Autoradiografia del recettore Protocollo per la visualizzazione localizzata di recettori dell'angiotensina II

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Questo protocollo descrive recettore modelli vincolanti per angiotensina II (Ang II) nel cervello di ratto utilizzando un radiolegante specifico per i recettori Ang II per eseguire recettore mappatura autoradiografica.

campioni di tessuto sono raccolti e conservati a -80 ° C. Un criostato viene utilizzato per la sezione coronale del tessuto (cervello) e scongelare-montare le sezioni su vetrini cariche. Le sezioni di tessuto di diapositive montate sono incubati in ¹²⁵ I-SI-Ang II radiomarcato recettori Ang II. Diapositive adiacenti sono separati in due gruppi: (NSP) in presenza di un recettore saturare concentrazione di non-radiomarcata Ang II, o un 'binding non specifico' AT ₁ Ang II sottotipo recettoriale (AT ₁ R) antagonista selettivo del recettore Ang II , e 'totale vincolante' senza AT ₁ R antagonista. Una concentrazione di saturazione di AT ₂ Ang II sottotipo recettoriale (AT ₂ R) antagonista (PD123319, 10 micron) è presente anche nel incubatisul buffer di limitare ¹²⁵ I-SI-Ang legame alla AT ₁ R sottotipo II. Nel corso di un 30 minuti di pre-incubazione a ~ 22 ° C, scivoli NSP sono esposti a 10 micron PD123319 e losartan, mentre 'totale vincolante' diapositive sono esposti a 10 micron PD123319. I vetrini vengono poi incubate con ¹²⁵ I-SI-Ang II in presenza di PD123319 per 'legame totale', e PD123319 e losartan per NSP nel tampone di dosaggio, seguita da diversi lavaggi '' nel buffer e acqua per eliminare il sale e non specificamente, legato radioligand. Le diapositive sono asciugati con blow-essiccatori, poi esposti a pellicola autoradiografia utilizzando una pellicola specializzato e cassetta. Il film è stato sviluppato e le immagini vengono scansionati in un computer per densitometria visiva e quantitativa utilizzando un sistema di imaging di proprietà e un foglio di calcolo. Un ulteriore insieme di diapositive sono thionin-macchiato per i confronti istologici.

Il vantaggio di utilizzare autoradiografia del recettore è la capacità di visualizzareAng II recettori in situ, all'interno di una sezione di un campione di tessuto, e anatomicamente identificare la regione di tessuto confrontandolo con una sezione di riferimento istologica adiacente.

Le malattie cardiovascolari continua ad essere la principale causa di morte e disabilità negli Stati Uniti, causando più del 30% dei decessi negli Stati Uniti nel 2011 ^1. Le più recenti statistiche dalla American Heart Association indicano che più di una persona su tre ha un o più tipi di malattie cardiovascolari. la ricerca cardiovascolare continua a fare passi avanti contro la comprensione di questa malattia, ma come le generazioni iniziano invecchiando è imperativo continuare questi sforzi. Il sistema renina-angiotensina (RAS) gioca un ruolo centrale nella regolazione del sistema cardiovascolare promuovendo innanzitutto aterosclerosi, infiammazione, vasocostrizione sistemica, e l'attivazione del sistema nervoso simpatico (Figura 1) ^2-8.

