Method Article
Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.
In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.
La plupart des animaux comptent beaucoup sur leurs sens chimiques pour interagir avec leur environnement. Le sens de l'odorat joue un rôle essentiel pour la recherche et l'évaluation des aliments, éviter les prédateurs et la recherche de partenaires d'accouplement appropriés. Dans la plupart des mammifères, le système olfactif est constitué d'au moins quatre sous - systèmes anatomiquement et fonctionnellement distincts périphériques: l'épithélium olfactif principal 1,2, 3,4 ganglion Grueneberg, l'organe septale Masera 5,6 et l'organe voméronasal. Le VNO comprend la structure sensorielle périphérique du système olfactif accessoire (AOS), qui joue un rôle majeur dans la détection des signaux chimiques qui transmettent des informations sur l' identité, le sexe, le rang social et de l' état sexuel 7-10. Le VNO est situé à la base de la cloison nasale juste au-dessus du palais. Chez la souris, il est un tube borgne se terminant bilatéral enfermées dans une capsule cartilagineuse 13/11. L'organe se compose de deux un épithélium sensoriel médial en forme de croissantlium qui abrite les VSN et d'une partie non-sensorielle sur le côté latéral. Entre les deux épithéliums se trouve une lumière de mucus rempli qui est relié à la cavité nasale par l'intermédiaire du voméronasal canal étroit 14. Un grand vaisseau sanguin latéral dans le tissu non-sensorielle fournit un mécanisme de pompage vasculaire pour faciliter l' entrée des molécules relativement grandes, essentiellement non volatiles , tels que des peptides ou de petites protéines dans la lumière à travers VNO pression négative 15,16. Les composants structurels du VNO sont présents à la naissance et l'organe atteint la taille adulte , peu avant la puberté 17. Toutefois, si l'AOS de rongeur est déjà fonctionnelle chez les juvéniles est encore sujette à débat 18-20.
VSN se distinguent à la fois par leur localisation epitheliale et du type de récepteur qu'elles expriment. VSN présentent une morphologie bipolaire avec un axone non myélinisées et un seul dendrite apicale qui fait saillie vers la lumière et se termine par un bouton microvillositaire dendritique. VSN axons fasciculate pour former le nerf voméronasal qui laisse la capsule cartilagineuse à la fin dorso-caudale, monte le long du septum, passe la lame criblée et les projets vers le bulbe olfactif accessoire (AOB) 21,22. L'épithélium sensoriel voméronasal se compose de deux couches: la couche apicale est située plus près du côté luminal et les deux ports V1R- et tous sauf un type de FPR-rs-exprimant les neurones. Ces neurones coexpriment du G-protéine α-unité Gai2 et projet à la partie antérieure de l'AOB 23-25. Les neurones sensoriels situés dans les V2Rs express de la couche basale plus ou TFP-RS1 aux côtés G et ao envoient leurs axones dans la région postérieure de l'AOB 26-28.
Les neurones sont susceptibles voméronasal activés par plutôt petits (29-33 sémiochimiques V1Rs) ou les composés protéiniques (34-38 V2Rs) qui sont sécrétées dans divers fluides corporels tels que l' urine, la salive et le fluide se déchirent 37,39-41 . Dans les expériences in situ ont montré que VSN sont également activés par des peptides formylés et divers / inflammation liée à des composés antimicrobiens 25,42. En outre, hétérologue exprimé les protéines du FPR-rs partagent des spectres agonistes avec FPRS exprimés dans le système immunitaire, ce qui indique un rôle potentiel en tant que détecteurs pour la maladie dans leurs congénères ou sources alimentaires gâtés 25 (voir référence 43).
Fondamental pour la compréhension des relations de récepteur-ligand et des cascades de signalisation en aval des populations VSN spécifiques est une évaluation détaillée de leurs caractéristiques biophysiques de base dans un environnement natif. Dans le passé, l'analyse de la signalisation cellulaire a grandement bénéficié d'animaux génétiquement modifiés qui marquent une population définie de neurones par coexpression d' une protéine marqueur fluorescent 30,44-49. Dans ce protocole, une lignée de souris transgénique qui exprime FPR-RS3 conjointement avec un marqueur fluorescent (Fpr-RS3-i-Venus) est utilisé.Cette approche illustre comment utiliser une telle souche de souris génétiquement modifiées pour effectuer une analyse électrophysiologique d'une population de cellules optiquement identifiable à l'aide unique neurone patch-clamp enregistrements dans des tranches de tissu VNO coronales aiguës. Une pression axée sur l'air système de perfusion multi-corps pour des stimuli sensoriels et agents pharmacologiques permet la stimulation neuronale rapide, réversible et focale ou inhibition pendant les enregistrements. enregistrements de cellules entières dans des préparations de tranche permettent une analyse détaillée des propriétés intrinsèques, conductances de tension activé, ainsi que les modes de décharge potentiels d'action dans l'environnement natif de la cellule.
