في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.

The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

معظم الحيوانات تعتمد بشكل كبير على الحواس الكيميائية وأثرها على التفاعل مع محيطهم. حاسة الشم ويلعب دورا أساسيا لإيجاد وتقييم المواد الغذائية، وتجنب الحيوانات المفترسة وتحديد شركاء التزاوج مناسبة. في معظم الثدييات، يتكون نظام حاسة الشم لا يقل عن أربعة أنظمة فرعية هامشية تشريحيا ومتميزة وظيفيا: ظهارة الرئيسية حاسة الشم ^1،2، العقدة Grueneberg ^3،4، الجهاز الحاجز من ماسيرا ^5،6 والجهاز الميكعي. تضم VNO هيكل الحسي المحيطي للنظام حاسة الشم الإكسسوارات (الدعم الإداري والتشغيلي)، والذي يلعب دورا رئيسيا في الكشف عن العظة الكيميائية التي تنقل معلومات حول هوية والجنس والطبقة الاجتماعية ودولة الجنسية ^7-10. يقع VNO في قاعدة الحاجز الأنفي الحق فوق الحنك. في الفئران، وهو أنبوب تنتهي أعمى الثنائي المغلقة في كبسولة الغضروفية ^11-13. يتكون الجهاز من كل من epithe الحسية وسطي على شكل هلالlium التي تؤوي في VSNs وجزء غير الحسي على الجانب الوحشي. بين كل من ظهائر يكمن مليئة المخاط التجويف وهذا مرتبط إلى تجويف الأنف عن طريق القناة الميكعي الضيق ^14. والاوعية الدموية الجانبية كبيرة في الأنسجة غير الحسية يوفر آلية ضخ الأوعية الدموية لتسهيل دخول كبيرة نسبيا، والجزيئات ومعظمهم من غير المتطايرة مثل الببتيدات أو بروتينات صغيرة في التجويف VNO من خلال الضغط السلبي ^15،16. المكونات الهيكلية للVNO موجودة عند الولادة والجهاز يصل حجم الكبار قبل سن البلوغ ¹⁷ قريبا. ومع ذلك، ما إذا كان الدعم الإداري والتشغيلي القوارض بالفعل وظيفية في الأحداث لا تزال موضع نقاش ^18-20.

وتتميز VSNs من قبل كل من موقعها الظهارية ونوع من المستقبلات التي تعبر عنها. تظهر VSNs التشكل القطبين مع محور عصبي امياليني والتغصنات قمي واحدة أن يبرز نحو التجويف وينتهي في مقبض الباب شجيري microvillous. VSN الفأسإضافات fasciculate لتشكيل العصب الميكعي أن يترك كبسولة الغضروفية في نهاية ظهراني الذيلية، يصعد على طول الحاجز، يمر لوحة مثقب والمشاريع إلى البصلة الشمية الإكسسوارات (AOB) ^21،22. تتكون الظهارة الحسية الميكعي من طبقتين: تقع طبقة قمي أقرب إلى الجانب اللمعية والموانئ على حد سواء V1R- ولكن كل نوع واحد من FPR-RS، معربا عن الخلايا العصبية. هذه الخلايا العصبية coexpress مجموعة البروتين α-فرعية G _αi2 والمشروع في الجزء الأمامي من AOB ^23-25. الخلايا العصبية الحسية الموجودة في طبقة أكثر القاعدية V2Rs صريحة أو FPR-RS1 جنبا إلى جنب مع مجموعة _αo وترسل المحاور الخاصة بهم إلى المنطقة الخلفية لAOB ^26-28.

ومن المرجح تنشيط الخلايا العصبية الميكعي التي كتبها semiochemicals صغيرة بدلا ^29-33 (V1Rs) أو المركبات البروتينية ^34-38 (V2Rs) التي تفرز في مختلف سوائل الجسم مثل البول واللعاب والسائل المسيل للدموع ^37،39-41 وفي التجارب الموقع قد أظهرت أن VSNs تنشط أيضا الببتيدات formylated ومختلف المضادة للميكروبات / مركبات مرتبطة التهاب ^25،42. وعلاوة على ذلك، أعرب heterologously FPR-RS البروتينات حصة أطياف ناهض مع FPRs أعرب في الجهاز المناعي، مما يشير إلى دور محتمل كما كشف عن لمرض في conspecifics أو المصادر الغذائية الفاسدة ²⁵ (أنظر المرجع ^43).