La RAS è un sistema ormonale che si attiva quando le cellule del rene iuxtaglomerulari secernono renina nel sangue in risposta alla diminuzione della pressione arteriosa, aumento sympatstimolazione hetic, o diminuito il flusso di sodio dal macula densa. Renina metabolizza angiotensinogen (sintetizzata nel fegato) per formare angiotensina I (Ang I). Ang I è poi metabolizzato dal dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE), un ectoenzima sul lato luminale delle cellule endoteliali vascolari, principalmente nei polmoni e reni, per formare angiotensina II (Ang II), il principale effettore peptide della RAS. Ang II è in grado di attivare due sottotipi recettoriali; il recettore di tipo 1 (AT ₁ R) e il recettore di tipo 2 (AT ₂ R), sia che regolano il sistema cardiovascolare, mantenere l'omeostasi idro-elettrolitico e sono ormai considerati di influenzare le funzioni cognitive e malattie neurodegenerative processi ^8,9. Un locale, RAS specifica del cervello è segnalato per sintetizzare in modo indipendente Ang II. Nel cervello, il angiotensinogen proteina precursore viene sintetizzato in astrociti ¹⁰ convertito Ang I da un enzima renina-like ^3, eventualmente prorenin legato al recettore prorenin^11, e successivamente convertito in Ang II enzima di conversione che è abbondantemente espresso sulla superficie extracellulare dei neuroni nel cervello ^12. Questo intrabrain generato Ang II è l'agonista per il cervello AT ₁ e AT ₂ recettori che sono isolate da sangue-borne Ang II.

Mentre l'AT ₁ R svolge un importante ruolo fisiologico, è meglio conosciuto per i suoi effetti patofisiologici in tutto il corpo, soprattutto a carico del sistema cardiovascolare e dei reni (Figura 2). Quando Ang II si lega al AT ₁ R, provoca vasocostrizione; aumentando la resistenza al flusso sanguigno e aumentare la pressione sanguigna. Inoltre promuove la sintesi e la secrezione di aldosterone e vasopressina, che porta ad un aumento della ritenzione di sodio e acqua. Questi effetti possono anche indurre danno ischemico cerebrale e disturbi cognitivi ed è collegata al morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, e diabetes, oltre ad essere recentemente identificato incidere apprendimento e memoria ^13-15. C'è un ciclo di feedback nel RAS dal fatto che ₁ R sulle cellule iuxtaglomerulari nel rene inibisce la secrezione di renina. È interessante notare che la AT ₂ R generalmente contro-regola l'azione di AT ₁ R, causando vasodilatazione, crescita dei neuriti, la rigenerazione assonale, anti-proliferazione, e cerebroprotection tra molti altri ^16-20. L'AT ₂ R è stato inoltre individuato come obiettivo per l'anti-ipertensione e di recente, farmaci anti-cancro ^21. Determinazione della localizzazione e densità dei recettori Ang II all'interno di vari tessuti e come essi sono influenzati da vari trattamenti e stati di malattia utilizzando quantitativa autoradiografia del recettore densitometrica aiuterà a scoprire il ruolo della RAS gioca a malattie specifiche.

