Method Article
Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.
In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.
Çoğu hayvan çevreleriyle etkileşim kimyasal duyu temeline dayanmaktadır. koku duyusu uygun çiftleşme ortakları bulma ve gıda değerlendirilmesi, yırtıcı kaçınarak ve bulmak için önemli bir rol oynar. Ana koku epiteli 1,2, Grueneberg ganglion 3,4, Masera 5,6 septal organ ve vomeronasal organı: En memelilerde, koku alma sistemi en az dört anatomik ve fonksiyonel olarak farklı çevresel alt sistemden oluşur. VNO kimlik, cinsiyet, sosyal rütbe ve cinsel devlet 7-10 hakkında bilgi veren kimyasal ipuçlarını tespit önemli bir rol oynar aksesuar koku alma sistemi (AOS), periferal duyusal yapıyı içermektedir. VNO sağ damak üzerinde burun septum dibinde yer almaktadır. Farelerde, bir kıkırdak kapsül 11-13 içine bir ikili kör bitmeyen bir borudur. Organ, bir hilal şeklinde medial duyusal epithe hem oluşurVSNs limanlar ve yan tarafında olmayan bir duyu kısmının Lium. Her iki epitel arasındaki dar vomeronasal kanalı 14 yoluyla burun boşluğuna bağlı olan bir mukus doldurulmuş lümen yer almaktadır. Olmayan duyu dokuda büyük bir yan damar negatif basınç 15,16 aracılığıyla bu VNO lümenine peptitler veya küçük proteinler gibi göreli olarak büyük, daha çok uçucu olmayan moleküllerin girişini kolaylaştırmak için, bir vasküler pompalama mekanizması sağlar. VNO yapısal bileşenler doğumda mevcut ve organ kısa bir süre ergenlik 17 önce yetişkin boyutuna ulaşır. Ancak, kemirgen AOS zaten gençler fonksiyonel olup olmadığını 18-20 tartışmaya hala tabidir.
VSNs kendi epitel konumu ve ifade reseptör tipine hem ile ayırt edilir. VSNs bir miyelinsiz akson ve lümen doğru çıkıntı ve bir microvillous dendritik topuzu ile biten bir tek apikal dendrit ile iki kutuplu bir morfoloji göstermektedir. VSN baltaons salkımlı, dorso-kaudal ucunda kıkırdaklı kapsül bırakır septum boyunca yükselir, aksesuar koku ampul (AOB) 21,22 ile kribriform plaka ve projeler geçer vomeronasal siniri oluşturur. vomeronasal duyusal epitel iki katmandan oluşur: apikal tabaka lümen yan ve limanlardan V1R- ve nöronlar FPR-R eksprese eden bir tür ise her iki yakın yer almaktadır. Bu nöronlar AOB 23-25 ön kısmına G-proteini α alt birimi G αi2 projeyi birlikte ifade. G αo yanında daha bazal tabaka ekspres V2Rs veya FPR-Rs1 bulunan Duyu nöronları ve AOB 26-28 arka bölgeye kendi aksonları gönderin.
Vomeronasal nöronlar olasılıkla idrar, tükürük gibi çeşitli vücut sıvılarının salgılanan ve sıvı gözyaşı vardır oldukça küçük yarı-kimyasallara 29-33 (V1Rs) veya proteinli bileşiklerin 34-38 (V2Rs) tarafından aktive edilir 37,39-41 . Yerinde deneylerde VSNs da formilatlı peptidler ve çeşitli antimikrobik / enflamasyon bağlantılı bileşikler 25,42 ile aktive olduğunu göstermiştir. Ayrıca, heterolog FPR-rs proteinler (bkz 43 referans) conspecifics veya bozulmuş gıda kaynaklarından 25 hastalık için detektörleri gibi bir potansiyel rolü gösteren, bağışıklık sisteminde ifade FPRs ile agonist spektrumları paylaşmak dile getirdi.
