затравочный

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Стимуляция иммунного ответа является распространенным инструментом в беспозвоночными исследований с целью изучения эффективности и механизмов иммунитета. Эта стимуляция основана на введении непатогенных частиц в насекомых, так как частицы будут обнаружены иммунной системой и будет индуцировать образование иммунных эффекторов. Мы сосредоточимся на стимуляции реакции меланизации в комара Anopheles gambiae. Результаты ответа меланизации в капсулой инородных частиц и паразитов с темным слоем меланина. Чтобы стимулировать этот ответ, комары заражают с бисером в грудной полости с использованием микрокапиллярных стеклянных трубок. Затем, после того, как 24 часов, комары рассечены, чтобы получить шарики. Степень меланизации борта измеряется с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Бусинки не имеют патогенного воздействия паразитов, или их способности уклоняться или подавлять иммунный ответ. Эти инъекции являются способом колбыповторно иммунной эффективности и влияния иммунных раздражений на других черт истории жизни, такие, как плодовитость или долговечность. Это не совсем так же, как непосредственно изучает паразита и хозяина взаимодействий, но это интересный инструмент для изучения иммунитета и его эволюционной экологии.

Насекомые полагаются на иммунные ответы , чтобы защитить себя от паразитов и патогенных микроорганизмов ^{1 - 3} , которые нарушают через их кутикулу или их эпителия средней кишки ^4. В комаров, эти реакции являются эффективными против бактерий, вирусов ^{5 6, 7} филяриатозных нематод и паразитов малярии ^1,8,9. В комаров, ключевой иммунный ответ является герметизация инородных частиц с меланином ^{10 - 12.} Эта герметизация может произойти в кишке или в гемолимфе циркуляционная система ^{10 - 12.} Этот ответ меланизации является результатом про-фенолоксидазы каскад ^{10 - 12,} и это может привести к гибели паразитов или их фагоцитоз. У взрослых комаров, где количество форменных клеток ограничено, меланизации является гуморальный ответ, как и против плазмодия паразитов или филяриатозных нематод ^7.В некоторых других насекомых, то есть непосредственно Гемоциты клетки , которые собираются вокруг паразита melanize их ^7. Кроме того, меланин также имеет важное значение для ряда других физиологических процессов , как производство яиц и кутикулы заживления ран ^7.

Стимуляция иммунных реакций используется в качестве инструмента для изучения иммунитета насекомых в нескольких сельского хозяйства и общественного здравоохранения модельных систем ^{13 - 18.} Он используется в Anopheles gambiae комары, основной вектор малярии в Африке, чтобы изучить паразита и хозяина взаимодействий ^{14 - 16,19.} Эти методы основаны на способности насекомых обнаружить паразитов с их рецепторами распознавания образов (PRR) ^2. Комары могут также обнаружить другие молекулы, мешающие их биологии, таких как патоген-ассоциированных молекулярных моделей (PAMPs), или обнаружить свои собственные поврежденные клетки вследствие высвобождения коллагена и нуклеиновых кислот. Иммунной клетки комаровs такие как гемоцитах используются для обнаружения ^{20 - 23.} Основные иммунные сигнальные пути являются Imd, Toll, JAK / STAT ^24, и вмешательство рибонуклеиновой кислоты (RNAi) ^25,26. Оба Toll и пути IMD влияют на реакцию меланизации и взаимодействовать с про-фенолоксидазы каскад ^{10 - 12.}

Стандартный инструмент, используемый для стимуляции реакции меланизации является прививка комара с небольшим бусинки в гемолимфе грудной полости. Степень меланина инкапсулирования затем может быть измерено ¹⁹ после извлечения бусинку через рассечение комара. В большинстве исследований, только один шарик был введен в комара ^15,16,27, но инъекции больше бусин можно с целью изучения пределов ответа меланизации ^19. Эти шарики вводят с использованием раствора для инъекций (физиологический сыворотки), чтобы ограничить нарушение москитной физиологии ивысыхание комаров ^15,16,27. Краситель добавляют к этому раствору, чтобы облегчить выбор шарик. Это то же самое для решения рассечение , используемого для извлечения шарика ^15,16,27.

Преимущество инокулируя насекомых с непатогенных раздражители является способность сосредоточиться на непосредственном воздействии на иммунный ответ. Там нет осложняющие эффекты , вызванные паразитами патогенности ^28, иммуносупрессии ^{29 - 31,} или иммунной уклонения от ^{31 - 34.} Кроме того, последствия раздражений на других черт истории жизни, таких как долговечность или плодовитости, также могут быть изучены. Таким образом, исследователи , изучающие эволюционной экологии может потребоваться такие инструменты ^2,35,36. Например, иммуно-вызов шмели имеют сокращенную продолжительность жизни при голодании. Подобные негативные эффекты иммунных раздражений и развертываний наблюдались в различных моделях беспозвоночных, что часто приводит к короткойэр продолжительность жизни или менее репродуктивный успех ^13,27,37. Такие исследования могут проводиться в различных средах ^2,4,38. Стимулирующие иммунитет также представляет интерес для тех , сосредоточив внимание непосредственно на иммунопатологии ^39,40.

Этот протокол основан на инокуляции бусинок с комарами, чтобы стимулировать реакцию меланизации и непосредственно измерить количество меланина. Это позволяет количественное и качественное исследование реакции меланизации в различных экспериментальных условиях. Такой инструмент может быть распространен на стимуляцию других иммунных реакций, таких как антибактериальное ответ на убитых нагреванием бактерий ^41. Она также может быть проведено во многих экологических условиях.

1. Физиологический раствор для инъекций и Вскрытие

1. Приготовьте солевой раствор путем добавления NaCl, KCl и CaCl ₂ в дистиллированной воде , чтобы получить 1,3 мМ NaCl, 0,5 мМ KCl, 0,2 мМ и CaCl ₂ при рН = 6,8.
2. Добавить 1 мл раствора 0,1 зеленого% метилового эфира в 99 мл физиологического раствора для окрашивания прозрачных бусин. Это 0,001% метиловым зеленым "раствор для инъекций".
3. Затем добавляют 5 мл раствора 0,1 зеленого% метилового эфира в 45 мл физиологического раствора. Это 0,01% метиловым зеленым "рассечение раствор" в 10 раз больше концентрируется в метиловым зеленым, чтобы облегчить окрашивание шариков и их наблюдение во время вскрытия.
   Примечание: Фильтр стерилизовать буфер, если это необходимо.

2. капиллярного Приготовление

1. Тепло-выдвижные микрокапиллярных стеклянные трубки , чтобы получить очень тонкий кончик немного больше , чем наименьшее гранул (φ = 40 мкм) ^42.
2. Открыть иdjust каждый капилляр, разбив наконечник с помощью пинцета или путем распиливания наконечник прочь.

3. Mosquito Разведение

1. Задний A. gambiae при 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% относительной влажности и 12:12 ч света: с темного цикла. Держите взрослых самок и дать им доступ к 10% -ного раствора сахара.

4. Выбор из бисера с капилляра

1. Налейте 0,009 г отрицательно заряженных гранул (40-120 мкм в диаметре) в чашке Петри 5 см и добавить 5 мл раствора для инъекций 30 мин заранее.
   Примечание: Цель состоит в том, чтобы краситель цвет бусинки, чтобы сделать выбор шарик для инъекций легче. Автоклав бусы, если они не приходят в стерильную банку.
2. Использование вмонтирован капилляр в капиллярной пипеткой колбой, визуально выбирать наименьший шарик в 0,1 мкл физиологического раствора под бинокулярным микроскопом.
   Примечание: Когда инокуляции несколько бусин одновременно, выбрать три бусинки от общего объема 0,1 мкл.

5. Комар Обращение с веществом и прививка

1. Используя аспиратора насекомых, поместите каждый комар в 50 мл трубки.
2. Холод каждый комар кратко, помещая трубку в колотый лед (2-5 мин).
3. Поместите комара на правом боку под бинокулярным микроскопом.
4. Под стереомикроскопа, прививают комара с капилляра, плотно пробивания левой части грудной полости кутикулы, а затем впрыска жидкости и закраиной.
   Примечание: Следите за тем, чтобы не повредить мышцы полета, держа капилляр, как перпендикулярно к комара, насколько это возможно.
5. Удалить капилляр.
6. Используя полулегком энтомологии щипцов, место каждая самка индивидуально в пластиковом стакане на 180 мл, покрытого москитной сеткой; дать им доступ к 10% -ного раствора сахара.
   Примечание: Требуется осторожность с раствором сахара, как комар может застрять на капли раствора сахара.

6. MosquitoВскрытие и бисера Фото

1. Проверьте, если комары живы 24 часа после прививки. Если да, то проверить их состояние и держать только те комары, которые умеют летать.
2. Зафиксировать эти комары при -20 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Они могут храниться в течение нескольких дней до нескольких месяцев, прежде чем рассечением, если это необходимо.
3. Удалите крылья комары 'с помощью пинцета под бинокулярным микроскопом при увеличении 32Х. Закрепите крылья на предметные стекла с прозрачной лентой. Запишите код, используемый для каждого отдельного комара.
4. Поместите стеклянные слайды в сканер и сканировать их в 1200 точек на дюйм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что код читается для каждого отдельного комара.
5. На предметное стекло микроскопа и в рассечение растворе, используйте пинцет, чтобы отделить грудную клетку от головы и живота.
6. Откройте грудную клетку с пинцетом для извлечения шариков.
   Примечание: шарики, которые не перемещаются в брюшной полости, не находятся в контакте друг с другом, и большинство из них свободно плавают в тон гемолимфы. Будьте осторожны, чтобы не сломать шарик с пинцетом, как не-melanized шарик может быть жестким, чтобы найти. Подождите от 1 до 5 мин для бусин, чтобы получить цвет.
7. Передача бусины в капельке рассечение раствора на предметное стекло микроскопа, перед съемкой.
   Примечание: Нет необходимости мыть шарики.
8. С помощью микроскопа, оборудованного камерой, возьмите цифровое изображение каждого шарика при стандартной установке освещения и 400X увеличения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте освещение между различными изображениями для того чтобы включить их сравнение.

7. Анализ Фото: Шарик меланизации

1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений. Нажмите на кнопку "Файл" и затем на "открыть", чтобы найти шарик изображение.
2. Нажмите на кнопку "анализировать". Нажмите на кнопку "набор измерений." Отметьте «среднее значение серого" окно в окно "Установка измерений".
3. Нажмите на иконку круга инструмента выбора. Выберите шарик периметр; оставаться всторону борта и избежать светящихся ореолов вокруг него.
4. Нажмите на меню "анализировать". Нажмите на "меры." Получают среднее значение серого и размер площади поперечного сечения валика.
   1. Для того, чтобы получить значение меланизации каждого борта, выполнить следующую операцию с помощью калькулятора или калькулятор программного обеспечения: "256 - среднее значение серого". Мера меланизации является значение от 0 до 256, при этом 0 соответствует совершенно белое изображение.

Комары не все melanize бусинки точно так же, как и некоторые гранулы менее покрыты меланина , чем другие (рисунок 1). Действительно, некоторые шарики оставались синим из - за отсутствия меланизации, в то время как другие были полностью темным (рисунок 1). Величина меланизации была стандартизирована путем линейной интерполяции до значения в диапазоне от 0 (что соответствует голубой и unmelanized шарик) и 100 ( что соответствует темной и сильно melanized борта) (рис 2а и 2b). Эти значения указывают на степень меланизации шариков и, таким образом, сила иммунного ответа.

Мы можем сравнить шарики друг с другом, сравнивая их значения меланизации. Ответ меланизации в целом соответствует распределению Гаусса, что позволяет классические статистические анализы, такие как ANOVA или гауссовой GLM.

Среднее значение шарика меланизации снизилось с 71 до 50 , когда число бусин , привитых увеличилось (F igure 2). Есть некоторые пределы ответа меланизации в комара, когда иммунная задача возрастает. Кроме того, ответ меланизации снизился на наименее melanized шарик в каждом комара, от 71 до 35 лет от одного до трех шариков, соответственно. Тем не менее, значение меланизации наиболее сильно melanized шарик оставался примерно постоянным. Изменчивость меланизации увеличилась с количеством бусин. Усилия меланизации не было равномерным среди всех шариков в данной комара,поскольку один шарик был приоритет над другими. Этот метод инъекции полезен для изучения изменчивости иммунных реакций у комаров.

Рисунок 1: примеры картина , не melanized, частично melanized, и очень melanized шарик после рассечения. На левой, средней и правой являются неблагоприятная melanized шарик, частично melanized шарик, и очень melanized шарик, соответственно.

Рисунок 2: Шарик меланизации в зависимости от количества инокулированных бусинок. (А) Каждая точка показывает меланизации одиночного шарика (со значениями меланизации в диапазоне от 0 для не melanized бисера 100 для сильно melanized из них) , а каждый столбец точек представляют собой индивидуальную комара. Каждый Mosquito заражают один, два или три бусины. Сплошные точки представляют наибольшее значение меланизации за комара, скрещенные точки представляют промежуточное значение меланизации, а пустые точки представляют собой наименьшее значение меланизации. Сплошные линии представляют среднее меланизации на обработку борта, пунктирные линии показывают среднее значение самого высокого меланизации, а пунктирные линии обозначают среднее значение самой низкой меланизации. (Б) среднее и стандартная ошибка меланизации, самая высокая меланизации и самой низкой меланизации на гранулу модифицирующей обработки. Черный представляют собой средние значения шарик меланизации в зависимости от количества бусинок (со значениями меланизации в диапазоне от 0 для не melanized бусинами до 100 для сильно melanized участками). Красная точка представляет собой среднее значение самого высокого меланизации. Синий треугольник представляет собой среднюю величину самой низкой меланизации. Стержни стандартные ошибки. Модифицированный из ссылки ^19.

Этот метод инъекции полезно, чтобы стимулировать и изучить реакцию меланизации в комаров. Например, здесь мы изучали влияние иммунной стимулов нагрузки.

Важным шагом в этой процедуре является правильно прививать комара. Любое чрезмерное повреждение мышц полета или самого комара может предотвратить комара от кормления или может убить его перед рассечение. Второй шаг Ключ должен держать комаров на льду достаточно долго, чтобы выбить их, не убивая их. Небольшой контейнер облегчит и ускорит процесс, так как она позволяет более тесный контакт со льдом. И, наконец, необходимо соблюдать особую осторожность во время вскрытия, так как пинцет может иначе нарушить бусинки. Шариков, погруженных в москитной ткани может занять больше времени, чтобы быть окрашен раствором рассечение.

Использование нескольких видов шариков (как нейтрально, положительно или отрицательно заряженные шарики или стеклянные бусы) приведут к разным результатам, так как они мау не все быть melanized в той же степени ^27,43. Действительно, по сравнению с нейтрально заряженных шариков, отрицательно заряженные шарики привести к более переменчивой в ответ меланизации между москитов ^27. Стеклянные бусины, с другой стороны, являются инертными в комаров и не вызывают реакцию меланизации на всех ^27. Отрицательно заряженные шарики таким образом, может быть предпочтительным, но сравнение между различными бусинками также может быть уместен. Тем не менее, в зависимости от вида бусинки, другой краситель может потребоваться для растворов для инъекций и рассечение; например, крезилового фиолетового красителя следует использовать вместо метиловым зеленым при использовании стеклянных шариков ^27.

Этот метод инъекции является инвазивным для комаров. Даже если повреждения и травмы могут быть сведены к минимуму и контролировать, альтернативные инструменты могут быть лучшим вариантом, в зависимости от экспериментального проектирования. Трудно, чтобы стимулировать и одновременно измерять несколько иммунных реакций в том же комара. Работамости от семей или групп комаров требуется при взгляде на корреляции между иммунными реакциями ^28. Кроме того, гранулы лишь частично похожи на фактическое наличие паразитов в насекомых.

Во-первых, иммунный ответ стимулируют, а затем полученный фенотипический ответ, инкапсуляция, измеряется, но то, что происходит между ними, неизвестно. Соединительная инъекции с физиологическим или молекулярных инструментов ^{10 - 12} может улучшить наше понимание этого ответа меланизации. Изучить основные механизмы реакции меланизации, экспрессия ключевых ферментов или молекул , образующихся при про-фенолоксидазы каскада может быть измерено ^{10 - 12.} Тем не менее, сосредоточившись исключительно на вверх или вниз регулирования таких молекул, не зная фактические последствия окончательного инкапсуляция, может привести к неточному оценки процесса меланизации. Поэтому, изучая ENCApsulation и молекулярные механизмы, вместе были бы весьма информативны, несмотря на то, что каждый из них действительный научный метод при использовании отдельно.

В заключение, это методика исследования иммунитета и эволюцию иммунитета. Существует, например, все больше доказательств для связи между устойчивости к инсектицидам и восприимчивость комаров к паразитам малярии. Эта методика инъекции может быть использован в таком контексте, а также в полевых испытаниях. Второе направление работы будет сочетать стимуляцию иммунного ответа с геном нокдаунов для изучения иммунных путей в деталях.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.