أساسية لفهم العلاقات مستقبلات يجند وشلالات الإشارات المصب في فئات معينة من السكان VSN هو تقييم مفصل للخصائص الفيزيائية الحيوية الأساسية في بيئة المحلية. في الماضي، وتحليل الإشارات الخلوية قد استفاد كثيرا من الحيوانات المعدلة وراثيا التي تميز مجموعة محددة من الخلايا العصبية التي كتبها coexpressing بروتين علامة فلوري ^30،44-49. في هذا البروتوكول، خط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن FPR-RS3 جنبا إلى جنب مع علامة فلوري (FPR-RS3-ط-الزهرة) ويستخدم.يجسد هذا النهج كيفية توظيف هذا سلالة الماوس المعدلة وراثيا لإجراء تحليل الكهربية من سكان الخلية التعرف بصريا باستخدام الخلايا العصبية واحدة تسجيلات التصحيح المشبك في شرائح الأنسجة VNO الاكليلية الحادة. وضغط يحركها الهواء متعددة برميل نظام نضح للمؤثرات الحسية وكلاء الدوائية يسمح سريع، عكسها والتنسيق تحفيز الخلايا العصبية أو تثبيط خلال التسجيلات. تسجيلات خلية كاملة في الأعمال التحضيرية شريحة تسمح لتحليل مفصل لخصائص ذاتية، المواصلة تنشيط الجهد، فضلا عن اتخاذ إجراءات أنماط التصريف المحتملة في البيئة المحلية للخلية.

وكانت جميع الإجراءات الحيوانية في الامتثال للتشريعات المحلية والاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية (التوجيه 86/609 / EEC) ومع التوصيات التي طرحها الاتحاد من المختبر الأوروبي الحيوان جمعيات العلوم (FELASA). ويضم كل من C57BL / 6 الفئران والجرذان FPR-RS3-ط-الزهرة في مجموعات من كلا الجنسين في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 شهرا ساعة دورة الضوء / الظلام مع الغذاء والماء المتاحة الإرضاع بحسب الرغبة. للتجارب استخدمت صغار البالغين (6-20 أسابيع) من كلا الجنسين. لم يلاحظ أي اختلافات واضحة تعتمد على نوع الجنس.

1. الحل تحضير

1. إعداد الخلية حل S _1: 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-ethanesulfonic حمض (HEPES) مخزنة حل خارج الخلية التي تحتوي على (مم) 145 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 1 CaCl _2، 1 MgCl _2، 10 HEPES. الرقم الهيدروجيني = 7.3 (معدلة مع هيدروكسيد الصوديوم)؛ الأسمولية = 300 ملي أوزمول (معدلة مع الجلوكوز).
2. إعداد extracelluلار حل S _2: المؤكسج كربوجين (95٪ O ₂ و 5٪ CO ₂₎ حل خارج الخلية التي تحتوي على (مم) 125 كلوريد الصوديوم، و 25 NaHCO _3، 5 بوكل، 1 CaCl _2، 1 MgSO _4، 5 BES. الرقم الهيدروجيني = 7.3. الأسمولية = 300 ملي أوزمول (معدلة مع الجلوكوز).
3. إعداد 4٪-التبلور انخفاض درجة الحرارة الحل الاغاروز (S ₃₎ لتضمين الأنسجة: 4٪، التبلور درجات حرارة منخفضة الاغاروز. حل 2 غرام منخفضة التبلور-الاغاروز في 50 مل من S ₁ في زجاجة مختبر الزجاج 100 مل جنبا إلى جنب مع محرك مغناطيسي. لإذابة الاغاروز، ووضع الزجاجة في حمام مائي (مع غطاء لا مغلقة بإحكام) عند 70 درجة مئوية لمدة حوالي 20 دقيقة أو حتى يصبح شفافا الحل مع التحريك. تهدئة والحفاظ على الاغاروز ذاب في حمام مائي الثاني في 42 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
4. إعداد الخلايا حل S _4: ماصة محلول يحتوي على (مم) 143 بوكل، 2 كوه، 1 EGTA، 0.3 CaCl ₂ (مجاني الكالسيوم ²⁺ = 110 نانومتر)، 10 HEPES، 2 MgATP، 1 NaGTP.الرقم الهيدروجيني = 7.1 (معدلة مع KOH)؛ الأسمولية = 290 ملي أوزمول.
5. تعديل / ضبط تشكيل S _1، S ₂ و S ₄ وفقا لتصميم التجارب الفردية (على سبيل المثال، حاصرات الدوائية لعزل أنواع معينة من التيارات تنشيط الجهد).