Toutes les procédures animales étaient en conformité avec la législation locale et l'Union européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales (directive 86/609 / CEE) et des recommandations formulées par la Fédération des animaux de laboratoire Associations Européennes de Sciences (FELASA). Les deux souris C57BL / 6 et souris Fpr-RS3-i-Vénus ont été logés dans des groupes des deux sexes à la température ambiante sur un 12 h cycle lumière / obscurité avec de la nourriture et de l' eau ad libitum. Pour les expériences de jeunes adultes (6-20 semaines) des deux sexes ont été utilisés. Aucune différence entre les sexes dépendant évidentes ont été observées.
1. Préparation de la solution
2. Espace de travail Préparation
3. VNO Dissection and Embedding
4. Coronal VNO Tissue Slicing
5. unicellulaires électrophysiologiques Recordings
Pour mieux comprendre les propriétés biophysiques et physiologiques des populations cellulaires définies, nous effectuons des coupes de tissu coronales aiguës de la souris VNO (Figure 1 - 2). Après dissection, les tranches peuvent être conservés dans oxygénée solution extracellulaire glacée (S 2) pour plusieurs heures. A la configuration de l' enregistrement, un échange constant avec une solution oxygénée frais (figure 2D) assure la viabilité des tissus tout au long de l'expérience. Nous employons ici un modèle de souris transgénique (TFP-RS3-i-Vénus). VSN dans cette souche coexprimer une protéine marqueur fluorescent avec FPR-RS3, un membre prototypique de la famille des gènes du FPR-rs (Figure 3) permettant une identification optique d'une population définie de neurones sensoriels. Les enregistrements électrophysiologiques fournissent les moyens pour une analyse en profondeur au niveau d'une seule cellule. Par exemple, l'analyse des courants de voltage-dépendants est effectuée en voltage-clampMode (figure 4A - B). Pour isoler des types spécifiques de courants ioniques, les tranches sont perfusées avec des agents pharmacologiques tels que la TTX à inhiber les courants de voltage-dépendants de Na + (figure 4A) ou la nifedipine pour bloquer voltage-dépendants de type L Ca2 + courants (figure 4B). De plus, nous effectuons régulièrement des enregistrements de cellules entières dans la configuration de pince de courant pour analyser les modèles de décharge potentiels d'action (figure 4C). En plus des enregistrements de cellules entières, des enregistrements cellule attachée »lâche-joint» fournissent une méthode moins invasive qui empêche la dialyse des composants intracellulaires (figure 5A). Potentiel conduit d'action Enregistrement courants capacitifs lors de l' application à court stimulus offre un moyen sensible et efficace pour dépister les ligands sensoriels (par exemple, les principales protéines urinaires; SPMI) qui activent des populations de cellules 51 (figure 5B) définis.