Belirli VSN toplumlarda reseptör-ligand ilişkileri ve aşağı doğru sinyal kaskadlar anlamak için temel bir yerli bir ortamda temel biyofizik özellikleri ayrıntılı bir değerlendirmedir. Geçmişte, hücresel sinyal analizi, büyük ölçüde floresan işaretleyici protein 30,44-49 coexpressing tarafından nöronların tanımlanmış bir nüfusa işaret genetiği değiştirilmiş hayvanlardan faydalandı. Bu protokol, bir fluoresan işaretleyici ile birlikte FPR-RS3 eksprese eden bir transgenik fare hattı (FPR-RS3-i Venüs) kullanılır.Bu yaklaşım, akut koronal VNO doku dilimler halinde tek nöron patch-kelepçe kayıtları kullanarak optik tanımlanabilir hücre popülasyonunun elektrofizyolojik analizi gerçekleştirmek için böyle bir genetiği değiştirilmiş fare zorlanma istihdam nasıl örnekliyor. Bir hava basınç tahrikli çoklu varil perfüzyon sistemi duyusal uyaranlar ve farmakolojik ajanların kayıtları sırasında, hızlı tersinir ve fokal nöronal stimülasyon ya da önlenmesini sağlar. slice preparatlarda Tüm hücre kayıtları hücrenin doğal ortamında bir içsel özellikler, gerilim-etkin iletkenlikleri ayrıntılı analizi, hem de hareket potansiyeli boşaltım kalıpları için izin verir.
Tüm hayvan prosedürleri deneysel amaçlar için kullanılan hayvanların korunması (Direktif 86/609 / EEC) ve önerileri Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu (FELASA) tarafından ileri sürülen yerel ve Avrupa Birliği mevzuatı ile uyum içinde idi. C57BL / 6 fareleri ve Fpr-RS3-i Venus farenin Hem yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde, oda sıcaklığında, her iki cinsiyet grupları barındırıldı. deneyler için cinsiyet ya genç yetişkinler (6-20 hafta) kullanıldı. Hiçbir belirgin cinsiyet bağımlı farklılıklar gözlenmiştir.
1. Solüsyon Hazırlama
2. Çalışma Alanı Hazırlığı
3. VNO Diseksiyon ve katıştırma
4. Koronal VNO Doku Dilimleme
5. Tek hücreli Elektrofizyolojik Kayıtlar
Tanımlanmış hücre popülasyonlarının biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerine anlamak için, biz fare VNO (- 2 Şekil 1) akut koronal doku dilimleri gerçekleştirin. Diseksiyon sonra, dilimler bir kaç saat süre ile buz soğukluğunda oksijenli hücre dışı çözelti (S2) 'de muhafaza edilebilir. Kayıt kurulumda, taze oksijenli çözümü ile bir sabit döviz (Şekil 2B) deney boyunca doku canlılığını sağlar. Biz burada bir transgenik fare modeli (FPR-RS3-i Venüs) kullanır. Bu suş birlikte açığa FPR-RS3 ile floresan işaretleyici protein duyu nöronlarının tanımlanmış nüfusun optik kimlik sağlayan FPR-rs gen ailesinin (Şekil 3) bir prototip üyesi olarak VSNs. Elektrofizyolojik kayıtlar tek hücre düzeyinde derinlemesine analizi için araçlar sağlar. Örneğin, voltaj kontrollü akımların analizi voltaj kelepçe gerçekleştirilirmodu (Şekil 4A - B). Iyonik akımların belirli türleri izole etmek için, dilimler voltaj bağımlı L-tipi Ca 2 + akımları (Şekil 4B) engellemek için voltaj kapılı Na + akımları (Şekil 4A) veya nifedipin inhibe etmek gibi TTX olarak farmakolojik ajanlar ile superfused edilir. Ayrıca, rutin aksiyon potansiyeli deşarj desenleri (Şekil 4C) analiz etmek için geçerli kelepçe yapılandırmasında tüm hücre kayıtları gerçekleştirin. Bütün hücre kayıtları ek olarak, hücreye bağlı "gevşek kapatacak 'kayıtları hücre içi bileşenleri (Şekil 5A) ve diyaliz önleyen daha az invaziv bir yöntem sağlar. Hücreler 51 (Şekil 5B) popülasyonları tanımlanmış etkinleştirin; Kayıt aksiyon potansiyeli odaklı kısa uyaran başvurusu üzerine kapasitif akımları duyusal ligandların (MUPS örneğin, büyük üriner proteinler) taranması için hassas ve etkili bir yol sunar.