Autoradiografia del recettore è stato usato per oltre 30 anni come un metodo efficace per indicare la presenza di angiotensina II recettori e gli altri componenti dei RAS nel cervello e altri tessuti del ratto, topo, cavia, cane e umana sotto una varietà di condizioni sperimentali ^22-34. L'importanza di localizzare recettori Ang II nel cervello è che si può applicare neuroanatomia funzionale alle azioni di Ang II nel cervello, ad esempio, la presenza di AT ₁ R nel nucleo paraventricolare dell'ipotalamo (PVN) suggerisce una funzione di Ang II nel cervello per stimolare vasopressina, ossitocina o il rilascio della corticotropina releasing hormone (CRH), o l'attivazione del sistema nervoso simpatico. Pertanto, i farmaci che bloccano l'AT ₁ R potrebbero diminuire alcuni di questi effetti PVN-mediati associati sull'attività delle RAS cerebrali. Lavori in corso suggeriscono che l'uso di AT ₁ antagonisti R può diminuire disturbo post-traumatico da stress (PTSD) rilascio indotta di CRH e migliorare i sintomi di PTSD (Hurt et al., Inviato per la pubblicazione). PVN, subfornicaleorgano (SFO), e l'amigdala sono noti per la regolazione dell'omeostasi, l'appetito / la sete, il sonno, la memoria, le reazioni emotive, e sono le aree di destinazione di questo studio dimostrazione. Queste regioni sono stati esaminati attraverso la raccolta di sezioni coronali di cervello su vetrini da microscopio, e il trattamento delle sezioni con inibitori specifici insieme a un radiolegante specifica per i recettori Ang II. In questo studio, tutti i materiali e reagenti insieme con i fornitori suggeriti sono elencati, iodio-125 è stato utilizzato per radiomarcato un antagonista Ang II recettore, sarcosina ^1, isoleucina ⁸ Ang II (SI Ang II), che è stato poi purificato come mono ¹²⁵ I -SI Ang II usando metodi HPLC come descritto in precedenza ^35. L'utilizzo di questa specifica elevata radiolegante attività consente la visualizzazione di aree di bassa, moderata e alta densità recettoriale dopo esposizione delle sezioni radiomarcati alla pellicola a raggi x. Per calibrare il film con standard pasta cerebrali contenenti quantità note di iodio-125, la quantità specificadel recettore Ang II vincolante in una zona può essere quantificato. In studi sperimentali, il recettore Ang II vincolante nel cervello dei soggetti sperimentali può essere paragonata a quella nel cervello dei soggetti di controllo. Questo può indicare se le azioni di Ang II sono alterati in risposta ad una condizione genetica, anomalia fenotipica, stato di malattia o trattamento farmacologico. Questa conoscenza può essere applicata allo sviluppo di terapie per il trattamento di malattie associate con disregolazione del RAS. Tecniche alternative che identificano il recettore siti di legame, ma con ridotta risoluzione anatomica, sono test che utilizzano preparazioni di membrane di tessuto derivati ​​da omogenati di tessuti, che vengono incubate con radiolegante in un range di concentrazioni per valutare radioligand affinità di legame come la costante di dissociazione (K _D vincolanti ) e massima capacità legante (B _max) del tessuto di interesse.

Il protocollo qui descritto può essere suddiviso in 5 principali components: Preparazione del tessuto Sezioni per autoradiografia del recettore; Autoradiografia del recettore; Esposizione Film e sviluppo; Istologia; e densitometrica Image Analysis.

Tutte le procedure sugli animali effettuati per questo studio sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della Nova Southeastern University in accordo con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8 ^° edizione (The National Academies Press, Washington, DC 2011 ).

1. Preparazione sezioni di tessuto per autoradiografia del recettore

1. Dopo il sacrificio, raccolto tessuti cerebrali freschi, e avvolgerlo in carta stagnola e posto in un -20 ° C freezer appena possibile. Per mantenere la forma corretta, posizionare il cervello in uno stampo cervello che simula l'interno del cranio, avvolgerlo in carta stagnola e posto in un - 20 ° C freezer. Dopo 30 minuti, posto tessuti in un sacchetto di immagazzinaggio congelatore sigillato e passare a un C congelatore -80 ° per la conservazione a lungo termine.
   1. Ottenere il campione di tessuto congelato fresco di interesse dal scongelamento -80 ° C freezer, e trasferimento in un criostato impostata su un minimo di -10 ° C e massimo di -18 ° C, per evitare.
   2. Posizionare il campione sul tessuto montare con un glicole e mezzo di inclusione a base di resina, solo incorporando una piccola parte del campione nel mezzo. Per il cervello, il cervello è montato verticalmente per consentire sezionamento nel piano coronale.
2. Posizionare il supporto del tessuto sul microtomo all'interno del criostato e bloccare in posizione. Assicurarsi che il lato destro e sinistro del cervello sono nelle stesse coordinate antero-postero, e che l'asse dorso-ventrale è atlanti cerebrali perpendicolare usati comunemente.
3. Iniziare taglio allo spessore desiderato (20 micron consigliati) e scongelare montare le sezioni su vetrini da microscopio in direzione verticale per avere una maggiore superficie di spazio nella slitta. Raccogliere sezioni su vetrini in gruppi sequenziali di cinque, cioè la prima serie di vetrini sono etichettati 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5 (Figura 3).
4. Dopo aver riempito una serie di diapositive con le sezioni, i vetrini per asciugare all'aria per un massimo di 1 ora, quindi inserire il slides in una scatola di plastica scivolo in un sacchetto di immagazzinaggio congelatore autosigillante, e conservare a -20 ° C.