2. مساحة التحضير

1. ملء بالاكسجين شريحة تخزين غرفة مع S ₂ لا يقل عن 30 دقيقة قبل التشريح، ومكان على الجليد لدرجة الحرارة ودرجة الحموضة تعديل وحل الأوكسجين بشكل مستمر.
2. ملء خزان للsuperfusion شريحة في تسجيل الإعداد مع S ₂ والأوكسجين بشكل مستمر.
3. قبل التشريح، وملء vibratome غرفة مع S ₂ و ترتيب الثلج المجروش في جميع أنحاء الغرفة. بدلا من ذلك، نقل قطع الجليد الباردة حل المؤكسج من بالاكسجين غرفة إلى غرفة vibratome والحفاظ على بالاكسجين بشكل مستمر.
4. ترتيب الأدوات الجراحية والمواد الاستهلاكية.
5. وضع حزمة هلام الجليد تحت تشريحالمجهر، وتغطي مع منشفة ورقية لمنع الأنسجة VNO من تجميد لقاع الطبق.
6. شفرة حلاقة نظيفة من قبل الشطف لفترة وجيزة في 70٪ من الإيثانول والماء المقطر وجبل لvibratome. لاستبدال كل دورة تشريح.

3. VNO تشريح والتضمين

1. التضحية الحيوانية التعرض قصيرة إلى CO ₂ وقطع رأس باستخدام مقص جراحي حادة. ملاحظة: مع مرور الوقت من التضحية الحيوانية لوضع كبسولة VNO على الجليد أمر بالغ الأهمية، تقليل الوقت إلى أقل من 2 دقيقة. للمحافظة على سلامة الأنسجة، وتضمين كل من VNOs تشريح كامل في الاغاروز في أقل من 30 دقيقة.
2. إزالة الفك السفلي مع مقص جراحي كبير. أدخل من خلال تجويف الفم وقطع عظام الفك السفلي وعضلات كل جانب على حدة.
3. ضع الجزء المتبقي من رأس رأسا على عقب في طبق بتري كبير.
4. سحب بعيدا الجلد من الفك العلوي وحول غيض من الأنف مع ملقط المتوسطة للحصول على فرص أفضل للوصول إلىالقواطع.
5. استخدام مقص العظام إلى قطع الجزء الأكبر من القواطع في ~ 45 درجة زاوية في اتجاه منقاري (الشكل 1A). وسوف يخفف هذا إزالة الكبسولة VNO من تجويف الأنف.
   ملاحظة: لا قطع لجذور الأسنان لمنع الأضرار التي لحقت غيض من كبسولة VNO.
6. الاستيلاء على الحنك العلوي جامدة في جزء منقاري مع ملقط المتوسطة وقشر مرة أخرى بعناية في قطعة واحدة في كل زاوية مسطحة (الشكل 1B).
   ملاحظة: شطف مرارا وتكرارا مع الثلج البارد S _2.
7. استخدام مقص الربيع الصغيرة لخفض الانصهار عظمي بين غيض من العظام الميكعة والفك. إدراج نصائح مقص مع الجزء المنحني من طرف لافتا إلى الخارج بعيدا عن VNO وبعناية قطع العظام في خطوات صغيرة على كل من اليسار والجانبية الجانب الأيمن إلى كبسولة VNO.
8. لإزالة كبسولة VNO، استخدم مقص الربيع الصغيرة إلى قطع طريق العظام الميكعة في الجزء الذيلية ورفع بعناية العظام الميكعة من نعسل تجويف باستخدام ملقط المتوسطة. على الفور نقل VNO إلى طبق بتري صغيرة تحت المجهر ستيريو على حزمة هلام الجليد حيث سيتم تنفيذ الخطوات المتبقية من تشريح.
9. شطف VNO في كمية صغيرة من الجليد الباردة S ₂ لمنع الأنسجة من الجفاف.
10. فصل كبسولات الغضروفية التي تحتوي على الأنسجة VNO الناعمة عن طريق الاستيلاء على الجزء الخلفي من العظام الميكعة مع ملقط المتوسطة. ضع كبسولة للحصول على عرض ظهري بحيث انقسام بين كلا VNOs تصبح مرئية (1D الشكل _الأول).
11. استخدام غيض من ملقط غرامة لفصل كل من الغضروف كبسولات VNO من العظم المركزي مع الحفاظ على العظام الميكعة تمركزها في الجزء الخلفي.
    ملاحظة: استخدام ملقط فقط على حافة الكبسولة الغضروف ويكون حريصا جدا على ألا يخترق من خلال الغضروف كما تلف الظهارة الحسية الحساسة بسهولة.
12. مرة واحدة يتم فصل VNOs اثنين، بدء إزالة الغضروف التغليف التنوبر VNO.
13. الاستيلاء على حافة العليا للكبسولة واحدة مع غرامة ملقط وانفصل الجدار الغضروف الذي كان يعلق سابقا إلى العظام الميكعة (الجانب الإنسي).
14. لإزالة ما تبقى الغضروف تحويل VNO مع الجانب الوحشي منحني لأسفل الطبق وآمن دبوس أسفل الغضروف على جانب واحد باستخدام ملقط. بعناية نقل ملقط غرامة الثانية من الجانب الخلفي في زاوية مسطحة جدا بين الغضروف وVNO لتخفيف اتصال بين الأنسجة والغضاريف.
15. ببطء قشر VNO بعيدا عن غضروف بوضعها في طرف الذيلية لها، لتجنب إلحاق الضرر الظهارة الحسية.
16. بمجرد أخرج من VNO من الكبسولة، تأكد من إزالة جميع أجزاء الغضاريف الصغيرة المتبقية عن أي القطع المتبقية من الغضروف وفصل الأنسجة المحيطة من الاغاروز أثناء عملية التقطيع.
17. وضع قطرة صغيرة من الجليد الباردة S ₂ في أول VNO تشريح لمنع تلف الأنسجة. وعاء دموي كبير على فيل الجانب الوحشيل تصبح مرئية مشيرا إلى أن الجهاز لا يزال قائما ولم يتضرر بشكل فادح أثناء تشريح (الشكل 2A _{الثاني).} في حالة الأوعية الدموية حصلت اضرار، فإنه لا يزال من المفيد الاستمرار في تشريح VNO طالما انها لم تضعف التشكل العام بشكل واضح مع.
18. على الفور تشريح VNO الثاني.
19. لتضمين VNOs، وملء كل من أطباق بتري الصغيرة لحافة مع S ذاب ₃ (المخزنة في حمام مائي عند 42 درجة مئوية، وانظر 1.3).
20. عقد VNO في نهاية الذيلية أوسع مع ملقط غرامة لتجنب الأضرار التي لحقت ظهارة حسية.
21. تزج VNO في الاغاروز وتحريكه أفقيا ذهابا وإيابا عدة مرات لإزالة الفيلم من حل خارج الخلية، وكذلك أي فقاعات الهواء من سطحه.
22. ضع VNO عموديا مع طرف الذيلية التي تواجه قاع الطبق. بدلا من معسر VNO مع ملقط مباشرة، وضبط التوجه عن طريق تحريك طرف الملقط في proximi قريبتي واي لVNO.
    ملاحظة: اتجاه خلال تضمين أمر بالغ الأهمية لأنه يحدد الطائرة شريحة والوصول إلى الخلايا العصبية الحسية أثناء التجربة.
23. وضع الأطباق على كيس من الثلج هلام والانتظار حتى عزز الاغاروز.
    ملاحظة: لا تغيير اتجاه VNO مرة واحدة بدأت الاغاروز ترسيخ حيث سيؤدي ذلك إلى فصل الأنسجة من الاغاروز المحيطة بها.

