallone attraverso la dissezione della zanzara. Nella maggior parte degli studi, solo una perlina stato iniettato per zanzare ^15,16,27, ma iniettando più perline è possibile al fine di studiare i limiti della risposta melanizzazione ^19. Queste perle sono iniettati con una soluzione iniettabile (fisiologica) per ridurre i disturbi della fisiologia e zanzarel'essiccazione della zanzara ^15,16,27. Un colorante viene aggiunto a questa soluzione per facilitare la selezione tallone. È lo stesso per la soluzione dissezione utilizzato per recuperare il ^15,16,27 tallone.

Il vantaggio di inoculare insetti con stimoli non patogeno è la capacità di mettere a fuoco l'effetto diretto sulla risposta immunitaria. Non ci sono effetti di complicazione a causa di parassiti patogenicità ^28, immunosoppressione ^{29 - 31,} o l'evasione immune ^{31 - 34.} Inoltre, le conseguenze delle stimolazioni su altri tratti della storia di vita, come la longevità o la fecondità, possono anche essere studiati. Così, i ricercatori che studiano l'ecologia evolutiva possono richiedere tali strumenti ^2,35,36. Ad esempio, i bombi immuno-sfidato hanno una durata di vita ridotta sotto fame. effetti negativi simili di stimolazione del sistema immunitario e le implementazioni sono state osservate in diversi modelli di invertebrati, spesso con conseguente breveer la durata della vita o il successo riproduttivo meno ^13,27,37. Tali studi possono essere condotti in diversi ambienti ^2,4,38. Stimolare l'immunità è anche di interesse per coloro concentrarsi direttamente su immunopatologia ^39,40.

Questo protocollo si basa sulla inoculazione di perline con zanzare per stimolare la risposta melanizzazione e direttamente misurare la quantità di melanina. In questo modo lo studio quantitativo e qualitativo della risposta melanizzazione in contesti diversi sperimentali. Tale strumento può essere esteso alla stimolazione di altre risposte immunitarie, come la risposta antibatterico per batteri ⁴¹ termicamente uccisi. Può anche essere condotta in molti ambienti ecologici.

1. soluzione salina per l'iniezione e la dissezione

1. Preparare la soluzione salina aggiungendo NaCl, KCl, e CaCl ₂ per acqua distillata per ottenere 1,3 mM NaCl, 0,5 mM KCl, e 0,2 mM CaCl ₂ a pH = 6,8.
2. Aggiungere 1 ml di 0,1% di metil soluzione verde a 99 ml della soluzione salina per colorare le perle trasparenti. Questo è il metile verde "soluzione per l'iniezione" 0,001%.
3. Quindi, aggiungere 5 ml di 0,1% di metil soluzione verde a 45 ml di soluzione salina. Questa metil verde "soluzione dissezione" 0,01% è 10 volte più concentrato in verde metile per facilitare la colorazione delle perle e la loro osservazione durante la dissezione.
   NOTA: Filtro sterilizzare il buffer se necessario.

2. capillare Preparazione

1. Tubi di vetro microcapillare Calore-pull per ottenere una finissima punta leggermente più grande delle piccole perle (φ = 40 micron) ^42.
2. Aprire e unEGOLARE ogni capillare rompendo la punta con una pinzetta o segando la punta.

3. Mosquito allevamento

1. Posteriore A. gambiae a 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% di umidità relativa, e una luce 12:12 hr: ciclo scuro. Mantenere femmine adulte e dare loro l'accesso a una soluzione zuccherina al 10%.

4. Le selezioni Bead con la capillare

1. Versare 0,009 g di perle di carica negativa (40-120 micron di diametro) in una capsula di 5 centimetri di Petri e aggiungere 5 ml di soluzione iniettabile di 30 minuti in anticipo.
   NOTA: L'obiettivo è quello di lasciare il colorante colore le perline per effettuare la selezione tallone per l'iniezione più facile. Autoclave le perle se non sono disponibili in un barattolo sterile.
2. Utilizzando un capillare montato in un bulbo capillare pipetta, selezionare visivamente il più piccolo tallone in 0,1 ml di soluzione salina al microscopio binoculare.
   NOTA: quando inoculando varie perline contemporaneamente, selezionare tre perle da un volume totale di 0,1 ml.

5. Manipolazione Mosquito e inoculazione

1. Utilizzando un aspiratore insetto, inserire ogni zanzara in un tubo da 50 ml.
2. Raffreddare ogni zanzara brevemente ponendo la provetta in ghiaccio tritato (2-5 min).
3. Inserire una zanzara sul lato destro al microscopio binoculare.
4. Sotto uno stereomicroscopio, inoculare la zanzara con il capillare saldamente forando il lato sinistro della cuticola cavità toracica e poi iniettato il liquido e il tallone.
   NOTA: Fare attenzione a non danneggiare i muscoli del volo tenendo il capillare come perpendicolarmente alla zanzara possibile.
5. Rimuovere il capillare.
6. Utilizzando pinze entomologia piuma, posizionare ogni femmina singolarmente in un bicchiere di plastica 180 ml coperta con zanzariere; dare loro accesso a una soluzione di zucchero 10%.
   NOTA: E 'necessaria cautela con la soluzione di zucchero, come la zanzara può rimanere bloccati sulle gocce di soluzione di zucchero.

