ייחסתי

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

הגירוי של המערכת החיסונית הוא כלי נפוץ מחקרים חסרי חוליות לבחון את היעילות ואת מנגנוני חסינות. גירוי זה מבוסס על הזרקת חלקיקים שאינם פתוגניים לתוך חרקים, שכן חלקיקי יזוהו על ידי המערכת החיסונית יניעו את הייצור של effectors החיסונית. אנו מתמקדים כאן על גירוי של התגובה melanization של היתוש אנופלס gambiae. התוצאות בתגובה melanization ב אנקפסולציה של חלקיקים זרים וטפילים בשכבה כהה של מלנין. כדי לעורר את התגובה הזאת, יתושים הם מחוסנים עם חרוזים את חלל בית החזה באמצעות צינורות זכוכית microcapillary. ואז, לאחר 24 שעות, היתושים הם גזורים כדי לאחזר את החרוזים. מידת melanization של החרוז נמדדת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. חרוזים לא צריכים את ההשפעות פתוגניים של טפילים, או יכולתי להתחמק או לדכא את התגובה החיסונית. זריקות אלו הן דרך צפחותמחדש יעילות חיסון ואת ההשפעה של גירויים חיסוניים על תכונות היסטורית חיים אחרות, כגון פוריות או אריכות ימים. זה לא בדיוק אותו דבר כמו ללמוד ישירות אינטראקציות המארח טפיל, אבל זה כלי מעניין ללמוד חסינות אקולוגיה אבולוציונית שלה.

חרקים להסתמך על המערכת החיסונית כדי להגן על עצמם מפני טפילים ופתוגנים ^{1 - 3} המפרות דרך לציפורן שלהם או midgut שלהם האפיתל ^4. בשנת יתושים, התגובות הללו הם יעילים כנגד חיידקים ^5, וירוסים ^6, נמטודות filarial ^7, ו טפילי מלריה ^1,8,9. בשנת יתושים, תגובה חיסונית מפתח היא אנקפסולציה של חלקיקים זרים עם מלנין ^{10 - 12.} אנקפסולציה זה עשוי לקרות midgut או ב hemolymph במחזור מערכת ^{10 - 12.} בתגובה melanization זוהי תוצאה של-phenoloxidase פרו מפל ^{10 - 12,} וזה יכול לגרום למוות של טפילים או phagocytosis שלהם. בשנת יתושים בוגרים, שבו מספר תאי hemocytes מוגבל, melanization היא תגובת לחות, כמו נגד טפילי Plasmodium או נמטודות filarial ^7.בחלק וחרקים אחרים, זה ישירות התאים hemocytes כי להתאסף סביב הטפיל כדי melanize אותם ^7. חוץ מזה, מלנין חיוני גם כמה תהליך פיסיולוגי אחר כמו ייצור ביצים ופצעים לציפורן ריפוי ^7.

הגירוי של מערכת חיסונית משמש ככלי ללמוד חסינויות חרקים בכמה מערכות מודל בריאות חקלאית וציבורי ^{13 - 18.} הוא משמש אנופלס יתושי gambiae, הווקטור הגדול של במלריה באפריקה, כדי לחקור אינטראקציות מארח טפיל ^{14 - 16,19.} טכניקות אלו מבוססות על הקיבולת של חרקים כדי לזהות טפילים עם קולטנים זיהוי דפוסים שלהם (PRR) ^2. יתושים יכולים גם לזהות מולקולות אחרות מפריעות הביולוגיה שלהם כגון דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs), או לזהות תאים הפגומים שלהם עקב השחרור של קולגן וחומצות גרעין. תא היתושים החיסוניים כגון hemocytes משמש לגילוי ^{20 - 23.} מסלולי האיתות החיסוניים העיקריים הם IMD, אגרה, JAK / STAT ^24, והפרעת חומצה ריבונוקלאית (RNAi) ^25,26. שניהם אגרה ושבילי IMD להשפיע על תגובת melanization ולתקשר עם-phenoloxidase פרו מפל ^{10 - 12.}

הכלי הסטנדרטי המשמש לעורר את תגובת melanization הוא החיסון של יתוש עם חרוז קטן לתוך hemolymph של חלל בית החזה. מידת אנקפסולציה מלנין לאחר מכן ניתן למדוד ¹⁹ לאחר אחזור חרוז באמצעות דיסקציה של היתוש. במרבית המחקרים, רק חרוז אחד שהוזרק לכל יתוש ^15,16,27, אך הזרקת חרוזים יותר אפשרי על מנת ללמוד את גבולות התגובה melanization ^19. חרוזים אלה מוזרקים באמצעות פתרון הזרקה (בסרום פיסיולוגי) להגביל הפרעה של פיזיולוגית היתושיםההתייבשות של היתוש ^15,16,27. לצבוע מתווסף פתרון זה כדי להקל מבחר חרוז. זה אותו הדבר עבור הפתרון לנתיחה בשימוש כדי לאחזר את ^15,16,27 חרוז.

היתרון של יחסינו חרקים עם גירויים שאינם פתוגניים הוא היכולת להתמקד ההשפעה הישירה על התגובה החיסונית. אין תופעות סיבוך עקב פתוגניות טפילה ^28, דיכוי חיסוני ^{29 - 31,} או התחמקות חיסון ^{31 - 34.} חוץ מזה, את ההשלכות של הגירויים על תכונות היסטורית חיים אחרות, כגון תוחלת חיים או פוריות, יכולות להיות גם למדו. לפיכך, חוקרים לומדים אקולוגיה אבולוציונית עשויים לדרוש כלים כגון ^2,35,36. לדוגמא, דבורי מאותגרים חיסוניים יש תוחלת חיים מקוצרת תחת רעב. דומות השפעות שליליות של גירויים ופריסות חיסוניים נצפו דגמים חסרי חוליות שונים, ופעמים רבות תוצאה הוא קצראה תוחלת חיים או פחות רביית הצלחה ^13,27,37. ניתן לבצע מחקרים כאלה בסביבות משתנות ^2,4,38. גירוי החסינות היא גם לעניין את אלו מתמקדים ישירות על immunopathology ^39,40.

פרוטוקול זה מבוסס על החיסון של חרוזים עם יתושים כדי לעורר את תגובת melanization וישירות למדוד את כמות המלנין. זה מאפשר מחקר כמותי ואיכותי של התגובה melanization במסגרות ניסיוניות שונות. כלי כזה יכול להתארך עד הגירוי של תגובות חיסוניות אחרות, כגון תגובה אנטיבקטריאלי לחום-הרג חיידקים ^41. זה גם יכול להתנהל במסגרות אקולוגית רבה.

1. תמיסת מלח עבור הזרקת Dissection

1. הכן את תמיסת מלח על ידי הוספת NaCl, KCl, ו CaCl ₂ למים מזוקקים כדי להשיג 1.3 מ"מ NaCl, KCl 0.5 מ"מ ו -0.2 מ"מ CaCl ₂ ב- pH = 6.8.
2. הוסף 1 מ"ל של פתרון ירוק מתיל 0.1% ל -99 מיליליטר של תמיסת מלח כדי לצבוע את החרוזים שקוף. זהו "פתרון ההזרקה" 0.001% מתיל הירוק.
3. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של תמיסת ירוק 0.1% מתיל ל -45 מ"ל של תמיסת מלח. 0.01% מתיל ירוק זה "פתרון לנתיחה" הוא 10 פעמים יותר מרוכז בירוק מתיל כדי להקל על הצבעוניות של חרוזים לבין ההתבוננות בהן במהלך הניתוח.
   הערה: סנן לעקר את החיץ במידת הצורך.

2. הכנת נימים

1. צינורות זכוכית microcapillary חום המשיך כדי לקבל עצה טובה מאוד מעט גדולה יותר את החרוזים הקטנים (φ = 40 מיקרומטר) ^42.
2. פתוחdjust כל נימים ידי שבירת הקצה עם פינצטה או בניסור את הקצה.

3. גידול נגד יתושים

1. א gambiae אחורי ב 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% לחות יחסית, ואור hr 00:12: מחזור כהה. שמור לנשים בוגרות ולתת להם גישת פתרון סוכר 10%.

4. בחירות ביד עם הנימים

1. יוצקים 0.009 גרם של חרוזים טעונים שלילית (40-120 מיקרומטר קוטר) בצלחת 5 ס"מ פטרי ולהוסיף 5 מ"ל של 30 דקות פתרון הזרקת מראש.
   הערה: המטרה היא לתת צבע לצבוע את החרוזים כדי לבצע את הבחירה חרוז להזרקה קל. חיטוי חרוז אם הם לא באים בצנצנת סטרילית.
2. באמצעות נימי רכוב נורה פיפטה נימים, ויזואלית לבחור את החרוז הקטן 0.1 μl של תמיסת המלח תחת מיקרוסקופ משקפת.
   הערה: כאשר ייחסו כמה חרוזים בו זמנית, בחר שלושה חרוזים בנפח כולל של 0.1 μl.

טיפול נגד יתושים 5. הרכבת חיסון

1. שימוש aspirator חרקים, למקם כל יתוש בתוך שפופרת 50 מ"ל.
2. צ'יל כל יתוש בקצרה על ידי הנחת הצינור בקרח כתוש (2-5 דקות).
3. מניחים יתוש על צידו הימני מתחת למיקרוסקופ המשקפת.
4. תחת סטראו, לחסן יתוש עם הנימים ידי פירסינג בחוזקה דרך הצד השמאלי של לציפורן חלל בית החזה ולאחר מכן הזרקת הנוזל ואת החרוז.
   הערה: יש להיזהר שלא לפגוע שרירי התעופה ידי החזקת הנימים כמו בניצב היתוש ככל האפשר.
5. הסר את הנימים.
6. בעזרת מלקחיים אנטומולוגיה נוצה, במקום כל נקבה בנפרד בכוס פלסטיק 180 מ"ל מכוסה בכילה נגד יתושים; לתת להם גישה פתרון סוכר 10%.
   הערה: שים לב נדרש עם תמיסת הסוכר, כמו היתוש עלול להיתקע על טיפות תמיסת סוכר.

6. נגד יתושיםDissection וצילום חרוז

1. בדקו אם יש היתושים חיים 24 שעות לאחר החיסון. אם כן, לבדוק את מצבם ולשמור רק היתושים מסוגלים לעוף.
2. להקפיא יתושים אלה ב -20 ° C.
   הערה: הם יכולים להיות כל הזמן כמה ימים עד חודשים לפני לנתיחה, במידת הצורך.
3. הסר את הכנפיים של היתושים באמצעות פינצטה תחת מיקרוסקופ המשקפת בהגדלה 32x. תקן את הכנפיים על גבי שקופיות זכוכית עם סרט שקוף. רשום את הקוד בשימוש עבור כל יתוש פרט.
4. שים את שקופיות הזכוכית בתוך סורק ולסרוק אותם 1,200 dpi.
   הערה: בדוק שהקוד קריא לכל יתוש פרט.
5. בשקופית מיקרוסקופ זכוכית בתמיסה לנתיחה, להשתמש במלקחיים כדי להפריד את החזה מהראש והבטן.
6. פתח את בית החזה עם מלקחיים כדי לאחזר את החרוזים.
   הערה: חרוזים כי לא לעבור הבטן, אינם באים במגע אחד עם השני ורובם לצוף בחופשיות tהוא hemolymph. היזהר שלא לשבור את החרוז עם מלקחיים, כמו חרוז הלא melanized עשוי להיות קשה למצוא. חכה 1 עד 5 דקות עבור חרוזים להשיג צבע.
7. מעביר את חרוזי טיפה של פתרון לנתיחה בשקופית מיקרוסקופ זכוכית, לפני צילום התמונה.
   הערה: אין צורך לשטוף את החרוזים.
8. באמצעות מיקרוסקופ מצויד במצלמת, לקחת תמונה דיגיטלית של כל חרוז בכל הגדרת תאורה סטנדרטית בהגדלת 400X.
   הערה: אין לשנות את התאורה בין התמונות האחרות על מנת לאפשר ההשוואה שלהם.

7. ניתוח תמונה: חרוז melanization

1. פתח את תוכנת ניתוח תמונה. לחץ על "קובץ" ולאחר מכן על "פתח" כדי למצוא תמונת חרוז.
2. לחץ על "לנתח". לחץ על "מדידות להגדיר." סמן את התיבה "אומר ערך אפור" בחלון "מדידות סט".
3. לחץ על סמל כלי הבחירה מעגל. בחר את ההיקף החרוז; להשאר בלצד החרוז ולהימנע ההילה זוהרת סביבו.
4. הקישו על תפריט "לנתח". לחץ על "קנה מידה." השג את הערך אפור הממוצע וגודל שטח החתך של החרוז.
   1. כדי לקבל את ערכן melanization של כל חרוז, לבצע את הפעולה הבאה באמצעות תוכנת מחשבון או מחשבון: "256 - כלומר ערך אפור." מדד melanization הוא ערך בין 0 ל 256, עם 0 מייצג תמונה לבנה לגמרי.

יתושים לא כל melanize חרוזים באותה דרך, כמו כמה חרוזים היו פחות מכוסה המלנין יותר מאחרים (איור 1). ואכן, כמה חרוזים נשאר כחולים בגלל חוסר melanization, בעוד שאחרים היו חושך מוחלט (איור 1). השווי melanization היה טופל על ידי אינטרפולציה ליניארית לערך בין 0 (אשר תואם חרוז כחול unmelanized) ו -100 (המקביל ל חרוז כהה בכבדות melanized) (איור 2 א ו -2 ב). ערכים אלה מציינים את מידת melanization של חרוזים ובכך, את עוצמת התגובה החיסונית.

אנחנו יכולים להשוות חרוזים זה לזה על ידי עריכת השוואות ערכי melanization שלהם. תגובת melanization בדרך כלל כדלקמן הפצת גאוס, המאפשרת ניתוחים סטטיסטיים קלסיים כמו ANOVA או GLM גאוס.

שווי melanization חרוז ממוצע ירד מ 71 כדי 50 כשהוא מספר החרוזים מחוסן מוגבר (F igure 2). ישנן כמה מגבלות של התגובה melanization ב יתוש כאשר האתגר החיסון מגביר. יתר על כן, תגובת melanization ירד עבור החרוז לפחות-melanized בכל יתושים, מ 71 כדי 35 שנה עד שלושה חרוזים, בהתאמה. עם זאת, ערך melanization של החרוז הכי חזק melanized נשאר על קבוע. ההשתנות של melanization גדלה עם מספר החרוזים. מאמץ melanization לא היה אחיד בין כל חרוזי יתוש נתון,כמו חרוז אחד עדיף על פני אחרים. טכניקת הזרקה זה כדאי ללמוד את השתנות תגובה חיסונית יתושים.

איור 1: דוגמאות תמונה של אי-melanized, melanized חלקית, וחרוז melanized מאוד לאחר הניתוח. משמאל, באמצע, וימין הן חרוז הלא melanized, חרוז melanized חלקית, וחרוז melanized מאוד, בהתאמה.

איור 2: חרוז melanization כפונקציה של מספר החרוזים מחוסנים. (א) כל נקודה מציגה את melanization של חרוז אחד (עם ערכי melanization הנע בין 0 עבור חרוזים הלא melanized 100 עבור אלה melanized בכבדות) וכל עמודה של נקודות מייצגים יתוש פרט. כל mosquito היה מחוסן עם אחד, שניים, או שלושה חרוזים. הנקודות המוצקות מייצגות את ערך melanization הגבוה ביותר לכל יתוש, את הנקודות חצו מייצגות את ערך melanization ביניים, ואת הנקודות הריקות מייצגות את ערך melanization הנמוך ביותר. הקווים המוצקים מייצגים את הטיפול החרוז לכל ממוצע melanization, את הקווים מקווקווים להראות את הממוצע של melanization הגבוהה ביותר, ואת הקווים המקווקווים מציינים את הממוצע של melanization הנמוך ביותר. (ב) ממוצע ואת סטיית התקן של melanization, את melanization הגבוהה ביותר ואת melanization הנמוך ביותר לכל טיפול חיסון חרוז. השחור לייצג את melanization חרוז הממוצע כפונקציה של מספר החרוזים (עם ערכי melanization הנע בין 0 עבור חרוזים הלא melanized 100 עבור אלה melanized בכבדות). הנקודה האדומה מייצגת את הממוצע של melanization הגבוהה ביותר. המשולש הכחול מייצג את הממוצע של melanization הנמוך ביותר. הברים הם סטיות התקן. ¹⁹ שונה מן ההפניה.