= Fo "jove_content": keep-together.within-page = "1">
Şekil 1: VNO diseksiyonu. Fare kafasındaki (A) Yandan görünüm kesici dişler kesilir hangi pozisyonu ve açısını göstermek için. (B) kapmak ve üst damak (UP) geri soymak için en iyi noktayı gösteren alttan görünüşü. Alt çene, kesici dişler ve damak çıkardıktan sonra VNO ve vomer kemik (VB) limanlar (C) kıkırdak kapsül (CC) üzerine alttan görünüşü. Her iki VNOs (D i) bilateral lokalizasyonu gösteren disseke VNO kapsülün (D) Dorsal görünümü. Yan görünüşüdür, her iki VNOs (D ii) ayrılması gerekmektedir sırt tarafında kıkırdak jant göstermektedir. Ölçek çubuğu = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Doku hazırlanması, odasını ve mikroskop sahne kayıt bir VNO üzerinde şematik yanal görünümü kursu ve epiteli (A i) olmayan duyusal bölümünde büyük kan damarı (BV) konumunu göstermek için. kesikli çizgi koronal dilimleme katmanı temsil eder. CC dışarı soyulmuş bir VNO lateral görünüm kan damarı gösteren (A ii). (B) 0.1 mm kalınlığında sentetik elyaf (SF) parçacığı ile kablolu, paslanmaz çelikten ankraj kullanan çözeltisi doldurulmuş kayıt odasının tabanına sabit koronal VNO doku dilim Agaroz konuldu. kutulu alan doku dilim çevreleyen agaroz göstermektedir. (Cı) Bir agaroz (Ag) konumunu ve yönünü gösteren şematik görünümü iki lifleri arasına yerleştirilmiş koronal VNO dilim Gömülü. (D) mikroskopa yerleştirildi kayıt odasının bakış. Kamara duyusal uyaranlar veya farmakolojik ajanlar uygulamak için oksijenli S 2, perfüzyon kalem (PP) ile sürekli süperfüzyomu için banyo uygulaması (BA), amplifikatör kafa sahnede, referans elektrot bağlanan kayıt pipet (RP) (RE ile donatılmıştır ) ve emiş kapiler (SC) oda içinde bir solüsyon sabit bir değişimi sağlamak için. Ölçek çubuğu = 1 mm (A ii). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Koronal VNO Tissue dilim. (A) Konfokal görüntü (maksimum projeksiyon) 150 mikron akut koronal VNO doku dilim vomeronasal duyusal epitelinde floresan FPR-RS3 tau-Venüs + nöronların (yeşil) dağılımını gösteren. Kan damarı (BV), lümen (L), duyusal epitel (SE). (B) FPR-RS3 tau-Venüs + nöronlar lümen sınırında bir düğme benzeri bir yapıda biten tek bir apikal dendrit sergilerler. Tüm hücre patch-kelepçe kayıtları VSN soma, yama pipet (PP) yapılmıştır. Uzun ve dar bir dendrit (D) 'ucundaki dendritik topuz (K) ile tek VSN (C) morfolojileri, taban tarafındaki soma ayrılan hücre soma (S) ve akson (A). Ölçek çubukları, 50 um (A), 10 um (B), 5 um (C). Bu rakam 52'den modifiye edilmiştir. TıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 4: İzole voltaj kapılı Na + ve Ca 2+ akımları yanı sıra başak deşarj (A) FPR-RS3 + VSNs bir TTX duyarlı hızlı aktive Na + akımının tüm hücre yama-kelepçe kayıtları Temsilcisi izleri.. Kontrol koşulları altında (A i) Gerilim adım kayıt (ekstrasellüler çözüm S 1; hücre içi çözüm S 4) akım içe voltaj bağımlı hızlı ve geçici ortaya