6. MosquitoDissezione e Fotografia Bead

1. Verificare che le zanzare sono vivi 24 ore dopo l'inoculazione. Se è così, controllare la loro condizione e mantenere solo le zanzare che sono in grado di volare.
2. Congelare queste zanzare a -20 ° C.
   NOTA: Possono essere conservate per diversi giorni o mesi prima della dissezione, se necessario.
3. Rimuovere le ali delle zanzare utilizzando pinzette sotto un microscopio binoculare a 32X di ingrandimento. Fissare le ali su vetrini con nastro adesivo trasparente. Annotare il codice utilizzato per ogni singolo zanzara.
4. Mettere i vetrini in uno scanner e la scansione a 1.200 dpi.
   NOTA: Verificare che il codice è leggibile per ogni singolo zanzara.
5. Su un vetrino per microscopio e in soluzione dissezione, utilizzare pinze per separare il torace dalla testa e l'addome.
6. Aprire il torace con una pinza per recuperare le perline.
   NOTA: Beads che non si muovono all'addome, non sono in contatto tra di loro e la maggior parte di essi galleggiare liberamente in tegli Emolinfa. Fare attenzione a non rompere il tallone con le pinze, come una perla non melanized può essere difficile da trovare. Attendere da 1 a 5 minuti per perline per ottenere il colore.
7. Trasferire le perle in una goccia di soluzione di dissezione su un vetrino da microscopio in vetro, prima di scattare la foto.
   NOTA: Non c'è bisogno di lavare le perline.
8. Utilizzando un microscopio dotato di una fotocamera, scattare una immagine digitale di ciascuna sfera in un ambiente illuminazione standard e l'ingrandimento 400X.
   NOTA: Non modificare l'illuminazione tra le diverse immagini per consentire loro confronto.

7. Analisi Immagine: Bead melanizzazione

1. Aprire il software di analisi delle immagini. Fare clic su "File" e poi su "Apri" per trovare un'immagine tallone.
2. Clicca su "analizzare". Clicca su "misure fissate." Barrare la casella "valore medio grigia" nella finestra "misure fissate".
3. Fare clic sull'icona dello strumento selezione cerchio. Selezionare il perimetro tallone; rimanere inlato del tallone e di evitare la alone luminoso intorno.
4. Fare clic sul menu "analizzare". Clicca su "misura". Ottenere il valore di grigio medio e le dimensioni della sezione trasversale del cordone.
   1. Per ottenere il valore melanizzazione di ciascuna sfera, eseguire la seguente operazione utilizzando una calcolatrice o un calcolatore software: "256 - valore medio grigio." La misura melanizzazione è un valore compreso tra 0 e 256, con 0 che rappresenta un'immagine completamente bianca.

Zanzare non tutti hanno melanize le sfere nello stesso modo, come alcuni perle sono state coperte con meno melanina di altri (Figura 1). Infatti, alcune perle rimaste blu a causa di una mancanza di melanizzazione, mentre altri sono stati completamente scuro (Figura 1). Il valore melanizzazione stato standardizzato mediante interpolazione lineare per un valore compreso tra 0 (che corrisponde ad un cordone blu e unmelanized) e 100 (corrispondente ad una perlina scuro e fortemente melanized) (Figura 2a e 2b). Questi valori indicano il grado di melanizzazione delle perle e quindi, la forza della risposta immunitaria.

Possiamo confrontare perline gli uni agli altri, confrontando i loro valori melanizzazione. La risposta melanizzazione generalmente segue una distribuzione gaussiana, che consente analisi statistiche classici come ANOVA o glm gaussiana.

Il valore medio tallone melanizzazione diminuito 71-50 quando il numero di perline inoculato aumentato (F IGURA 2). Ci sono alcuni limiti della risposta melanizzazione in una zanzara quando la sfida immunitario aumenta. Inoltre, la risposta melanizzazione diminuita per il tallone meno melanized in ogni zanzara riguardava il 71 al 35 in uno a tre branelli rispettivamente. Tuttavia, il valore melanizzazione del tallone più fortemente melanized rimasto sulla costante. La variabilità di melanizzazione aumenta con il numero di sfere. Lo sforzo melanizzazione non è stato uniforme tra tutte le perle in un dato zanzara,come un tallone è stata la priorità sugli altri. Questa tecnica di iniezione è utile per studiare la variabilità delle risposte immunitarie in zanzare.

Figura 1: esempi immagine di un non-melanized, una parte melanized, e una perlina altamente melanized dopo la dissezione. A sinistra, centro e destra sono una perlina non melanized, un cordone parzialmente melanized, e una perlina altamente melanized, rispettivamente.