טכניקת ההזרקה זו שימושית כדי לעורר וללמוד את התגובה melanization יתושים. לדוגמא, כאן אנו בחנו את ההשפעה של עומס הגירויים החיסוני.

השלב הקריטי בהליך זה הוא לחסן היתוש כראוי. כל נזק מוגזם לשרירים הטיסה או היתוש עצמו עשוי למנוע את היתושים מן האכלה או עלול להרוג אותו לפני הניתוח. צעד מרכזי שני הוא כדי להרחיק את היתושים על קרח מספיק זמן כדי לדפוק אותם בלי להרוג אותם. מכל קטן יקל ולהאיץ את התהליך, שכן הוא מאפשר מגע הדוק יותר עם הקרח. לבסוף, טיפול מיוחד נדרש במהלך לנתיחה, כמו פינצטה שאחרת לשבור את החרוזים. חרוזים מוטבע רקמת יתושים עלול לקחת יותר זמן כדי להיות בצבע על ידי הפתרון לנתיחה.

שימוש בסוגים רבים של חרוזים (כמו ניטרלית, באופן חיובי, או חרוזים או חרוזי זכוכית טעונים שלילית) יוביל לתוצאות שונות, כפי שהם מאיים לא כל להיות melanized באותה המידה ^27,43. ואכן, לעומת חרוזים טעונים ניטראלי, חרוזים טעונים שלילי להוביל השתנות יותר בתגובת melanization בין יתושי ^27. חרוזי זכוכית, מצד שני, הם אינרטי יתושים לא לעורר את התגובה melanization בכלל ^27. חרוזים טעונים שלילי ניתן אפוא להיות מועדפים, אבל השוואות בין חרוזים שונים גם יכולות להיות רלוונטיות. עם זאת, בהתאם לסוג של חרוז, צבע שונה עשוי להידרש הפתרונים הזרקה לנתיחה; למשל, לצבוע סגול cresyl אמור לשמש במקום ירוק מתיל בעת שימוש חרוזי זכוכית ^27.

טכניקת ההזרקה זהו פולשני היתוש. גם אם הנזק והפגיעה ניתן למזער ומבוקר, כלים חלופיים עשוי להיות אופציה טובה יותר, בהתאם לעיצוב ניסיוני. קשה לעורר בו זמנית למדוד מספר תגובות חיסוניות באותו היתוש. עֲבוֹדָהing על משפחות או קבוצות של יתושים נדרש כאשר מסתכלים על קורלציות בין תגובות חיסוניות ^28. חוץ מזה, חרוזים הם רק דומים חלקית לנוכחות בפועל של טפילי חרק.

ראשית, התגובה החיסונית מגורה, ולאחר מכן את התגובה פנוטיפי וכתוצאה מכך, אנקפסולציה, נמדדה, אבל מה שקורה בין אינו ידוע. צימוד זריקות עם כלים פיסיולוגיים או מולקולריים ^{10 - 12} יכול לשפר את הבנתנו בתגובת melanization זה. כדי לחקור את המנגנונים של תגובת melanization, הביטוי של אנזימי מפתח או מולקולות הנוצרות במהלך מפל פרו-phenoloxidase ניתן למדוד ^{10 - 12.} עם זאת, התמקדות אך ורק על למעלה או למטה-רגולציה של מולקולות כאלה, בלי לדעת את ההשלכות בפועל של אנקפסולציה הסופי, עשוי להוביל הערכה מדויקת של תהליך melanization. לכן, לומד encapsulation ואת המנגנונים המולקולריים יחד יהיה אינפורמטיבי מאוד, למרות העובדה כי הם כל טכניקה מדעית תקפה בעת שימוש בנפרד.

לסיכום, זוהי טכניקה ללמוד חסינות ואת האבולוציה של חסינות. יש, למשל, הגדלת ראיות לקשר בין התנגדות הדברה ורגישה יתוש טפיל מלריה. טכניקת הזרקה זו יכולה לשמש בהקשר כזה, כמו גם ניסוי שדה. כיוון עבודה שני יהיה לשלב גירוי מערכת חיסון עם knockdowns גן ללמוד מסלולים חיסוניים בפירוט.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.