2. autoradiografia del recettore

ATTENZIONE: La radioattività. Utilizzare un abbigliamento protettivo per gestire la radioattività. Lo smaltimento è dipendeva stabilimento, e deve seguire le linee guida a decadere correttamente (tempo di dimezzamento di 60 giorni) o essere raccolti da una società certificata.

1. Rimuovere il "-1" e "-2" diapositive di interesse dal -20 ° C freezer e montare in prese di scorrimento (Figura 5). Montare i "-1" scivoli insieme per il trattamento 'non specifica', e le "-2" scivoli per il trattamento 'totale'. Vasetti 'non specifici "conterrà 10 micron concentrazioni finali di PD123319 un AT ₂ antagonisti R, e losartan un AT ₁ antagonista R, in un tampone medio dosaggio (AM5) (Tabella 1), il' totale 'vasi vincolanti potranno contenere solo 10 micron PD123319 in AM5.
2. Invertire la slittagrip per posizionare le diapositive nelle vaschette Coplin pre-incubazione pieni di 35-40 ml di AM5, e le rispettive inibitori per 30 minuti a temperatura ambiente. Inizia set successivi nella loro vasca di pre-incubazione a 4 intervalli min.
3. Trasferire immediatamente i vetrini dalla soluzione di incubazione pre ai bollettini incubazione diapositive, contenente 10 ml di AM5, oltre a una concentrazione predeterminata di ¹²⁵ I-SI-Ang II (calcolato in figura 4) con i rispettivi inibitori, per 60-90 min at room temperatura. Se non vi è sufficiente radioligand, 10 vetrini possono essere posizionati (back to back) in prese di diapositive modificati e incubate con ¹²⁵ I-SI-Ang II in vaschette Coplin.
4. Collocare i vetrini nuovamente dentro le impugnature di scorrimento (se necessario), macchia, e risciacquare delicatamente agitando per 1-2 secondi in 400 ml di acqua distillata in due contenitori separati.
5. Trasferire i vetrini in sequenza in quattro vaschette Coplin contenenti 35-40 ml di AM5 esattamente per 1 min ciascuna (come illustrato in figura 4 </ Strong>).
6. Dopo l'ultimo 1 min risciacquo, agitare delicatamente sezioni per 1-2 secondi in quattro cambi di acqua distillata fredda ghiaccio.
7. Asciugarsi i vetrini con aria fresca (Attenzione: l'aria calda volatilizza il composto radioattivo) utilizzando quattro asciugacapelli impostati da diverse angolazioni per 4 min (Figura 5), fino a quando tutte le sezioni sono a secco, poi posto su un tovagliolo di carta.
8. Montare i vetrini con i tessuti rivolta verso l'alto su un cartone per apposizione di pellicola a raggi X utilizzando nastro biadesivo.
9. Mount almeno uno, ¹²⁵ calibrazione Iodio vetrino standard su ogni cartone (Figura 6).
   Nota: Gli standard di calibrazione consistono di pasta cervello accuratamente mescolata con ¹²⁵ iodio legato ad un composto contenente un anello di fenolo, compattato mediante centrifugazione in una siringa da 1 ml tubercolina, che sono criostato sezionata Allo stesso spessore delle sezioni di cervello e disgelo montato sul microscopio diapositive. In alternativa, ¹²⁵ standard di calibrazione I aresina plastica sezionati a spessore 20 micron può essere ottenuta commercialmente. La resina plastica in questi standard protegge parzialmente la pellicola dal irraggiamento tale che una equivalenza tessuto ~ 40% dovrebbe essere incorporati nella calibrazione.