Figura 2: melanizzazione branello in funzione del numero di perline inoculate. (A) Ogni punto mostra la melanizzazione di un unico tallone (con valori che vanno da 0 melanizzazione per perline non melanized a 100 per quelli pesantemente melanized) e ogni colonna di punti rappresentano una zanzara individuale. ogni Mosquito è stato inoculato con uno, due, o tre perle. I punti solidi rappresentano il valore più alto melanizzazione per le zanzare, i punti incrociate rappresentano il valore melanizzazione intermedio, ei punti vuoti rappresentano il valore più basso melanizzazione. Le linee continue rappresentano il melanizzazione trattamento medio a tallone, le linee tratteggiate mostrano la media più alta melanizzazione, e le linee tratteggiate indicano la media della melanizzazione basso. (B) Media e errore standard della melanizzazione, la più alta melanizzazione e il melanizzazione più basso per il trattamento di inoculazione tallone. Il nero rappresenta il tallone melanizzazione medio in funzione del numero di sfere (con valori che vanno da 0 melanizzazione per perline non melanized a 100 per quelli pesantemente melanized). Il punto rosso rappresenta la media del più alto melanizzazione. Il triangolo blu rappresenta la media della melanizzazione più basso. I bar sono gli errori standard. Modificato da riferimento ^19.

Questa tecnica di iniezione è utile per stimolare e studiare la risposta melanizzazione in zanzare. Ad esempio, qui abbiamo studiato l'effetto del carico stimoli immunitario.

Il passo fondamentale in questa procedura è per inoculare correttamente la zanzara. Qualsiasi danni eccessivi ai muscoli del volo o per la zanzara si può impedire la zanzara da alimentazione o può uccidere prima della dissezione. Un secondo passo fondamentale è quello di mantenere le zanzare sul ghiaccio abbastanza a lungo da metterli fuori senza ucciderli. Un piccolo contenitore faciliterà e accelerare il processo, in quanto consente un più stretto contatto con il ghiaccio. Infine, è necessaria particolare attenzione durante la dissezione, come pinzette possono altrimenti rompere le perline. Perline incorporati nel tessuto zanzara può richiedere più tempo per essere colorati dalla soluzione dissezione.

L'utilizzo di più tipi di perle (come neutrale, positivamente o negativamente carica perline o perle di vetro) porterà a risultati diversi, come may non tutti essere melanized allo stesso grado ^27,43. Infatti, a fronte di perline carica neutra, perline carichi negativamente portano ad una maggiore variabilità nella risposta melanizzazione tra le zanzare ^27. Perle di vetro, d'altro canto, sono inerti nelle zanzare e non attivano la risposta melanizzazione affatto ^27. perline carica negativa possono quindi essere preferito, ma il confronto tra le diverse sfere possono anche essere pertinente. Tuttavia, a seconda del tipo di tallone, un colorante diverso può essere richiesto per le soluzioni di iniezione e sezionamento; per esempio, colorante violetto cresolo dovrebbe essere usato al posto del verde metile quando si utilizza perline di vetro ^27.

Questa tecnica di iniezione è invasiva per la zanzara. Anche se i danni e lesioni possono essere ridotti al minimo e controllati, gli strumenti alternativi possono essere una scelta migliore, a seconda del disegno sperimentale. È difficile stimolare e misurare simultaneamente diverse risposte immunitarie nella stessa zanzara. Lavoroing sulle famiglie o gruppi di zanzare è necessario quando guardando le correlazioni tra le risposte immunitarie ^28. Inoltre, perline sono solo parzialmente simile alla effettiva presenza di parassiti in un insetto.

Innanzitutto, la risposta immunitaria è stimolata, e quindi la risposta fenotipica risultante, l'incapsulamento, viene misurato, ma ciò che accade in mezzo è sconosciuta. Accoppiamento iniezioni con strumenti fisiologici o molecolari ^{10 - 12} in grado di migliorare la nostra comprensione di questa risposta melanizzazione. Per studiare i meccanismi alla base della risposta melanizzazione, l'espressione di enzimi chiave o molecole prodotte durante la cascata pro-phenoloxidase può essere misurata ^{10 - 12.} Tuttavia, concentrandosi esclusivamente sulla up- o down-regulation di tali molecole, senza conoscere le conseguenze reali della incapsulamento finale, può portare ad una valutazione inesatta del processo melanizzazione. Pertanto, lo studio ENCApsulation ed i meccanismi molecolari insieme sarebbe altamente informativo, nonostante il fatto che sono ciascuna una tecnica scientifica valida usati separatamente.

Per concludere, questa è una tecnica per studiare l'immunità e l'evoluzione dell'immunità. Vi è, ad esempio, una crescente evidenza di un legame tra resistenza agli insetticidi e suscettibilità zanzara parassiti della malaria. Questa tecnica di iniezione potrebbe essere utilizzata in un tale contesto, così come nelle prove sul campo. Una seconda direzione di lavoro potrebbe essere quella di combinare la stimolazione immunitaria con atterramenti gene per studiare percorsi immunitario in dettaglio.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.