Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Bu protokol Ang II reseptörleri reseptör otoradyografik haritlama özgü bir radyo-kullanarak sıçan beyninde Anjiotensin II (Ang II) için reseptör bağlanma şekilleri ile ilgili bilgiler.

Doku numuneleri hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklanır. Bir kriyostat koronal bölümüne doku (beyin) kullanılır ve yüklü slaytlar üzerine bölümleri monte çözdürmeyiniz. Slayt monte doku bölümleri Ang II reseptörlerinin radyolabel ^125I-sı-Ang II içerisinde inkübe edilir. Komşu slaytlar iki kümeye ayrılır: bir alıcı doyurarak radyo-etiketlenmemiş Ang II konsantrasyonu ya da varlığında (MGP) 'spesifik olmayan bağlanmayı' _1, Ang II reseptörü alttipinin ₍₁ r) seçici Ang II reseptör antagonisti ve ₁ R antagonisti AT hiçbir ile 'bağlayıcı toplamı'. _2, Ang II reseptörü alttipinin _(2'de R) doyurucu konsantrasyonu antagonisti (PD123319, 10 uM), aynı zamanda kuluçkalamadan mevcutturtampon üzerinde AT ₁ R alt tipine bağlama ^125l-SI-Ang II sınırlamak için. 22 ° C, MGP slaytlar 10 uM PD123319 ve losartan maruz ° 'de 30 dakikalık bir ön inkübasyon sırasında, slaytlar 10 uM PD123319 maruz' bağları, toplam 'ise. Slaytlar, sonra 'toplam bağlanma için' PD123319 mevcudiyetinde ^125l-sı-Ang II ile inkübe edildi ve analiz tamponu içinde MGP için PD123319 ve losartan, birkaç 'yıkama ", ardından tampon maddesi içinde ve su tuzunu ve non-kaldırmak edilir spesifik olarak bağlanmış radyoligandı. slaytlar uzmanlaşmış bir film ve kaset kullanarak ardından otoradyografi filmine maruz darbe kurutucular kullanılarak kurutulur. Film geliştirilen ve görüntüler, özel bir görüntüleme sistemi ve elektronik tablo kullanarak görsel ve kantitatif dansitometri için bir bilgisayara taranır. slaytlar ek olarak bir dizi histolojik karşılaştırmalar için tionin-boyanır.

reseptör otoradyografi kullanmanın avantajı görselleştirmek yeteneğiAng II, bir doku numunesinin bir bölümü içinde yerinde reseptörler, anatomik bir bitişik histolojik bir referans bölümüne karşılaştırarak doku bölgesini tanımlamak.

Kardiyovasküler hastalık 2011'de ¹ ABD'de ölümlerin% 30'undan fazlasını neden ABD'de ölüm ve sakatlık, önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Amerikan Kalp Derneği en son istatistikler üç birden fazla kişi birine sahip olduğunu göstermektedir kardiyovasküler hastalık ya da daha fazla türü. Kardiyovasküler araştırmalar bu hastalığı anlamak karşı adımlar atmaya devam ediyor, ancak kuşaklar yaşlanıyor başlarken çabalarına devam etmesi zorunludur. Renin-anjiyotensin sistemi (RAS), esas (Şekil 1), ^2-8, sempatik sinir sisteminin ateroskleroz, enflamasyon, sistemik vazokonstriksiyon ve aktivasyonunu teşvik ederek kalp-damar sistemi regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır.

RAS tansiyon azalan böbrek jukstaglomerüler hücreleri yanıt olarak kan dolaşımına renin salgılayan aktive bir hormonal sistem, sympat arttıinfographie stimülasyon veya makula densa sodyum akışını azalmıştır. Renin anjiyotensin I (Ang I) 'in (karaciğerde sentezlenir) anjiyotensinojen metabolizması için önemlidir. Ang sonra anjiyotensin II (AngII), RAS ana efektör peptit oluşturmak için, birincil akciğer ve böbrekte, vasküler endotel hücrelerinin luminal tarafta, anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) tarafından ectoenzyme metabolize edilir. Ang II İki reseptör alt tipi aktive edebilen olduğu; ₍₁ AT R) tip 1 reseptör ve ₍₂ R AT) tip 2 reseptör, kardiyovasküler sistem düzenleyen hem de sıvı ve elektrolit homeostazisini korumak ve şimdi bilişsel işlev ve nörodejeneratif hastalığı etkilediği düşünülmektedir ^8,9 işler. Yerel, beyin özel RAS bağımsız Ang II sentezlenmesi için bildirilmektedir. Beyinde, ön-madde proteini anjiyotensinojen bir renin-benzeri enzim ³ Ang I dönüştürülür astroglial ¹⁰ sentezlenir, muhtemelen prorenin prorenin reseptörüne bağlanan^11, ve daha sonra, bol beyindeki ¹² nöronların hücre dışı yüzeyi üzerinde eksprese edilir anjiyotensin dönüştürücü enzim ile Ang II ile dönüştürüldü. Ang II oluşturulan bu intrabrain ₁ beyin ve kan yoluyla bulaşan Ang II izole edilmiştir ₂ reseptörlerinde agonistidir.

AT ₁ R, önemli bir fizyolojik rol oynarken, daha iyi öncelikle kalp-damar sistemi ve böbrekler (Şekil 2) etkileyen, vücutta, patofizyoloji etkileri bilinmektedir. Ang II AT ₁ R bağlandığında, bu vazokonstriksiyona neden olur; kan akışına direnci arttırarak ve kan basıncını yükselterek. Ayrıca, artan sodyum ve su retansiyonu giden, aldosteron ve vazopresinin sentez ve salgılanmasını teşvik eder. Bu etkiler, iskemik beyin tahribatı ve bilişsel bozuklukları uyarabilir ve Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ile bağlantılı olduğu ve diabetes, son zamanlarda tespit ediliyor yanı sıra, öğrenme ve hafıza ^13-15 etkileyecek. Böbrekte jukstaglomerüler hücreler üzerinde ₁ R AT ki RAS bir geribesleme döngüsü renin salgısı yoktur inhibe olduğunu. İlginçtir, AT ₂ R genellikle ₁ R AT, diğerleri ^16-20 arasında vazodilatasyon, nörit büyümesini, aksonal rejenerasyon, anti-çoğalmasını ve cerebroprotection neden eylemi karşı düzenler. AT _2R, aynı zamanda, anti-hipertansiyon ve en son, anti-kanser ilaçları ²¹ için bir hedef olarak tanımlanmıştır. çeşitli dokularda içinde Ang II reseptörlerinin lokalizasyonu ve yoğunluğunu belirleme ve nasıl RAS belirli hastalıklarda oynadığı rolü ortaya çıkarmak yarayacak nicel dansitometrik reseptör otoradyografisim kullanarak çeşitli tedaviler ve hastalık durumlarında tarafından etkilenmektedir.

Reseptör otoradyografi anjiyotensin I varlığını göstermek için etkili bir yöntem olarak 30 yıldan uzun bir süredir kullanılmaktadırI reseptörleri beyinde RAS diğer bileşenleri ve deneysel koşullara ^22-34 çeşitli altında sıçan, fare, kobay, köpek ve insan ve diğer dokular. Beyin içinde Ang II reseptörlerini bulma önemi bir beyinde Ang II eylemleri fonksiyonel nöroanatomisini uygulayabilirsiniz olduğunu, örneğin, hipotalamus (PVN) paraventriküler çekirdeğinde AT ₁ R varlığı Ang bir fonksiyonu göstermektedir beyindeki II vasopresin, oksitosin veya kortikotropin salan hormon (CRH) serbest ya da sempatik sinir sisteminin aktivasyonu uyarmak için. Bu nedenle, en ₁ R bloke eden ilaçlar, beyin RAS aktivitesi ile ilişkili bu PVN aracılı bazı etkileri azaltabilir. Work in progress ₁ R antagonistleri AT kullanımı CRH Travma Sonrası Stres Bozukluğu (TSSB) bağlı salınımını azaltmak ve TSSB belirtileri iyileştirmek düşündürmektedir (Hurt ve ark., Yayımlanmak üzere gönderilen). PVn, subfornicalOrgan (SFO), ve amigdala homeostasis, iştah / susuzluk, uyku, hafıza, duygusal tepki düzenleyen bilinir ve bu gösteri çalışmanın hedef alanlardır. Bu bölgeler, mikroskop lamları üzerinde beyin koronal kesitler toplanması ve Ang II reseptörleri için spesifik radyo-ligand ile birlikte spesifik inhibitörleri olan bölümleri muamele edilmesiyle incelendi. Bu çalışmada, önerilen satıcılar ile birlikte tüm maddeleri ve reaktif maddeler listelenmiş iyot-125 daha sonra mono- ¹²⁵ I olarak saflaştırılan bir Ang II reseptör antagonisti, sarkosin ^1, izolösin ⁸ Ang II (SI Ang II), radyolabel kullanılmıştır edilir Daha önce tarif edildiği gibi ^35, HPLC yöntemleri kullanılarak -Si Ang II. Bu yüksek bir spesifik aktivitesi radyo-ligand kullanımı X-ışını filmine radyo-etiketli bölümleri maruz kaldıktan sonra, düşük, orta ve yüksek reseptör yoğunluğu alanlarının görülmesine olanak verir. İyot-125, belirli bir miktarda bilinen miktarlarda içeren beyin macun standartlarına filmi kalibre tarafındanBir alanda bağlanmış Ang II reseptörünün belirlenebilir. Deneysel çalışmalarda, deneysel konularda beyinlerinde bağlanması Ang II reseptör kontrol grubunun beyinlerinde olduğu mukayese edilebilir. Bu Ang II eylemleri genetik durum, fenotipik anormallik, hastalık durumunun veya ilaç tedavisine yanıt değişmiş olup olmadığını gösterebilir. Bu bilgi daha sonra RAS düzensizliklerine bağlı hastalıkların tedavisi için terapiler geliştirilmesi için uygulanabilir. Düşük anatomik çözünürlükte ancak siteler reseptör bağlanma tespit Alternatif teknikler, ayrışma sabiti olarak radyoligand bağlanma afinitesini belirlemek için bir konsantrasyon aralığı üzerinde radyo-ligand ile kuluçkalanır doku homojenatlarında türetilen doku zar müstahzarları kullanan analizler _(KD bağlayıcı Çevrede doku) ve maksimum bağlanma kapasitesi (B _Max).

Burada açıklanan protokol 5 büyük işbirliği içine bölünebilirmponents: Reseptör Otoradyografi için Doku Bölümler hazırlanması; Reseptör Otoradyografi; Film Pozlama ve Gelişimi; Histoloji; VE DENSİTOMETRİK Görüntü Analizi.

Bu çalışma için yapılan tüm hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde Nova Southeastern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi, 8 ^inci Edition (Ulusal Akademiler Press, Washington, DC 2011 ).

Reseptör Otoradyografi 1. hazırlanması Doku Bölümler

1. kurban üzerine, hasat taze beyin dokuları ve alüminyum folyo ve yerinde sarın -20 ° C derin dondurucuda en kısa sürede. 20 ° C derin dondurucu - Doğru şekli korumak kafatası içini taklit eden bir beyin kalıp içinde beyinleri yerleştirmek için, alüminyum folyo ve yerde sarın. 30 dakika sonra, bir yerde yapışmalı dondurucu saklama torbasında doku ve uzun süreli depolama için -80 ° C derin dondurucuda taşıyın.
   1. -80 -10 ° C ve -18 ° C maksimum minimum ayarlanmış bir kriostada C derin dondurucuda ve transferi ° önlemek için çözülme ilgi taze dondurulmuş doku örneği elde edin.
   2. doku üzerine numune, sadece ortam içine numunenin çok küçük bir kısmını gömme bir glikol ve reçine-tabanlı gömme ortamı ile monte yerleştirin. beyin için, beyin koronal planda kesit etkinleştirmek için dikey olarak monte edilir.
2. Doku cryostat içinde mikrotom üzerine monte ve sıkıca yerinde sıkın yerleştirin. dorso-ventral eksen dik yaygın olarak kullanılan beyin atlasları olduğunu aynı antero-Postero koordinatlarda olan beynin sol ve sağ tarafını sağlamak ve.
3. İstenen kalınlıkta kesme başlar (20 um tavsiye edilir) ve slayt alanı daha büyük bir yüzey alanına sahip bir dikey yönde mikroskop lamı üzerine bölümleri monte eritin. Slaytlar ilk seti (Şekil 3) 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 ve 1-5 etiketli, yani beş sıralı setleri Slaytlarınıza bölümleri toplayın.
4. bölümleri ile slaytlar bir dizi doldurduktan sonra, en fazla 1 saat boyunca kuru hava slaytlar, sonra sli yer izin-20 ° C'de bir plastik slayt kendi kendine kapanan dondurucu saklama torbasında kutu ve mağaza des.

2. Alıcı Otoradyografi

UYARI: Radyoaktivite. radyoaktivite işlemek için koruyucu kıyafetleri kullanın. Bertaraf kurulması bağımlı olduğunu, ve düzgün (yarım-life 60 gün) çürümeye ya da sertifikalı firma tarafından alınmayı kurallara uymak zorundadır.

1. (Şekil 5) -20 ° C dondurucu ilgi "-2" "-1" ve slaytlar çıkarın ve slayt kulpları içine monte edin. Birlikte 'non-spesifik' tedavisi için "-1" slaytlar ve toplam 'tedavi için "-2" slaytlar monte edin. Bağlama kavanoz yalnızca 10 içerir, bakiyeleri (Tablo 1) 'Spesifik olmayan "kavanoz _2R antagonisti, PD123319, bir 10 uM nihai konsantrasyonlar içerir ve deney ortamı tamponunda, _1R antagonisti, (AM5) bir losartan AM5 mikron PD123319.
2. slayt tersçeneler, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca AM5 35-40 ml dolu ön inkübasyon Coplin kavanoz içine slaytlar ve ilgili inhibitörleri yer. 4 dakika aralıklarla öncesi inkübasyon banyosu içerisinde müteakip setleri başlatın.
3. Hemen oda 60-90 dakika boyunca 10 AM5 ml artı ilgili inhibitörleri ile (Şekil 4'te hesaplanan) ^125I-sı-Ang II önceden tespit edilmiş bir konsantrasyonunu ihtiva eden inkübasyon kayıcı postaları ön inkübasyon çözeltisinden slaytlar aktarmak sıcaklık. Yeterli radyoligand varsa, 10 slaytlar modifiye slayt kulpları (arka arkaya) yerleştirilir ve Coplin kavanozlarda ¹²⁵ I-SI-Ang II ile inkübe edilebilir.
4. Talep (gerekirse), benek, yavaşça, iki ayrı kaplar içinde damıtılmış su, 400 ml 1-2 saniye boyunca döndürülerek yıkayın kayıcı kılıf içine geri çekilir.
5. Tam 1 dakika her (Şekil 4 gibi için AM5 35-40 ml içeren dört Coplin kavanoz içine sırayla slaytlar aktarın/ Strong> ').
6. Son 1 dakika durulama sonra, yavaşça buzla soğutulmuş damıtılmış su dört değişiklikler 1-2 saniye için bölümler girdap.
7. -Darbe kurumaya soğuk hava ile slaytlar (Dikkat: sıcak hava radyoaktif bileşik uçucu hale) 4 dakika (Şekil 5) için farklı açılardan kurmak dört saç kurutma makinesi kullanarak, tüm bölümleri kuruyana kadar, daha sonra bir kağıt havlu üzerine koyun.
8. Dağı dokular çift taraflı bant kullanarak X-ışını filmine apozisyon bir karton üzerine yukarı bakacak şekilde kayar.
9. En az bir Dağı, her karton üzerine ¹²⁵ İyot kalibrasyon standart slayt (Şekil 6).
   Not: Kalibrasyon standartları iyice beyin kesitleri ile aynı kalınlıkta kesildi ve mikroskop üzerine çözülme monte kriyostat olan 1 mL'lik bir tüberkülin şırınga içinde santrifüjleme ile sıkıştırılmış bir fenol halkası ihtiva eden bir bileşik, bağlanmış ¹²⁵ iyot ile karıştırılmış, beyin macun oluşur slaytlar. Alternatif olarak, ^125I kalibrasyon standartları20 um kalınlığında kesitler plastik reçine ticari olarak elde edilebilir. Bu standartlarda plastik reçine kısmen böyle% 40 ~ bir doku denklik kalibrasyon hesaba gerektiğini radyasyondan filmi korur.

3. Film Pozlama ve Kalkınma

1. bir kayış-arka X-ışını kaset ve otoradyografi film ile bir karanlık oda geçin. Kaseti açın ve içindeki slaytlar (Şekil 6) ile karton yerleştirin.
   1. Işıkları kapatın ve Karanlıkodanızda açın. Dikkatle, X-Ray film kutusunu açmak bir filmi çıkarın ve kaset slaytlar üstünde (sağ alt köşede tırtıklı kenar) filmi parlak tarafı yukarı yerleştirin. Dikkatle kaseti kapatın ve hafif (Şekil 6) dışarı mühürlemek için kilit çubuklarını bükün. -20 ° C'de birkaç gün ila birkaç hafta için slaytlar Açığa.
2. karanlık odada, kaseti açın ve filmin gelişen proc devamess.
   1. ardışık tepsilerine slaytlar yerleştirin; 2 dakika için geliştirici, 5 dakika için% 5 buzlu asetik 30 saniye için asit ve fixer içeren su. filmler 20 dakika akan su ile bir tepsiye yerleştirilir, daha sonra en fazla 10 saniye boyunca Photoflo yerleştirilir ve kapattı.
      Düşük bağlama ile alanlardan ölçülebilir sinyalleri elde etmek için yeterince uzun, ama çok uzun zaman yüksek bağlayıcı olduğu bölgelerde filmini doyurmak için: maruziyet süresi ampirik olarak belirlenir ve farklı pozlama süreleri ile birden filmleri içerebilir: Not. kabul edilebilir riskler elde edildikten sonra, bir sonraki adıma geçin.

4. Histoloji

1. Tionin leke ve boyama reaktifleri (Tablo 2, Şekil 7) hazırlayın.
   1. Slayt rafa "-3" slaytlar yerleştirin ve 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile başlayarak sıralı transferi, daha sonra 10 dakika boyunca tionin leke çözeltisi Deion halinde üç dip ardındanözelleşmiş suları ve deiyonize su içinde bir 30 saniye yıkama.
   2. aşağıdaki gibi su takiben, etanol yıkar içine slayt raf yerleştirin; 1 dakika her biri için,% 100 iki etanol yıkaması, ardından% 50,% 70, ve 30 saniye süreyle% 90. Son olarak, 3 dakika boyunca iksilen içine kayar ızgarayı daha sonra 5 dakika için bir ikinci ksilen çözeltisine aktarılmaz.
2. Son iksilen banyosundan her seferinde bir slayt çıkarın ve organik çözücü montaj orta bir reçine ile sürgünün üst kenarını kapsayan ve slayt üzerine 24 mm x 60 mm'lik bir örtücü cam yerleştirin. ~ 48 saat slaytlar için yeterince kurumasını bekleyin ve sonra 2.400 dpi gri bilgisayara tarayın.

5. Densitometrik Görüntü Analizi

1. sol alt köşesinde tırtıklı kenarı aşağı filmin parlak tarafı yerleştirin ve görüntüleme sistemi bilgisayarda herhangi bir bozulma olmadan film yoğunluğu bilgisini iletebilen özel bir tarayıcı kullanarak tarayın.
2. özel görüntüleme sys açtem ve kullanmak kalibrasyon çubukları filmin görüntüleri (- 12 Şekil 9) gelecekteki dansitometrik analizi için kalibrasyon standartları oluşturmak.
3. Bir şablon kurulması veya ampirik ilgi alanları özetleyen biri tarafından ilgi ölçüsü alanları. Veriler, kontrol ya da vahşi tip (bölümü) ve bölge ya da toplandı ve film göre ayrılır. (Şekil 9) ölçümlerde yoğunluğu (fmol / g), tarama alanı ve toplam hedef alanı da kapsayacak şekilde emin olun.
   1. Ilgi bölgesi vurgulayarak parametreleri (Şekil 10) arasında düştüğü temin ederek tarama alanı çubukları ayarlayın.
   2. Bir e-tabloya İhracat verileri (Tablo 4). , Yoğunluk çarpı toplam hedef alan çarpın o belirli bir alanın bağlama değerini elde etmek için tarama alanının bölün. Bu ölçülen tüm değerlere tamamlandıktan sonra, seçici bağlantı p vermek üzere toplam oluşturulan spesifik olmayan substratkızıyorum. Ortalamalar, aynı zamanda bu değerleri için gerçekleştirilebilir.

Renin-anjiyotensin sisteminin bir metabolik yolun genel görünüşü Şekil 2'de tarif edilen Şekil 1 ve _(R1 Ar ve ₂₎ anjiyotensin II reseptör alt-tipleri üzerindeki doğrudan odak gösterilmektedir. Şekil 3'te bir koronal beyin transferi Şekil Şekil 4'te görüldüğü gibi, daha sonra, önceden belirlenmiş bir ^125I-siang II konsantrasyonu kullanılarak bir alıcı otoradyografi prosedürü ile çalıştırılır mikroskop lamı üzerine bölümler. Şekil 5 daha sonra bir karton üzerine yapıştırılmıştır reseptör otoradyografi slaytların kurutma aşamasını göstermektedir Daha sonra, Şekil 6'da görüldüğü gibi, ve geliştirmiştir. Tablo 2 ölçümü için 7. Kalibrasyon standart birimler Şekil tarif slayt monte doku bölümleri için tionin boyama işlemi için kullanılan reaktif maddeler ba belirlenirTablo görüldüğü gibi tahlil tarihinde sed 3. Şekil 8 Şekil 11. ¹²⁵ I konsantrasyonu (fmol / g doku) maruz kalma (bağıl optometrik yoğunluğu) filmi ile ilgili bir standart eğri kurulmasını gösteren 'NSP' arasındaki ayrım göstermektedir ve toplam grupları yanı sıra doku etiketleri, Şekil 10 tüm taranan alan için doğru bir ortalama değer elde etmek için yakın sıfır değerine eşik ayarını açıklar iken (Tarama alanı-piksel). Tablo 4 görüntüler miktar spesifik alma süreci 'toplam' değerler 'non-spesifik' çıkarılarak dayalı bağlanma. 'Spesifik olmayan "losartan içerir ve / veya PD123319 _{olmayan, 1,} ya da ₂ reseptörlerinde bağlanan radyoligand miktarı ile oluşturulduğu bağlama. PD123319 mevcudiyetinde ₁ reseptörlerinin bağlı radyoligand her bakiyeleri bağlama. F verir ŞEKIL 11 görüntüler PVN anatomik teyit için bir tionin lekeli bölümüne toplam genel, spesifik olmayan bir bağlanma bitişik PVN son ölçülen alanları.

Şekil 1:. Vücutta, renin anjiyotensin sisteminin (RAS) metabolik olarak izlediği yolda karaciğer anjiyotensin II'ye enzim (ACE) Ang I dönüştürür Anjiotensin dönüştürücü I. Angiotensin oluşturan böbrek salgılanan renin ile bölünen zimojen anjiyotensinojen, (Lig Ang II), kardiyovasküler hastalığın ana habercisi. Ang II'nin vazokonstriksiyon neden olur ve kan basıncı, kardiyak output, tuz iştahı, susuzluk ve su tutma gücünü arttırır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Cryosemikroskop üzerine beyin ctioning 20 mikron kalınlığında kayar. kriyostat sıcaklığına bağlı olarak, bölümler kez kıvrımlar, çatlak, curling görüntülemek veya mikrotom bıçak veya bıçak tutucu sıkıştırılmış olur da. Bu durumda bölüm atılır ve bir not ilave 20 um önceki bölümden bu bölümü ayrı belirtmek için yapılır. Bölümler bir slayt doldurmak ve bu nedenle her slayt bölümlere büyük miktarda toplamak için gereken toplam alanı maksimize etmek için dikey yönde slaytlarda toplanmalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. Reseptör Otoradyografi için Deney Tasarımı ve Protokol Örneği differentiBakiyeleri (-2) ve "non-spesifik" (-1), asyon doğrudan alıcı alt tipi antagonist varlığında ve yokluğunda ilişkindir. Protokol slaytlar sayısına dayalı olarak değişebilir ve toplam ve spesifik olmayan slaytlar her bir çifti için 2 artışlarla artacaktır. Radyoligand konsantrasyonu, daha önce AM5 içine stok dilüsyonu elde olduğu belirlenmiştir. Bu çözelti daha sonra eşit inkübasyon kaplara dağıtılır. Doğrudan sayımları önce alınan ve Radyoligantın tam konsantrasyon kurmak için inkübasyondan sonra. Olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5:. Reseptör otoradyografi kurutma istasyonu için yapılandırma Kuruma süreleri darbe verimliliğine göre değişirkurutucular yanı sıra son durulama sonra herhangi bir aşırı su uzakta leke yeteneği. bölüm berrak beyaza dönüşür kez Slaytlar kuru olacaktır. Slaytlar tam sonra kurutulur değilseniz radyoligant uzak bağlanma yerleri reseptör için spesifik değildir bulanık bir görüntü üreten reseptör gelen yayılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6:.. Özel bir kaseti kullanarak röntgen filmi için tedavi slaytları maruz kalması Slayt set-up her iki grubun karşılaştırılması kolaylaştırılmıştır bir desen takip önerilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7: tionin Boyama için Set-up. Slaytlar slayt tutucunun içine yüklenen ve ardışık çözümler batırılır. Zamanlama nöronların Nissl maddenin etkili boyama (endoplazmik retikulum) için izin verir. Dehidratasyon aşağıdaki slaytlar bir montaj orta uygulama, slayt lamel sabitleme karşılaştırmalı analizi için bölümler korumak için izin verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8:. Kalibrasyon standartları belirleyen Her film beyin macunu ve deney yapıldığı hangi zamana dayalı bireysel kalibrasyon standartları içerir . en uygun değerlerini anlatan bir regresyon çizgisi ölçülen beyin macunu standartları için özel bir görüntüleme sistemi programı tarafından oluşturulur. Bu birimler (fmol / g, kırmızı daire), ıslak gramı başına bağlanmış fmol radyoligand olarak bu örnekte, radyo ligand bağlama birimi (kırmızı oval CAL cinsel yolla bulaşan) kalibrasyon standartları göreceli optometrik yoğunluğu (ROD) değerine dönüştürür doku ağırlığı (fmol / g). Beyin macunu standartlarının ölçümü dairesel aracı ile yapılır ve (kırmızı daire içerisine alınmış) görüntü görünümü simgesini kullanarak Pseudocolor sağda gösterilen numunenin ortasında yer alıyor. Daire kalibrasyon standardı tüm numune kapsayacak şekilde yok ölçmek ziyade standart bir hatta alanı ölçmek için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/53866fig9.jpg "/>
Şekil 9:. Birden fazla beyinleri, beyin bölgeleri ve çoklu deneysel grupların bir arada sayısal Çünkü örnek numarası, non-spesifik / toplam ve örnek okumaları için bölgelere göre gruplar belirlenmesi, bu faktörlerin hepsi ayırt etmek önemlidir. konu beyin örneği gösterir ve aynı zamanda grup gösterebilir; bölüm bölgesi örneklenen birden beyin bölgelerinin tanımlanmasına izin verir iken, spesifik olmayan (NSP) ya da toplam olup olmadığını gösterir. Örnek araç çubuğu (kırmızı dikdörtgen) farklı örnekleme araçları, örneğin, daire, kare, şablon, freehand, silgi açıklar; bu ölçülecek alanı ayırmak için kullanılabilir. Örnekleme aracının alanı içinde elde edilen ROD değerleri fmol / g (kırmızı daire), tablo üzerinde bağlayıcı olarak dönüştürülen birimler kaydedilir. Buna ek olarak, örnekleme araç içinde toplam tarama alanı toplam t ise "Tarama alanı piksel" sütununda kaydedilirarget alanı (Şekil 10 efsanede anlatılan eşik değerini (aşan piksel sayısı) "Toplam TGT Alan piksel" sütununda kaydedilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 10: numuneler için eşik tayini standartlarına dayalı ölçülecek tarama alan her film için benzersiz ve belirlenen standartlara bağlıdır.. ölçülen alanlar için izin verecektir fmol / g tarama alanı için yoğunluk aralığında eşik değerlerini ayarlamak için (kırmızı daire içerisine alınmış) eşikleme aracını kullanarak bir noktaya nerede kadar 0 bir dizi arasında düşmeye (diyagonal oklarla tarif) kalibrasyon eğrisi, film, maksimum pozlama üzeredir belirten asimptot başlar ek ötesinde ^{125 Filmin yoğunluğunda daha fazla bir artışa neden olur. alt eşik değerden daha büyük bir film yoğunluğuna sahip pikseller daha az eşik değerden daha değerlerle Piksel. "Toplam TGT Alan piksel sütununda kaydedilen entire ortalama değerlerinin belirlenmesi için mümkün olduğunca sıfıra yakın bir değer atanır tarama alanı "tarama alanı piksel". Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.}

Şekil 11: hipotalamus (PVN) ve aksesuar koku yolunun yatak çekirdeğinin paraventriküler çekirdeğini görüntüleyen bregma ~ 1.8 mm kaudal bir kadın spontan hipertansif sıçan (SHR) koronal bölümleri bağlanma reseptör otoradyografi Temsilcisi görüntüleri (BAOT ). (A </ strong>) _1R (Kırmızı-PVN, sarı- BAOT) bağlanma AT toplam bağlanmanın. (B), losartan (AT1R antagonisti) ve PD123319 (AT2R antagonisti) Spesifik olmayan bağlama. (C) Toplam) Toplam TGT Alanı olarak kaydedilir Tarama Alanı içinde eşik değerini aşan PVN (siyah dolgu) şeklini belirginleştiren olarak keyfi bir eşik gibi ayar bağlayıcı ₁ R AT bağlanması. Gösteren yapıların anatomik onay için (D) tionin lekeli bölümü yüksek bağlanma toplam ve diğer beyin bölgeleri veya diğer deney grupları ile karşılaştırma için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1: Test Ortamı (AM5) doku hazırlanmasında kullanılan tampon kimyasal bileşenleri..

Tablo 2:. Tionin Leke Reaktifler tionin leke çözeltisinden önce tionin% 0.5 ilave 4.3 arasında bir pH değerine titre, damıtılmış su kadar 1.0 M sodyum asetat ve 1.0 M Asetik asit çözeltisi yapılır.

Tablo 3:. Kalibrasyon Standartları Günlük Çürüme Oranı Hesaplamaları kalibrasyon standartları için bir günlük çürüme oranı tablo deney gerçekleştirildi hangi tarihlerine göre oluşturulan gerekecektir. Bu tablo 60 günlük bir yarılanma ömrü (t _½) ile sürekli birinci dereceden oranına dayanmaktadır. -N = N ₀ * e ^KT, N zaman 0 (n, _0), ve k = ln2 / t _1/2 konsantrasyon zamanı t nispetle, ¹²⁵ I derişimidir.

Tablo 4:. Piksel bir fmol / e-tablonun g, tarama alanına ve toplam hedef bölge olarak aksesuar koku yolu Görüntüleme yazılım ihracatı verileri hipotalamus ve yatak çekirdeğin paraventriküler çekirdeğinin kantitatif analiz. Non-spesifik "niceliksel bağlanma ₁ spesifik elde etmek amacıyla bağlama bakiyeleri çıkarılır bağlanma.

Açıklanan protokol, bir kemirgen beyin önce hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklandı koronal bölümlerin bitişik bölümlerinde Radyoligandın bağlanması, toplam "ve" non-spesifik "görselleştirme tanımlar ve hemen hemen her dokuya kolayca uygulanabilir olabilir anatomik reseptörlere veya radyoligand bağlanma sitelerinin diferansiyel miktarları görüntülemek altyapılarını çözmüştür. protokolü kapsamında açıklanan prosedürler basit ve analiz sonuçlarını doğru yorumlamak için kritik öneme sahiptir. 20 um kalınlığında uygun olduğu tespit edilmiştir; bölümünde çok kalın ise spesifik olmayan bağlanma zor hedefine radyoligand bağlanmasını çözmek için yapım artacaktır. bölüm tiner kesilirse, başarıyla kesilmiş ve bozulma olmadan sıralı bölümleri kaydetmek için zor olur. optimal kesme sıcaklığı nedeniyle doku doğa ve bölümleri ve i kalınlığına biraz değişecektirs genellikle ampirik olarak belirlenir. iletişim bıçak ve doku arasında yapıldıktan sonra, numunenin yönelimi gözden ve geri bıçaktan uzak doku örneği hareketli ve montaj topu yeniden yön ile yeniden düzenlenebilir. Bir kemirgen beyin keserken o dorso-ventral eksen dik yaygın olarak kullanılan beyin atlasları olduğunu aynı antero-Postero koordinatlarda olan beynin sol ve sağ tarafını sağlamak için önemlidir, ve. Slayt setleri dokuların bitişik bölümleri ile ilgili çalışmalar yürütmek üzere önceden etiketlenir. 5 slaytlar ilk seti 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 ve 1-5 etiketlenmiştir. İlk kesim bölümü (bu aşağı buzlu tarafı slayt sağ üst köşesinde) sol üst köşesinde slayt 1-1 devam ediyor; İkinci kesim bölümü beşinci kesim bölümü slayt 1-5 devam ediyor vb slayt 1-2, devam ediyor. Altıncı kesim bölümü ilk bölümün solunda slayt 1-1 devam ediyor. slaytlar ilk seti doldurulduktan sonra, kaydırdı 5 başka dizi başlatmakes, 2-1, 2-2, 2-3, 2-4 ve 2-5 etiketli. Bu döngü çok geri beyine gerektiği kadar devam edilir. "-4" Ve "-5" slaytlar yedek olarak veya farklı bir reseptör radyolabel tutulur.

reseptör otoradyografi protokolü kullanılan radyoligand bağlıdır ve reseptör özellikleri tamponlar, tuzlar ve inhibitörlerin konsantrasyonlarını belirlemek için incelenen edilir. Bu prosedürde, Ang II reseptörlerinin AT1 alt ölçümü için, yüksek afiniteli bir İyot-125 etiketli ligand, ^{125I-Sar 1} Ile ⁸ -Ang II ^{(125l-sı-Ang} II); Robert C. Speth, Ph.D. radyoaktif işaretli Ayrıca, piyasada mevcut olan (Peptid radyoiyodinasyon paylaşılan kaynak Georgetown University)) AM5 tampon maddesi içinde (Tablo 1) içinde çözünmekte; sodyum klorür, EDTA ve basitrasin içeren bir sodyum fosfat tampon maddesi. AM5 metalopeptidazları basitrasin duyarlı peptida radyoligant iyi koruma sağlarfizyolojik pH ve NaCl konsantrasyonu temin SES bağlanma özelliklerini optimize etmek. AM5 Öncesi kuluçka radyoligand bozulmasını en aza indirmek için inhibitörleri peptidazla doku bölümleri ortaya, ve ayrıca Ang II reseptörleri gelen endojen Ang II ayrışmaktadır. Losartan ve PD123319, AT1R ve AT2R antagonistleri, sırasıyla bu hedef reseptörleri, sırasıyla, spesifik olmayan değerlendirme ve AT1 reseptörüne spesifik sınırlamak için bu reseptörlere bağlanmasını radyoligand önlemek için konsantrasyonlarda (10 uM) ilave edilir doyurmak. Deney için ^125l-sı-Ang II'nin istenen konsantrasyonu belirlenir ve stok çözeltisi gerekli seyreltme (protokol Tablo 3) radyoizotop bozunma hızının bir e-belirlenir. En uygun olarak _KD yaklaşan radyoligand konsantrasyonu, bu reseptörlerin% 50'sini kaplar bir madde kullanılır. Ancak, radyoligandlar pahalı düşük konsantrasyonlar e olabilir, çünkü.g. _KD konsantrasyonunun% 10-20 kullanılabilir. Bu indirgeme, spesifik olmayan spesifik bağlanma daha bağlanarak sinyal gürültü oranını arttırmak için potansiyel bir avantaja sahiptir. Ancak, daha uzun pozlama süreleri bağlayıcı bir görüntü geliştirmek için gereklidir. (Bölüm 3.4) Yukarıda da belirtildiği gibi elde edilen maruz kalma ya da maruz altında ise, slaytlar kısa ve / veya istenilen pozlama elde etmek uzun süre yeni bir filme tekrar maruz kalabilir.

Densitometrik görüntü analizi, bir otoradyografi uygulamaları geniş bir özet ve diğer uygulamaları sağlar özel bir görüntüleme sistemi ile yapılabilir. Kalibrasyon standartları, yaş doku ağırlığının (doku bir özgül ağırlığı varsayılarak) arasında fmol / g içindedir. bir arka plan ile birlikte her bir standart seti, standart bir eğri oluşturur. ve görece optometri d standart bir eğri oluşturmak için kullanılabilir ağırlık olmadan birkaç eğri uydurma algoritması varFarklı kalibrasyon standartları ensity (ROD) değerleri. En iyi verileri temsil eğrinin seçimi farklı standart eğrileri için bağıl hata değerleri sağlamaz eğri montaj için alt yordamı olarak ampirik yapılır. yukarı ~ 0.6 çubuklarının, standart eğri pseudolinear olduğunu. Ancak, film, 0.8 0.9 ÇUBUK birimleri Asimptotlar bir eğri oluşturan bu noktanın ötesine doyurmak için başlar. örnekleri paranteze standartlar 0.9 ROD birimlerinin üzerinde iseniz, fmol / g standardı pseudolinear aralığına yakın örneklerin bağlanma daha güvenilir değerler elde etmek daha kısa bir süre için filmi yeniden ortaya çıkarmak için tavsiye edilir eğri. Standart eğri, bu uçta, türetilen değerler, radyo ligand bağlama önemli ölçüde daha büyük farklar çubuk küçük farklılıklar neden olur. film, doyma noktasını yaklaştıkça Dolayısıyla yetenek bağlama azalır değişiklikleri tespit etmek.

belirli bölgelerde ölçümler için,Önerilen önlemler 'Yoğunluk' fmol / g, piksel 'Tarama alan' ve piksel 'Toplam Hedef Alan' (Şekil 9). Filmin yoğunluğu veya kalibrasyon standartları elde edilen standart eğrinin keyfi açıdan farklılıklar bazen sıfırdan daha büyük değerler verebilir, çünkü olası (Şekil 10) olarak sıfıra yakın bir eşik değerini ayarlamak önemlidir. Bu tür değerler Tarama Area bütün pikseller için ortalama ise bir yapay olarak düşük bir değer elde ediyorum. çok öznel olabilir bağlayıcı alanları tanımlamak için kullanılan kriterler, bu yüzden en iyisi yakından sübjektif hataların insidansını azaltmak için mümkün olduğunca fazla kontrol ve deney beyinleri eşleştirmek. Başka bir zorluk nihai okuma almak için ortalama kaç bölümler karar vermektir. analiz etmek bölümlerin iyi bir gösterge lekeli histoloji slaytlar ile birlikte kabul edilen sıçan beyin atlası takip ederek tespit edilebilir. Örnekleme alanın büyüklüğü bir olabilirsorun. telafi etmek amacıyla, bir şablon herhangi bir boyut farklılıkları düzeltmek için kurulabilir. bölümlerin tedavisi de yüksek bağlayıcı olan yapının bir alanı etkileyen ve analiz esnasında dikkate alınmalıdır olabilir. Bu beyin bölgesi anatomik özelliklerini temsil edecek şekilde keyfi bir değeri aşan bir yoğunluk aralığını ayarlamak için özel görüntüleme sisteminde 'eşikleme' aracının alternatif bir kullanımını gerektiren bir örnekleme aracında hipotalamus paraventriküler çekirdeğine gibi örneklenmiş olan bu, ilgili bölgeyi (Şekil 11, panel C) kapsar. Bağlanma miktarının saptanması halinde alan ölçümünü dahil edilmesi de mümkündür. Bu spesifik bağlanma kez ölçüldü piksel sayısını değerinin çarpımı ile yapılabilir. Piksel iki düzlemde bir cetvel ya da bilinen boyutlarda bir dikdörtgen görüntüleme metrik birim dönüştürülebilir. karşılık gelen piksel sayısınıdikdörtgen uzunluğu veya alan daha sonra metrik birimler cinsinden ifade edilebilir. 2400 dpi çözünürlükte, ~ 9.000 piksel = sistemimizde 1 ^mm2.

Radyoaktif ligandların kullanımı artık yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, ancak; Bu (kendi doğal ligantı bağlayabilen) doku kendi fonksiyonel numune reseptörlerin fiziksel dağıtımı görselleştirmek için birkaç yollarından biridir. Ayrıca, alternatif yöntemler karakterize etmek için kullanılabilir vb farklı hayvan suşları veya farklı yaşlardaki hayvanlar arasında, farklı beyin bölgeleri veya diğer yapılar arasında tedavi grupları arasındaki fonksiyonel reseptör ifade değişikliklerin değerlendirilmesine olanak verecek reseptörlerinin sayısını ölçmek için AT ₁ reseptör ifadesinin nöroanatomik yönleri, ancak, sınırlı bir değere sahip. MRNA in situ hibridizasyon ₁ reseptörlerinin her zaman ₁ reseptörü, ifade ve dağıtım tekabül etmez içinbeyin. imünolojik teknikler doku bölümleri boyama yoğunluğuna bağlı olarak reseptör ekspresyonu farklılıklarını yaklaşık olabilir, reseptör ifade sayısal tespitine imkan vermek boyama için standart bir eğri oluşturmak için mümkün değildir. Reseptör otoradyografi immünolojik teknikler kullanılarak garanti edilemez (özellikle radyo parçalan birleştirmek ya da başka hedef) reseptörleri için özgüllük düzeyi sağlar. 2009 yılında, bir yazı dizisi 18 farklı G protein-eşli reseptörler ve geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalı değerlendirmek için kullanılmaya başlandı 49 antikorların geçerliliğini sorguladı ^37-43 yayınlandı. Temel olarak, antikorlar, yabani tip ve söz konusu reseptörler için knockout farelerden Western blotlar üzerinde aynı bantlar isimlendirilmiş. Daha sonra, çeşitli gruplar ₁ AT ve ₂ reseptör antikorları ^44-49 AT piyasada mevcut kullanarak benzer gözlemler yaptık. Bir bakteri oluşumuna kullanımı₁ destekte tarafından tahrik edilen bir raportör molekülü, örneğin, yeşil fluoresan proteini üretir ark suni kromozom kendi sahip dayalı (ancak sıçan) beyinleri farede ₁ reseptörü eksprese eden hücre varlığını veya yokluğunu belirlemek dolaylı bir araç olup ₁ alıcı promotör ⁵⁰ ° işlevsel. Mikroskobik belirlenen beyin bölgelerinde "pozitif hücreler" sayısı, ancak bu bölgelerde AT ₁ reseptörünün ekspresyonu yoğunluğundaki değişiklik ölçmek için mümkündür. Böylece şu anda doğrudan Ang II reseptör ifadesini ölçmek için kullanılabilir sadece valide teknikleri radyoligant bağlama yöntemlerdir. ₁ reseptör proteininin AT fonksiyonel anatomik çözünürlüğü mikroskobik düzeyde gerekiyorsa Ve, reseptör otoradyografi gibi doğrudan ölçümü için kullanılabilecek tek bir tekniktir.

Reseptör otoradyografi sınırlamalar olmadan değildir. büyük Concern bir araştırma ortamında radyoaktif maddeleri kullanma gereksinimlerini karşılamak olmasıdır. Radyoaktif maddelerin ve radyoaktif maddelerin güvenli eğilim ile çalışan araştırmacılar güvenliğini sağlamak için yerinde sıkı kurallarına bir radyasyon güvenlik programı olması gerekir. Bu, birçok araştırma ortamlarında kullanımını engellemektedir bir noktaya radyoaktif maddeleri kullanarak araştırma maliyetini yükselir. Ayrıca, Radyoligandlann maliyeti önemli olabilir. radyoligandın binlerce dolar olup, eğer kaydırılmasına monte doku kesitlerinde çok sayıda radyoligandın kaplarda inkübe edildiği bir alıcı otoradyografi deneyi yüzlerce kullanabilir. Diğer bir sınırlama, dokular, öncesinde kriostat üzerinde kesit dondurulur bir süre için saklanabilir ve hızlı bir şekilde durulanmıştır ve radyoligandı bağlanma reseptörlerinin yeteneği veya proteini bozan bütün bunlar radyoligand ile kuluçkadan sonra kurutulmalıdır olmasıdır . Hızlı eşek var ligandlar içinociation / ayrılma kinetikleri, spesifik olmayan şekilde bağlanmış radyoligand ise, silinmesi için gerekli olan süre boyunca reseptörüne radyoligand bağlanmasını muhafaza etmek mümkün olmayabilir. Ayrıca, filmin maruz kalmanın uzun süreler bağlayıcı radyoligandın düşük miktarda - bir ay ya da daha fazla - ölçülebilir bir görüntü film üzerine oluşturabilir önce gerekli olabilir. Başka bir sorun, bir liganda iyot-125 eklenmesi nedeniyle, sterik engellemeye hedef reseptör veya proteine ​​bağlanma ligandın kabiliyetini bozabilir olmasıdır. Çoğu için, bir film görüntü oluşturmak için çok zor olduğu daha küçük bir molekül, örneğin, trityum ^(3H) kullanımı sterik engelleme sorunu ortadan kaldırır fakat trityum, düşük enerji ve (iyot-125 göre) düşük spesifik aktiviteye sahip reseptör popülasyonu. Bu konuların ışığında, reseptör otoradyografi reseptörleri veya diğer ilgi moleküler yapıları algılayamadı olduğu pek çok durum vardır.

onun li rağmenmitations reseptör otoradyografi bir doku içindeki belirli yapıları belirleyebilir, örneğin, deney değişkenleri bağlı olarak değişen beyin bölgelerinde normal kontrol beyninde göre. Bu bilgi Ang II veya hastalığın patoloji diğer reseptör veya enzimler için AT ₁ R rolünü belirlemeye yardımcı olabilir. potansiyel tedaviler için hedef alanları anlaşılacağı gibi bu bilgi, değerli farmakolojik etkileri vardır.

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

This work was supported by NIH Grant HL-113905