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Figure 1: Dissection du VNO. (A) Vue latérale sur la tête de la souris pour illustrer la position et l' angle auquel les incisives sont coupées. (B) Vue ventrale représentant le meilleur point de saisir et de peler le palais supérieur (UP). (C) Vue ventrale sur le cartilage capsule (CC) qui abrite le VNO et l'os vomer (VB) après avoir enlevé les faibles mâchoires, les incisives et les palais. Vue (D) Dorsale de la capsule VNO disséqués représentant la localisation bilatérale des deux VNO (D i). La vue latérale illustre le rebord du cartilage sur la face dorsale où les deux VNO doivent être séparés (D II). Barre d' échelle = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Préparation des tissus, la chambre et le stade de microscope enregistrement vue latérale schématique sur un VNO pour illustrer le cours et la position du gros vaisseau sanguin (BV) dans la partie non-sensorielle de l'épithélium (A i). La ligne pointillée représente la couche de coupe coronale. Vue latérale sur une VNO pelé hors de la CC montre le vaisseau sanguin (A II). (B) Agarose incorporé coronale tranche de tissu VNO fixé au fond de la chambre d'enregistrement solution remplis à l' aide d' une ancre en acier inoxydable câblé avec 0,1 mm d' épaisseur en fibres synthétiques (SF) des fils. La zone encadrée représente l'agarose entourant la tranche de tissu. (C) Vue schématique illustrant la position et l'orientation d'un agarose (Ag) -embedded coronale tranche VNO positionné entre deux fibres. (D) Vue d'ensemble de la chambre d'enregistrement placé sur la platine du microscope. La chambre est équipée d'application de bain (BA) pour surfusion constante avec S 2, le crayon de perfusion oxygéné (PP) pour appliquer des stimuli sensoriels ou des agents pharmacologiques, la pipette d'enregistrement (RP) connecté à l'étage de tête de l' amplificateur, l'électrode de référence (RE ) et le capillaire d'aspiration (SC) afin de maintenir un échange constant de la solution dans la chambre. Barre d' échelle = 1 mm (A ii). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: tiss VNO coronalesue tranche. (A) d'image confocale (projection maximum) d'un coronale tranche de tissu aiguë VNO 150 um montrant la répartition des tau-Vénus + neurones FPR-RS3 fluorescent (vert) dans l'épithélium sensoriel voméronasal. Vaisseau sanguin (BV), la lumière (L), de l'épithélium sensoriel (SE). Neurones (B) TFP-RS3 tau-Vénus + présentent un seul dendrite apical se terminant dans une structure de bouton ressemblant à la frontière luminal. Whole-cell patch-clamp enregistrements ont été effectués à partir du soma VSN, pipette de patch (PP). (C) Morphologie d'un seul VSN avec le bouton dendritique (K) à la pointe de la longue et étroite dendrites (D), le soma cellulaire (S) et l'axone (A) en laissant le soma du côté basal. Les barres d'échelle, 50 pm (A), 10 um (B), 5 um (C). Ce chiffre a été modifié à partir de 52. S'il vous plaît cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Isolated voltage-dépendants Na + et Ca 2+ courants ainsi que la décharge de la pointe (A) des traces représentatives de la cellule entière patch-clamp enregistrements d'une activation rapide de courant sensible à TTX Na + dans FPR-RS3 + de VSN.. (A i) Tension enregistrement étape dans des conditions de contrôle (solution extracellulaire de S 1; solution intracellulaire S 4) révèle un transitoire rapide et dépendant de la tension courant entrant. (A ii) le traitement de la TTX (1 uM) diminue fortement le courant. Trace soustraites numérique (contrôle-TTX (A iii)) Reveals le courant de Na + voltage-dépendants sensible à la TTX. Les relations courant-tension des courants Na + sensibles à TTX neurones isolés à partir de contrôle et de FPR-RS3 + (A iv). (B) représentant Ca 2+ traces de courant isolées pharmacologiquement (10 uM nifédipine). (C) représentatifs des traces de serrage actuelle montrant de- / hyperpolarisation et les trains de potentiels (rebond) d'action générés lors de positif par étapes (C i) et négatif (C iii) d'injection de courant. Notez l'activité spontanée mesurée à 0 pA injection de courant (C ii). (C iv) la fréquence de mise à feu de contrôle et de FPR-RS3 + neurones en fonction du courant injecté (I injecter). L'augmentation progressive de la cadence de tir est similaire pour le contrôleet FPR-RS3 + VSN. Notez que VSN sont extrêmement sensibles aux injections de courant , même dans les basses picoampère gamme 53-56. Notez que les courbes -I f ont été "background-corrigée" en utilisant la fréquence de dopage spontanée à 0 pA injection de courant. Les données sont des moyennes ± SEM. Ce chiffre a été modifié à partir de 52. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: enregistrements extracellulaires 'patch lâche »de VSN basales (A) l' image IR-DIC d'une tranche de tissu VNO aiguë représentant la pipette d'enregistrement dans la couche basale de l'épithélium sensoriel.. (B) d'enregistrement d' origine représentant d'un VSN basale dans la configuration cellule attachée (&# 39; lâche-joint) répondre avec de courtes rafales transitoires de pointes pour informer excitations (3 sec) avec des protéines urinaires majeures exprimées par recombinaison regroupées (rMUPs) et une concentration de potassium élevée (50 mM, 1 sec), respectivement (B i) . Un grossissement plus d'enregistrements présentés dans (B i) illustre des éclats de pointes en réponse à des stimulations (B ii). Les barres rouges indiquent le temps de la stimulation, l'intervalle inter-stimulus = 30 sec, enregistrement continu, des interruptions <1 sec (marques de coupe //). Barre d'échelle = 5 um (A). Panel (A) a été modifié par la référence 38. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Le VNO est une structure chemosensory qui détecte écomones. A ce jour, la plupart des récepteurs de voméronasal reste à deorphanized car seules quelques paires récepteur-ligand ont été identifiés. Parmi ceux -ci , V1rb2 a été décrit pour être spécifiquement activé par la phéromone urinaire 2-heptanone mâle 30, V2rp5 à être activé par le mâle phéromone spécifique ESP1 57 ainsi que V2r1b et V2rf2 à être activés par les peptides du CMH SYFPEITHI 48 et SEIDLILGY 58, respectivement. Une condition préalable à la compréhension de la transduction du récepteur-ligand relations et le signal est la connaissance des caractéristiques biophysiques des populations de VSN définies dans un environnement natif. propriétés des membranes passives et actives, conductances ioniques voltage-dépendants et des motifs de décharge d'action potentiel définissent les moyens et mesure dans laquelle les neurones récepteurs répondent aux chemosensory stimuli. Les enregistrements électrophysiologiques dans des tranches de tissu aiguës et, en particulier, quienregistrements de patch-clamp le-cellulaires fournissent une excellente méthode pour analyser ces propriétés en détail.