4. الاكليل VNO الأنسجة التقطيع

1. استخدام ملعقة صغيرة لإزالة كتلة الاغاروز من صحن صغير في غطاء من طبق بتري كبير، والوجه الاغاروز رأسا على عقب مغادرة طرف الذيلية من VNO التي تواجه صعودا.
2. خفض كتلة في شكل هرمي باستخدام مشرط جراحي (3-4 ملم على الحافة، 8-10 ملم في الأسفل). الحرص على عدم تلف الأنسجة جزءا لا يتجزأ.
3. استخدام سوبر الغراء لإصلاح كتلة على شكل هرم من وسط لوحة العينة vibratome والانتظار ~ 1 دقيقة للالغراء لتجف تماما.
4. نقل لوحة عينة لتشريح جهامبر وإعداد VNO الثاني، وفقا لذلك. حافظ على لوحة مع العينة الثانية في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
5. استخدام تهتز مشراح شفرة مع الإعدادات التالية: سمك: 150-200 ميكرون. السرعة: 3.5 او = 0.15 ملم / ثانية؛ تردد: 7.5 او = 75 هرتز. نقل شرائح لبالاكسجين الغرفة حتى استخدامها بعد تفقده لفترة وجيزة شريحة التشكل تحت المجهر تشريح. شرائح يمكن أن تبقى لعدة ساعة.