koymaktadır. (A ii) TTX tedavisi (1 uM) kuvvetle akımı azalır. Dijital çıkarılır iz (kontrol-TTX (A iii)) reveTTX duyarlı voltaj kapılı Na + akımını als. Kontrolü ve FPR-RS3 + nöronların izole TTX duyarlı Na + akımlarının akım-gerilim ilişkileri (A iv). (B) Temsilcisi Ca 2 + akım izleri (10 uM nifedipin) farmakolojik izole edilmiştir. (C) / hiperpolarizasyon ve kademeli pozitifliği (C i) ve negatif (C iii) mevcut enjeksiyon üzerine üretilen (geri tepme) aksiyon potansiyelleri trenler de- gösteren temsili akım kelepçe izleri. 0 pA akım enjeksiyon (C ii) ölçülen spontan aktivite unutmayın. (Cı IV) kontrol ve FPR-RS3 + (I enjekte) enjekte akımın bir fonksiyonu olarak nöronların ateşleme frekansıdır. ateşleme hızı kademeli artış kontrolü için benzerve FPR-RS3 + VSNs. VSNs bile düşük picoamperes mevcut enjeksiyonuna zarif duyarlı 53-56 aralığında olduğunu unutmayın. F -I eğrileri 0 pA akım enjeksiyon spontan spike frekansı kullanarak "background-düzeltilmiş" edildiğini unutmayın. Veri ortalama ± SEM vardır. Bu rakam 52'den modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: bazal VSNs gelen Ekstrasellüler 'gevşek yama' kayıtları duyusal epitel bazal tabakasında kayıt pipet gösteren akut VNO doku dilim (A) IR-DIC görüntü.. (B) hücre bağlı konfigürasyonda bir bazal VSN Temsilcisi orijinal kayıt (&# 39; gevşek mühür toplanmış rekombinant olarak ifade edilen başlıca üriner proteinler (rMUPs ile uyarılmalara (3 sn)) ve yükseltilmiş bir potasyum konsantrasyonu (50 mM, 1 sn brifing sivri kısa geçici patlamaları ile yanıt ')), sırasıyla (B i) . (B i) gösterilen kayıtların yüksek büyütme uyarılara (B ii) tepki olarak ani patlamaları göstermektedir. Kırmızı çubuklar stimülasyon arası uyaran aralığı = 30 sn, sürekli kayıt, kesintiler <1 sn (kesme işaretleri //) zamanını gösterir. Ölçek çubuğu = 5 mikron (A). Paneli (A) referans 38 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
VNO Semiokimyasallar tespit eden bir kimyasal-duyusal bir yapıdır. Bugüne kadar, vomeronasal reseptörlerinin çoğunluğu sadece birkaç reseptör-ligand çifti tespit edilmiş olarak deorphanized gerekmektedir. Bunlar arasında, V1rb2 erkek idrar feromon 2-heptanon 30 spesifik olarak aktive edilmesi tanımlanmıştır, V2rp5 erkek belirli feromon ESP1 57 da SYFPEITHI V2r1b ve V2rf2 MHC peptid ile aktive edilecek şekilde aktif hale 48 ve SEIDLILGY 58, sırasıyla. reseptör-ligand ilişkileri ve sinyal iletimini anlamak için bir ön koşuldur yerel ortamda tanımlanan VSN popülasyonlarının biyofiziksel özellikleri bilgidir. Pasif ve aktif membran özellikleri, voltaj kapılı iyon iletkenlikleri ve aksiyon potansiyeli deşarj desenleri reseptör nöronların uyaranlara kimyasal-duyusal tepki hangi araçları ve kapsamını tanımlar. Elektrofizyolojik akut doku dilimleri kayıtları ve özellikle, kimle-hücre patch-kelepçe kayıtları detaylı olarak bu özelliklerini analiz için mükemmel bir yöntem sağlar.