Une étape cruciale pour les enregistrements physiologiques efficaces et fiables dans des tranches de tissu est la préparation elle-même. Afin de maximiser l'intervalle de temps pour effectuer des expériences, le tissu doit être tranché et transféré à la solution oxygénée glacée immédiatement après dissection. Par la suite, les tranches peuvent être conservés pendant plusieurs heures permettant l'analyse d'un nombre important de cellules par jour expérimental. Il faut une certaine pratique pour réduire le temps de disséquer et d'intégrer à la fois les VNO d'un animal en moins de 30 min. Après cela, le taux de réussite pour un expérimentateur expérimenté pour obtenir plusieurs coupes de tissus intacts avec des cellules viables est bien au-dessus de 75%. Exécution d' enregistrements de patch-clamp est une approche expérimentale à faible débit par rapport à Ca l'imagerie. Pourtant, il permet une analyse plus détaillée et polyvalent de l'activité sur le niveau d'une seule cellule avec un temporel beaucoup plus élevérésolution. Dans la configuration de la cellule entière, le milieu intracellulaire est dialysée par la solution de la pipette. Alors que la solution de la pipette peut ne pas refléter la composition exacte cytosolique, il fournit l'expérimentateur avec un contrôle précis sur les deux conditions ioniques extra- et intracellulaires. Pour une interprétation fiable des résultats, un suivi continu de la résistance d'accès et le courant de fuite est crucial. Parfois, une augmentation ou une forte variation de la résistance d'accès ou de fuite conducteurs de courant à des résultats non interprétables et exige donc ces enregistrements à être mis au rebut. Par ailleurs, il est important de noter que certains composés se lient de manière irréversible pharmacologiques les rendant nécessaire le remplacement des tranches après chaque enregistrement.
L'enregistrement dans la configuration cellule attachée empêche la dialyse des composants intracellulaires et n'a aucune influence sur le potentiel de membrane de la cellule. Ainsi, cette technique offre un moyen moins invasif et relativement rapide du dépistage. Cependant, cette approach est généralement limitée à l'enregistrement des courants capacitifs super-seuil potentiel conduit d'action à partir de l'extérieur de la membrane cellulaire. Enregistrements patch en vrac se sont avérées aptes à analyser le comportement de dopage d' un plus grand nombre de neurones sensoriels en tranches VNO 38,54.
Le modèle transgénique employé ici fournit un outil fiable pour identifier et analyser la population de FPR-RS3 exprimant VSN. De plus, la technique décrite ici peut être étendue à d'autres lignes, quel que soit leur génotype. Malgré l'énorme avantage d'enquêter sur un type de cellule définie, en utilisant des souris transgéniques limite des expériences sur les lignes disponibles. Récemment, cependant, l' édition du génome ciblé est devenu plus rapide et plus abordable avec le CRISPR / technique cas9 59. En conclusion, la cible des enregistrements de patch-clamp en tranches de tissu voméronasal aigus offrent une approche polyvalente pour caractériser les propriétés biophysiques et physiologiques d'un populat définiion des neurones sensoriels.
The authors have nothing to disclose.
We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical tools and consumables | |||
Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
Water bath | Memmert | WNB 45 |
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