5. وحيد الخلية تسجيلات الكهربية

1. للحصول على تسجيلات، استخدم تستقيم المرحلة الثابتة المجهر مجهزة أهداف الغمر بالماء، Dodt أو الأشعة تحت الحمراء التفاضلية التدخل النقيض (IR-DIC)، وبرنامج التحصين الموسع ومضان فضلا عن تبريد لاتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا. للحصول على البيانات، واستخدام مكبر للصوت التصحيح، المشبك، ومرحلة الرأس، AD / DA واجهة المجلس وجهاز كمبيوتر (بما في ذلك برنامج تسجيل).
2. إعداد المخزون من 10-20 ماصات التصحيح (4-7 MΩ). ماصات سحب من الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج (1.50 مم OD / 0.86 ملم ID) النقيبالجا مجتذب micropipette والنار-البولندية مع microforge.
   ملاحظة: حريق تلميع نصائح ماصة أمر بالغ الأهمية عندما ترميم VSNs صغيرة نوعا ما. وهذا سوف يساعد على منع تمزق غشاء الخلية عند تطبيق الضغط السلبي من أجل الحصول على ختم مقاومة عالية. بعد تلميع افتتاح ماصة ينبغي أن يكون حوالي 1 ميكرون.
3. حافظ على ماصات في جرة تخزين ماصة لمنع الضرر وتراكم الغبار حتى الاستخدام.
4. إعداد نظام نضح عن طريق ملء خزانات حل وأنابيب وفقا لتصميم تجريبي.
   ملاحظة: إزالة فقاعات الهواء من الأنابيب تماما لأنها سوف تتدخل بقوة مع التسجيلات الكهربية.
5. ضبط ضغط لتحقيق ~ 3 تدفق مل / دقيقة.
   ملاحظة: سوف ضغوط عالية تسبب حركة شريحة الأنسجة وكذلك إنهاء التسجيلات الكهربية.
6. نقل VNO شريحة إلى غرفة التصوير وتحديد موقف شريحة باستخدام مرساة الفولاذ المقاوم للصدأ سلكية مع 0.1 ملم synt سميكةالألياف hetic (الشكل 2B - C).
   ملاحظة: لا تغطي شريحة الأنسجة مع واحد من المواضيع الألياف الاصطناعية وإنما الاغاروز المحيطة شريحة.
7. غرفة التصوير نقل إلى تسجيل الإعداد وشريحة superfuse مستمر مع S الاوكسيجين ₂ في درجة حرارة الغرفة عن طريق تطبيق الحمام.
8. ضبط الشعرية الشفط لسطح لإيجاد حل شفط بطيئة لتبادل مستمر للحل حمام. ضبط 8 في 1 متعددة برميل "قلم رصاص نضح" أعلاه وعلى مقربة من الجزء غير الحسي للشريحة VNO التي تحتوي على الأوعية الدموية (الشكل 2C، 3A) ^50. وسوف يكون من المفيد لترتيب قلم نضح وتسجيل ماصة ليكون التي تواجه شريحة من اتجاهين متعاكسين.
9. ربط الكهربائي إشارة وحل حمام باستخدام جسر أغار على شكل حرف L (مليئة 150 ملي بوكل).
10. ملء ماصة التصحيح مع الحل ماصة S _4.
11. جبل ماصة على المغلفة كلوريد الفضة التصحيح الكهربائي الموصل إلى مرحلة الرأس دون كشط الطلاء ونعلق بحزم.
12. تطبيق ضغط إيجابي طفيف (حوالي 1 مل على حقنة بلاستيكية 10 مل) إلى ماصة التصحيح قبل دخول الحمام.
13. انخفاض ماصة في الحمام باستخدام المتلاعبين الجزئي بعيدا بما فيه الكفاية لتكون قادرة على غمر الهدف دون ضرب عليه (الشكل 2D).
14. مراقبة مقاومة ماصة (R _نقطة، بين 4-7 MΩ) باستخدام برنامج الكهربية المتصلة مرحلة الرأس.
    ملاحظة: إذا كان R _النقطة هي <4 MΩ طرف الزجاج المكسور. إذا R _النقطة هي> 10 MΩ، وعلى الأرجح انسداد طرف ويجب أن يتم استبدال ماصة.
15. تصور شريحة VNO مع كاميرا CCD باستخدام النقيض تدخل الفرق الأشعة تحت الحمراء الأمثل (DIC) وتحديد FPR-RS3-ط-فينوس معربا عن الخلايا (أو بالمثل الخلايا العصبية المسماة) باستخدام الإضاءة مضانوعامل تصفية مكعب المناسب.
16. التركيز والفلورسنت الهدف أو الخلايا غير الفلورسنت اعتمادا على التصميم التجريبي.
17. الاقتراب من خلايا الجسم، واستخدام عجلات اليد لأقصى قدر من الحساسية. بسبب ضغط إيجابي، دنت صغير في غشاء الخلية سوما تصبح مرئية مرة واحدة غيض ماصة على مقربة.
18. الافراج عن الضغط الايجابي وتطبيق ضغط سلبي طفيف لتمتص في غشاء الخلية من أجل الحصول على ختم مقاومة عالية (1-20 GΩ). تطبيق شفط قصيرة ورقيقة لتعطيل غشاء الخلية وإنشاء تكوين خلية كاملة.
19. رصد المقاومة وصول باستمرار خلال التجربة.
    ملاحظة: تشمل فقط الخلايا العصبية واظهار المقاومة وصول الصغيرة ومستقرة (≤3٪ من R _{المدخلات؛} التغيير <20٪ خلال التجربة) في التحليل.

للحصول على نظرة ثاقبة الخصائص الفيزيائية الحيوية والفسيولوجية للسكان الخلية المحددة، ونحن أداء شرائح الأنسجة الاكليلية الحادة من الفأرة VNO (الشكل 1-2). بعد التشريح، وشرائح يمكن أن تبقى في الجليد الباردة حل خارج الخلية الاوكسيجين (S ₂₎ لعدة ساعة. في الإعداد التسجيل، تبادل مستمر مع حل الاوكسيجين الطازجة (الشكل 2D) يضمن بقاء الأنسجة في كافة مراحل التجربة. نحن هنا استخدام نموذج الفأر وراثيا (FPR-RS3-ط-الزهرة). VSNs في هذه السلالة coexpress بروتين علامة فلوري مع FPR-RS3، عضو تنميط الأسرة الجينات FPR-RS (الشكل 3) تساعد في تحديد البصرية من مجموعة محددة من الخلايا العصبية الحسية. توفر التسجيلات الكهربية وسيلة لتحليل متعمق على مستوى خلية واحدة. على سبيل المثال، يتم تنفيذ تحليل التيارات بوابات الجهد في التيار الكهربائي المشبك وضع (الشكل 4A - B). لعزل أنواع معينة من التيارات الأيونية، وsuperfused شرائح مع وكلاء الدوائية مثل TTX لمنع التيارات الجهد بوابات نا ⁺ (الشكل 4A) أو النيفيديبين لمنع الجهد بوابات L من نوع كا ²⁺ التيارات (الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، ونحن أداء روتيني تسجيلات خلية كاملة في تكوين المشبك الحالي لتحليل عمل أنماط التصريف المحتملة (الشكل 4C). بالإضافة إلى تسجيلات خلية كاملة، توفر التسجيلات المرفقة الخلية فضفاضة ختم 'وسيلة أقل الغازية التي تمنع غسيل الكلى من مكونات الخلايا (الشكل 5A). إجراءات تسجيل التيارات بالسعة بناء على طلب من الحوافز قصيرة مدفوعة إمكانات توفر وسيلة حساسة وفعالة للكشف عن بروابط الحسية (مثل البروتينات البولية الرئيسية؛ MUPs) التي تنشط السكان من خلايا ⁵¹ (الشكل 5B) المعرفة.

= "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 1: تشريح VNO. (أ) الجانب الشخصي على رأسه الماوس لتوضيح الموقف والزاوية التي يتم قطع القواطع. (ب) عرض بطني تصور أفضل نقطة للاستيلاء على وقشر العودة الحنك العلوي (UP). (C) عرض بطني على الغضروف كبسولة (CC) التي تؤوي في VNO والعظام الميكعة (VB) بعد إزالة الفك السفلي، القواطع والحنك. عرض (D) الظهرية من الكبسولة VNO تشريح تصور توطين الثنائي من كلا VNOs (د _ط). ويوضح وجهة النظر الجانبي حافة الغضروف على الجانب الظهري حيث تحتاج إلى كل VNOs لا بد من فصل (د _ب). مقياس شريط = 1 ملم (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إعداد الأنسجة، غرفة تسجيل ومرحلة المجهر جهة النظر الجانبي تخطيطي على VNO لتوضيح المسار والموقف من الأوعية الدموية الكبيرة (BV) في الجزء غير الحسية من الظهارة (A _ط). يمثل خط متقطع طبقة تشريح الاكليلية. عرض الوحشي على VNO مقشر من CC يظهر الأوعية الدموية (A _ب). (ب) الاغاروز جزءا لا يتجزأ من الاكليلية VNO شريحة الأنسجة ثابتة إلى أسفل غرفة تسجيل مليئة الحل باستخدام مرساة الفولاذ المقاوم للصدأ سلكية مع 0.1 مم سميكة من الألياف الاصطناعية (SF) المواضيع. منطقة محاصر يصور الاغاروز المحيطة شريحة الأنسجة. (C) عرض تخطيطي يوضح الموقف والتوجه لالاغاروز (حج) -embedded الاكليلية شريحة VNO وضعه بين ألياف. (D) لمحة عن غرفة تسجيل وضعت على المسرح المجهر. تم تجهيز الغرفة مع تطبيق الحمام (BA) لsuperfusion المستمر مع المؤكسج S _2، وقلم رصاص نضح (PP) لتطبيق محفزات الحسية أو وكلاء الدوائية، ماصة تسجيل (RP) متصلة إلى مرحلة رئيس مكبر للصوت، القطب المرجعية (RE ) وشعري شفط (SC) للحفاظ على التبادل المستمر للحل في الغرفة. مقياس شريط = 1 ملم (A _ب). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): TISS VNO الاكليلرق شريحة (أ) صورة متحد البؤر (بحد أقصى الإسقاط) من الاكليلية شريحة الأنسجة VNO الحادة 150 ميكرون تبين توزيع الفلورسنت FPR-RS3 تاو فينوس ⁺ الخلايا العصبية (الأخضر) في الميكعي الظهارة الحسية. الأوعية الدموية (BV)، التجويف (L)، ظهارة حسية (جنوب شرق). (ب) FPR-RS3 تاو فينوس ⁺ الخلايا العصبية تبدي التغصنات قمي احدة تنتهي في بنية تشبه مقبض الباب على الحدود اللمعية. أجريت خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك من سوما VSN، والتصحيح ماصة (PP). (ج) علم الصرف من VSN واحد مع مقبض شجيري (K) في غيض من التغصنات طويلة وضيقة (D)، سوما الخلية (S) ومحور عصبي (A) ترك سوما في الجانب القاعدي. الحانات نطاق 50 ميكرون (A)، و 10 ميكرون (B)، 5 ميكرون (C). تم تعديل هذا الرقم من ^52. الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: عزل الجهد بوابات نا ⁺ والكالسيوم ²⁺ التيارات وكذلك تصريف سنبلة (أ) آثار التمثيلية من خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك لتفعيل سريع نا ⁺ الحالية الحساسة TTX في FPR-RS3 ⁺ VSNs. (A _ط) تسجيل خطوة الجهد في ظل ظروف التحكم (حل خارج الخلية S _1؛ الخلايا حل S ₄₎ يكشف تعتمد على الجهد عابر سريع والباطنة الحالي. (A _ب) العلاج TTX (1 ميكرومتر) يقلل بشدة الحالية. طرح رقميا أثر (ضبط TTX (A _ج)) ريفALS وTTX تراعي الجهد بوابات نا ⁺ الحالية. العلاقات الحالية الجهد من التيارات نا ⁺ TTX الحساسة معزولة عن السيطرة والجبهة الوطنية الرواندية-RS3 ⁺ الخلايا العصبية (A _د). (ب) الممثل الكالسيوم ²⁺ آثار الحالية معزولة دواء (10 ميكرومتر نيفيديبين). (C) التمثيلية آثار المشبك الحالي تظهر اجتثاث / فرط الاستقطاب والقطارات من إمكانات (انتعاش) العمل المتولدة على ايجابي تدريجي (C _ط) والسلبية (C _ج) حقن الحالي. لاحظ النشاط العفوي قياس في 0 السلطة الفلسطينية حقن الحالي (C _{الثاني).} (ج _د) تردد إطلاق النار من السيطرة والجبهة الوطنية الرواندية-RS3 ⁺ الخلايا العصبية بوصفها وظيفة للتيار حقن (أنا _حقن). الزيادة التدريجية في اطلاق معدل مشابه للسيطرةوFPR-RS3 ⁺ VSNs. لاحظ أن VSNs حساسون بشكل رائع لحقن الحالية حتى في picoamperes منخفضة تتراوح ^53-56. لاحظ أن منحنيات -I و تم "خلفية تصحيح" باستخدام تردد ارتفاعه عفوية في 0 السلطة الفلسطينية حقن الحالي. البيانات هي وسائل ± SEM. تم تعديل هذا الرقم من ^52. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: خارج الخلية التسجيلات "التصحيح فضفاضة" من ​​VSNs القاعدية (أ) صورة IR-مدينة دبي للإنترنت من شريحة الأنسجة VNO الحادة التي تصور ماصة تسجيل في الطبقة القاعدية من الظهارة الحسية. (ب) التسجيل الأصلي ممثل لVSN القاعدية في تكوين الخلية المرفقة (&# 39؛ فضفاضة ختم ') الاستجابة مع رشقات نارية عابرة قصيرة من المسامير لاطلاع التحفيز (3 ثانية) مع تجمع أعرب recombinantly البروتينات البولية الكبرى (rMUPs) وتركيز البوتاسيوم مرتفعة (50 ملم، 1 ثانية)، على التوالي (ب _ط) . تضخم أعلى من التسجيلات هو مبين في _(ط ب) يوضح رشقات نارية من المسامير ردا على التحفيز (ب _ب). أشرطة حمراء تشير إلى الوقت من التحفيز، بين التحفيز الفاصل = 30 ثانية، وتسجيل مستمر، انقطاع <1 ثانية (قطع علامات //). شريط مقياس = 5 ميكرون (A). تم تعديل لوحة (أ) من إشارة ^38. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وVNO هو بنية حسي كيميائي التي يكشف semiochemicals. حتى الآن، لا تزال غالبية من المستقبلات الميكعي إلى أن deorphanized كما تم تحديدها فقط بضعة أزواج مستقبلات يجند. من بين هؤلاء، وقد وصفت V1rb2 لتفعيلها على وجه التحديد من قبل الذكور فرمون البول 2-heptanone ^30، V2rp5 لتفعيلها من قبل الذكور فرمون معين ESP1 ⁵⁷ وكذلك V2r1b وV2rf2 لتفعيلها من خلال الببتيدات MHC SYFPEITHI ⁴⁸ و SEIDLILGY ^58، على التوالي. ومن الشروط الأساسية لفهم العلاقات يجند مستقبلات ونقل الإشارة هو معرفة الخصائص الفيزيائية الحيوية للسكان VSN محددة في بيئة المحلية. خصائص الغشاء السلبية والإيجابية، المواصلة الأيونية بوابات الجهد والعمل المحتملين أنماط التصريف تحدد الوسائل ومدى الخلايا العصبية مستقبلات تستجيب لحسي كيميائي المحفزات. التسجيلات الكهربية في شرائح الأنسجة الحادة و، على وجه الخصوص، الذينتوفر جنيه الخلية التسجيلات المشبك التصحيح وسيلة ممتازة لتحليل هذه الخصائص بقدر كبير من التفصيل.

خطوة مهمة للتسجيلات الفسيولوجية ناجحة ويمكن الاعتماد عليها في شرائح الأنسجة المستحضر ذاته. لتحقيق أقصى قدر من فترة زمنية لإجراء تجارب، يجب شرائح الأنسجة ونقل إلى حل الاوكسيجين المثلج مباشرة بعد تشريح. وبعد ذلك، شرائح يمكن أن تبقى لعدة ساعة تسمح بتحليل عدد كبير من الخلايا لكل يوم تجريبي. الأمر يحتاج إلى بعض الممارسات للحد من وقت لتشريح وتضمين كل من VNOs من حيوان واحد في أقل من 30 دقيقة. بعد ذلك، فإن نسبة النجاح لمجرب من ذوي الخبرة للحصول على عدة شرائح أنسجة سليمة مع خلايا قابلة للحياة هو أعلى بكثير من 75٪. أداء تسجيلات التصحيح المشبك هو المنهج التجريبي-الإنتاجية منخفضة بالمقارنة مع التصوير الكالسيوم ^2+. بعد ذلك، فإنه يسمح تحليل أكثر تفصيلا وتنوعا من النشاط على مستوى وحيدة الخلية مع الزمانية أعلى من ذلك بكثيرالقرار. في تكوين خلية كاملة، ومدال المتوسط ​​داخل الخلايا بواسطة الحل ماصة. في حين قد لا يعكس حل ماصة تكوين عصاري خلوي بالضبط، لأنها توفر مجرب مع التحكم الدقيق على كل الظروف الأيونية من خارج وداخل الخلايا. لتفسير موثوق من النتائج، والمتابعة المستمرة من المقاومة وصول وتسرب الحالية أمر بالغ الأهمية. في بعض الأحيان، زيادة كبيرة أو تغير قوي في مقاومة الوصول أو تسرب يؤدي إلى نتائج الحالية uninterpretable وبالتالي تتطلب هذه التسجيلات التي يمكن الاستغناء عنها. وعلاوة على ذلك، من المهم أن نلاحظ أن بعض المركبات الدوائية ربط تقديم بشكل لا رجعة فيه من الضروري استبدال شرائح بعد كل تسجيل.

تسجيل في تكوين الخلية المرفقة يمنع غسيل الكلى من مكونات الخلايا ولا تؤثر على غشاء المحتملة للخلية. وبالتالي، توفر هذه التقنية وسيلة أقل الغازية وسريعة نسبيا من الفرز. ومع ذلك، هذا APPROمنظمة العمل ضد الجوع تقتصر عادة على تسجيل فائقة عتبة إجراءات التي تضعها إمكانية التيارات بالسعة من خارج غشاء الخلية. وقد أثبتت التسجيلات فضفاضة التصحيح لتكون مناسبة لتحليل السلوك ارتفاعه أعداد أكبر من الخلايا العصبية الحسية في شرائح VNO ^38،54.

نموذج المعدلة وراثيا المستخدمة هنا يوفر أداة يمكن الاعتماد عليها لتحديد وتحليل سكان FPR-RS3 معربا عن VSNs. وعلاوة على ذلك، فإن تقنية وصفها هنا يمكن أن تمتد إلى خطوط أخرى بغض النظر عن التركيب الوراثي بهم. وعلى الرغم من ميزة هائلة من التحقيق في نوع من الخلايا المحددة، وذلك باستخدام الفئران المعدلة وراثيا يحد من التجارب لخطوط المتاحة. في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، فقد أصبحت مستهدفة تحرير الجينوم أسرع وأكثر بأسعار معقولة مع كريسبر / Cas9 تقنية ^59. في الختام، استهدفت تسجيلات التصحيح المشبك في شرائح الأنسجة الميكعي الحادة توفر نهجا متعدد الاستعمالات لوصف الخصائص الفيزيائية الحيوية والفسيولوجية للتعريف populatأيون من الخلايا العصبية الحسية.

The authors have nothing to disclose.

We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.