doku dilimleri başarılı ve güvenilir fizyolojik kayıtlar için kritik bir adım hazırlığı kendisidir. deneyler gerçekleştirmek için zaman aralığını en üst düzeye çıkarmak için, doku dilimlenmiş ve hemen diseksiyonu sonrası buz gibi soğuk oksijenli bir çözüm aktarılması gerekir. Bunu takiben, dilimler deneysel günde hücrelerin önemli sayıda birkaç saat izin analiz için muhafaza edilebilir. Bu teşrih ve en az 30 dakika bir hayvanın hem VNOs embed süresini azaltmak için bazı pratik alır. Bundan sonra, canlı hücreler ile birkaç sağlam doku dilimler elde etmek deneyimli bir deneyci başarı oranı iyi% 75 üzerindedir. Patch-kelepçe kayıtları gerçekleştirme Ca 2+ görüntüleme kıyasla düşük verimli deneysel bir yaklaşımdır. Ancak, bu daha yüksek bir zamansal tek-hücre seviyesinde faaliyet daha detaylı ve çok yönlü analiz edilmesine izin verirçözüm. Bütün hücre konfigürasyonunda, hücre içi ortamı pipetle çözeltisi diyaliz edilir. pipet çözüm tam sitozolik kompozisyon yansıtmak olmayabilir iken, Ekstra ve hücre içi iyonik şartlarda hem üzerinde tam kontrolü ile deneyci sağlar. Sonuçların güvenilir yorumlanması için, erişim direnci ve kaçak akım sürekli izlenmesi büyük önem taşımaktadır. Zaman zaman, önemli bir artış ya da erişim direnci güçlü değişim veya uninterpretable sonuçları geçerli yol açar sızıntı ve böylece atılır, bu kayıtlar talep eder. Ayrıca, bazı farmakolojik bileşikler geri dönüşümsüz gerekli her kayıttan sonra dilimleri yerine render bağlanabilen dikkat etmek önemlidir.
Hücre bağlı yapılandırmada kayıt hücre içi bileşenlerin diyaliz önler ve hücrenin membran potansiyelini etkilemez. Bu nedenle, bu teknik, tarama için daha az saldırgan ve nispeten hızlı bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bu onaylamaACH, genellikle hücre zarının dışında süper eşik aksiyon potansiyeli odaklı kapasitif akımları kayıt sınırlıdır. Gevşek yama kayıtları VNO dilimleri 38,54 duyusal nöronların büyük sayılar engelleyici davranışları analiz etmek için uygun olduğu kanıtlanmıştır.
Burada kullanılan transgenik modeli belirlemek ve VSNs ifade FPR-RS3 nüfusa analiz için güvenilir bir araç sağlar. Ayrıca, burada açıklanan teknik ne olursa olsun, genotip diğer hatlara uzatılabilir. transgenik fareler kullanılarak, tanımlanmış bir hücre tipi soruşturma muazzam avantajına rağmen mevcut hatlara deneyler sınırlar. Ancak son zamanlarda, hedeflenen genom düzenleme daha hızlı ve daha uygun fiyatlı CRISPR / Cas9 tekniği 59 ile olmuştur. Sonuç olarak, akut vomeronasal doku dilimler halinde patch-kelepçe kayıtları tanımlanmış populat biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerini karakterize etmek için çok yönlü bir yaklaşım sağlamak hedeflenmişduyu nöronlarının iyonu.
The authors have nothing to disclose.
We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical tools and consumables | |||
Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
Water bath | Memmert | WNB 45 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır