接种

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

免疫反应的刺激是无脊椎动物研究的常用工具来检查的有效性和免疫力的机制。这种刺激是基于注射非致病性颗粒的成虫，如颗粒将被免疫系统检测，将诱导产生免疫效应的。在这里，我们专注于在蚊子冈比亚按蚊黑化反应的刺激。黑化反应的结果在外来颗粒和寄生虫与黑色素的暗层封装。为了刺激这个回应，蚊子接种使用微细玻璃管在胸腔珠。然后，24小时后，蚊子解剖检索珠。胎圈的黑化的程度是使用图像分析软件来测量。珠没有寄生虫的致病作用，或它们的容量来逃避或抑制免疫应答。这些注射是measu方式再免疫效果和免疫刺激对其他生活史特征，如孕卵或寿命的影响。这是不完全一样的直接研究宿主 - 寄生虫的相互作用，但它是一个有趣的工具来研究免疫和其进化生态学。

昆虫依靠免疫反应，以保护自己免受寄生虫和致病菌^{1 - 3，}通过他们的角质层或他们的肠上皮细胞⁴突破口。在蚊子，这些反应是对细菌^5，6病毒，线虫丝虫⁷和疟原虫^1,8,9高效。在蚊子，一个关键的免疫应答是外来颗粒与黑色素¹⁰的封装^{- 12。 12 -}此封装可以在肠或血淋巴循环系统¹⁰发生。此黑化反应是亲酚的结果级联^{10 - 12，}并且它可以导致寄生虫死亡或它们的吞噬作用。在成蚊，其中血细胞的细胞的数量是有限的，黑化是体液应答，如针对疟原虫寄生虫或丝虫线虫^7。在其他一些昆虫，它直接是围绕寄生虫聚集melanize他们⁷血细胞的细胞。此外，黑色素也像鸡蛋的生产和表皮伤口愈合⁷其他几个生理过程是必不可少的。

免疫反应的刺激作为一种工具来研究昆虫干扰的几个农业和公共健康模型系统^{13 - 18。}它在使用按蚊冈比亚蚊子，在非洲疟疾的主要载体，研究宿主-寄生虫的相互作用^{14 - 16,19。}这些技术是基于昆虫以检测与它们的模式识别受体^（PRR）2寄生虫的能力。蚊子也可以检测其他分子与其生物学如病原体相关分子模式（PAMP）的干扰，或检测由于胶原蛋白和核酸的释放自己的受损细胞。蚊子免疫细胞S，从而作为血细胞用于检测^{20 - 23。}主免疫信号途径是Imd信号，收费，JAK / STAT ²⁴和核糖核酸干扰^{（RNAi）25,26。}这两种收费和IMD的途径影响黑色素的反应，并与亲酚互动级联^{10 - 12。}

用于刺激黑色素响应的标准工具是用小珠进入胸腔的血淋巴蚊子的接种。黑色素包封的程度可以然后通过蚊子的解剖检索胎圈后测量^19。在大多数研究中，只有一个小珠被每蚊^15,16,27注入，但注入多珠是可能的，以研究在黑化响应¹⁹的限制。这些珠粒使用注射液（生理血清）来限制蚊子生理学紊乱注入和蚊子^15,16,27的干燥。的染料加入到该溶液中，以缓解珠选择。它是用于检索珠子^15,16,27解剖溶液是相同的。

用非致病性刺激接种昆虫的优点是把重点放在对免疫应答的直接作用的能力。有因寄生虫致病^28，免疫抑制²⁹没有复杂影响^{- 31，}或免疫逃避^{31 - 34。}此外，与其他生活史性状，如长寿或繁殖力的刺激所造成的后果，也可以研究。因此，研究人员在研究进化生态学可能需要这样的工具^2,35,36。例如，免疫挑战黄蜂有饥饿状态下寿命缩短。免疫刺激和部署类似的负面影响已经在不同的无脊椎动物模型中观察到，往往导致在很短的呃寿命或更少的繁殖成功^13,27,37。这些研究可以在不同的环境中^2,4,38进行。刺激免疫力也感兴趣的那些直接专注于免疫病理学^39,40。

这个协议是基于珠子的接种的蚊子刺激黑化反应，并直接测量黑色素的量。这使得在不同的实验设置黑化反应的定量和定性研究。这样的工具可以扩展到其它的免疫反应，如抗菌响应于刺激热灭活细菌^41。它也可以在许多生态设置进行。

1.注射和解剖盐溶液

1. 通过加入氯化钠，氯化钾，及氯化钙₂到蒸馏水在pH = 6.8，得到1.3毫摩尔NaCl，0.5mM的KCl和0.2mM的_氯化钙制备的盐溶液。
2. 将1ml的0.1％甲基绿溶液添加到99毫升计盐溶液的着色透明珠。这是0.001％甲基绿"注射液"。
3. 然后，加入5毫升0.1％甲基绿溶液至45毫升生理盐水溶液。这个0.01％甲基绿"夹层溶液"是甲基绿10倍以上的浓缩，以促进珠粒在解剖的着色和它们的观察。
   注意:如果需要过滤消毒的缓冲区。

2.毛细准备

1. 热拉微细玻璃管以获得非常细的尖端比最小的小珠（φ= 40微米^）42稍大。
2. 打开和通过打破用镊子尖或锯尖断djust每个毛细管。

3.饲养蚊子

1. 后方冈比亚按蚊在26±1℃，70±5％相对湿度，和12:12小时的光:暗周期。保持成年女性，让他们获得了10％的糖溶液。

4.用毛细管珠选择

1. 在5cm的培养皿中倒入0.009克的带负电荷的小球（40-120微米直径），并加入5毫升注射液30分钟提前。
   注意:我们的目标是让染料着色珠，使珠选择用于注射的更容易。高压灭菌珠子，如果他们不进来的无菌罐子。
2. 使用安装在毛细吸管灯泡的毛细管，直观地选择一个双目显微镜下在0.1微升的盐溶液中的最小珠。
   注意:当同时接种几个珠，0.1微升的总体积选择三个珠。

5.蚊子处理和接种

1. 使用昆虫吸引器，将每个蚊子在50毫升管中。
2. 通过将管在碎冰（2-5分钟）简要地冷却各蚊子。
3. 放置在其右侧蚊子的双目显微镜下。
4. 下一个立体显微镜，通过经由胸腔角质层的左侧牢牢刺穿，然后注入液和珠接种与毛细蚊子。
   注意:小心不要握住毛细管作为垂直于在蚊子可能损坏飞行肌肉。
5. 取下毛细管。
6. 使用轻量级昆虫学镊子，将每个女性在覆盖着蚊帐180毫升的塑料杯中分别;让他们获得了10％的糖溶液。
   注:警告是必需的与糖的溶液，作为蚊可能会卡在糖溶液滴。

6.蚊子解剖和珠摄影

1. 检查蚊子是活在接种后24小时。如果是这样，检查他们的条件，只保留那些能飞的蚊子。
2. 冻结这些蚊子在-20℃。
   注:他们可以解剖前几天保持到几个月，如果需要的话。
3. 在32X倍的双目显微镜下取出用镊子蚊子的翅膀。固定机翼上用透明胶带载玻片上。写下用于每个蚊子的代码。
4. 把玻璃载片在一台扫描仪，并在1200 dpi的扫描。
   注意:检查代码是否可读每一个人蚊子。
5. 在玻璃显微镜载片，并在夹层溶液，使用镊子胸廓从头部和腹部分离。
6. 用镊子打开胸腔检索珠。
   注:珠子不移动到腹部，不与彼此接触，其中大部分在叔自由浮动他的血淋巴。要小心，不要中断与镊子珠，作为非珠白化可能很难找到。等待1〜5分钟，为珠，以获得颜色。
7. 转移珠在显微镜载玻片剥离液液滴，拍摄照片前。
   注:无需洗珠。
8. 使用装备有相机的显微镜，采取各胎圈的数字图像在一个标准的照明设置和放大400倍。
   注意:不要改变不同的图片之间的照明，使它们的比较。

7.图像分析:珠黑化

1. 打开的图像分析软件。点击"文件"，然后点击"打开"，找到珠的形象。
2. 点击"分析"。点击"设置测量。"勾选在"测量设置"窗口中的"平均灰度值"框。
3. 点击圆圈选择工具图标。选择珠周长;留在方珠，避免周围的发光光环。
4. 点击"分析"菜单上。点击"措施"。获得胎圈的横截面面积的平均灰度值和大小。
   1. 要获得每个珠子的黑化值，使用计算器或计算器软件执行以下操作:"256 - 平均灰度值。"黑化的措施是0和256之间的值，其中0表示完全白色图像。

蚊子没有所有melanize以同样的方式的珠，如一些珠粒少覆盖有黑色素比其他（ 图1）。事实上，一些珠子由于缺乏黑色素的仍然蓝色，但其他人却完全黑了（ 图1）。黑化值通过线性内插标准化为值0（这对应于蓝色和unmelanized珠）和100（对应于一个黑暗和严重白化珠）（ 图2a和2b）之间。这些值表示的珠粒黑色素的程度，因此，免疫反应的强度。

我们可以通过比较它们的黑化值进行比较珠彼此。黑化反应一般遵循高斯分布，这使得像ANOVA或高斯GLM经典的统计分析。

当小珠的数量增加了接种的（F igure 2）均珠黑化值从71下降到50。还有的时候，免疫挑战增加了蚊子的黑化反应的一些限制。另外，黑化响应为最小白化珠在每个蚊分别下降，从71至35为一至三个珠。然而，最强烈变暗珠的黑化值约停留不变。黑化的变异性的小珠的数量增加。黑化的努力是不统一之中在给定的蚊子全部珠，作为一个小珠被优先于其他人。这种注射技术是研究免疫反应的变异性在蚊子是有用的。

图1:一个非白化的图片的例子，部分变暗，和一个高度白化珠解剖后。在左边，中间和右边是一个非白化珠，部分白化珠，和一个高度白化珠，分别。

图2:珠黑色素作为接种珠的数量的函数。 （a）每个点示出了单个珠（具有黑化的值范围从0用于非白化珠100对重变暗的）和点的每一列的黑化表示各个蚊子。每个诱蚊诱卵uito用一个，两个或三个珠接种。固体分表示最高黑化值每蚊子，交叉点表示中间黑化值，而空点表示最低黑化值。实线代表平均值黑色素每珠治疗中，虚线示出的最高黑色素的平均值，和虚线表示最低黑色素的平均值。 （ 二 ）均值和黑化，最高的黑化，每个珠子接种治疗黑色素最低标准误差。 黑色代表平均珠黑色素作为珠（范围从0用于非白化珠100对重变暗那些与黑化值）的数量的函数。红点代表最高黑色素的平均值。蓝色三角形代表最低黑色素的平均值。该酒吧的标准误差。从参考¹⁹修改

这种注射技术是很有用的激发和研究蚊子的黑化反应。例如，在这里我们研究的免疫刺激负荷的效果。

在此过程中的关键步骤是正确接种蚊子。以飞行肌或蚊子本身的任何过多的损害可能会阻止喂养蚊子或解剖之前，可能杀死它。第二个关键步骤是保持蚊子冰足够长的时间敲出来没有杀害他们。一个小容器将缓解和加快这一进程，因为它能够与冰更密切的联系。最后，在剥离需要特别小心，镊子否则可能打破珠。嵌入在蚊虫组织可能需要更多时间珠子被解剖的解决方案进行着色。

使用多个种类的小珠（如中性，带正电或带负电的小珠或玻璃珠）将导致不同的结果，因为它们中号唉不是所有被变暗到相同的程度^27,43。事实上，相对于电中性的珠子，带负电荷的珠子导致蚊子²⁷之间的黑化反应更多的变化。玻璃珠，在另一方面，是在蚊子惰性和不触发在所有²⁷的黑化反应。带负电荷的珠可以因此是优选的，但不同的小珠之间的比较也可以是恰当的。然而，根据其种类珠，可能需要注入和解剖解决方案的不同的染料;例如，甲酚紫染料应用玻璃珠²⁷时用来代替甲基绿。

这种注射方法是侵入性的蚊虫。即使损害和伤害可以最小化和控制，备用工具可能是更好的选择，取决于实验设计。很难在同一蚊子激发和同时测量几个免疫应答。工作ING对家庭或蚊群望着免疫反应²⁸之间的相关性时是必需的。此外，珠是仅部分类似于寄生虫在昆虫的实际存在。

首先，免疫应答被刺激，然后将所得的表型响应，封装，被测量，但会发生什么情况之间是未知的。耦合生理或分子工具注射^{10 - 12}可以提高我们的这个黑化反应的理解。研究黑色素响应的基本机制，钥匙酶或亲酚级联过程中产生的分子的表达可以测量^{10 - 12。}然而，仅仅着眼于向上或向下调节这些分子的，在不知道最终封装的实际的后果，可能导致黑化过程的不准确的评价。因此，研究ENCApsulation和分子机制一起将是非常翔实，尽管单独使用时，它们各为有效的科学技术。

总之，这是研究免疫和免疫进化的技术。还有就是，例如，越来越多的证据来疟原虫杀虫剂耐药性和蚊虫易感性之间的联系。这种注入技术可以在这样的背景在田间试验中被使用，以及。第二个努力的方向将是免疫刺激基因击倒相结合，详细研究免疫途径。

The authors declare that they have no competing financial interests.

This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.