3. Film di esposizione e sviluppo

1. Avanti a una camera oscura con una cinghia-back cassetta a raggi X e la pellicola autoradiografia. Aprire il cassetto e posizionare il cartone con scorre all'interno (Figura 6).
   1. Spegnere le luci e accendere la luce di sicurezza. Aprire con cautela la scatola della pellicola a raggi X, rimuovere un film, e posizionare il lato lucido pellicola up (con il bordo frastagliato nell'angolo in basso a destra) sulla parte superiore delle diapositive nella cassetta. Chiudere con cura la cassetta, e ruotare le barre di chiusura per sigillare la luce (Figura 6). Esporre le diapositive per diversi giorni a diverse settimane a -20 ° C.
2. Nella camera oscura, aprire la cassetta e procedere con il proc pellicola in via di sviluppoess.
   1. Porre i vetrini in vassoi consecutivamente; sviluppatore per 2 min, acqua contenente 5% di acido acetico glaciale per 30 sec, e fissatore per 5 min. I film sono il collocati in un vassoio con acqua corrente per 20 minuti, poi messi in Photoflo per non più di 10 secondi e appesi.
      Nota: Il tempo di esposizione viene determinata empiricamente e può coinvolgere più film con diversi tempi di esposizione: il tempo necessario per ottenere segnali misurabili da aree a bassa vincolante, ma non è così lungo da saturare il film di aree con elevato legame. Una volta che l'esposizione accettabili si ottengono, quindi procedere alla fase successiva.

4. Istologia

1. Preparare la macchia thionin e reagenti di colorazione (Tabella 2, Figura 7).
   1. Porre i vetrini "-3" nel rack scorrevole, e il trasferimento in ordine sequenziale iniziando con acqua deionizzata per 1 minuto, poi thionin soluzione macchia per 10 minuti seguito da tre tuffi in deionacque ized, e un lavaggio 30 sec in acqua deionizzata.
   2. Dopo l'acqua, posizionare il rack diapositiva in lavaggi etanolo come segue; 50%, 70% e 90% per 30 sec, seguito da due lavaggi etanolo al 100% per 1 min ciascuno. Infine, la cremagliera scorrevole in xilene per 3 min, quindi trasferire oltre ad una seconda soluzione xilene per 5 min.
2. Rimuovere uno alla volta dall'ultimo bagno di xilene, e coprire il bordo superiore della slitta a base di resine in solvente organico mezzo di montaggio e posizionare 24 mm x 60 mm coprioggetto sul vetrino. Lasciare i vetrini per sufficientemente asciutto per ~ 48 ore e quindi eseguire la scansione al computer a 2.400 dpi in scala di grigi.

5. densitometrica Image Analysis

1. Posizionare il lato lucido pellicola verso il basso, con il bordo frastagliato nell'angolo in basso a sinistra e la scansione utilizzando uno scanner proprietaria in grado di trasmettere le informazioni di densità di film senza alcuna distorsione nel computer sistema di imaging.
2. Aprire le SYS di imaging proprietarieTEM e utilizzare le barre di calibrazione per stabilire standard di calibrazione per il futuro analisi densitometrica delle immagini sulla pellicola (figure 9 - 12).
3. Misurare aree di interesse da entrambe stabilire un modello o empiricamente che illustra le aree di interesse. I dati sono la raccolta e separato sulla base di pellicola, sia di controllo o wild type (sezione), e della regione. Assicurati di includere densità (fmol / g), area di scansione e area di destinazione totale nelle misurazioni (Figura 9).
   1. Regolare bar area di scansione assicurando che regione di interesse è compreso tra i parametri di evidenziare (Figura 10).
   2. Esportare i dati in un foglio di calcolo (Tabella 4). Moltiplicare i tempi densità dell'area di destinazione totale, poi dividere per l'area di scansione in modo da ottenere il valore per il legame di quella zona specifica. Una volta che questo è fatto per tutti i valori misurati, substrato non specifico stabilito dal totale da rendere il p legame specificorisentirsi di. Medie possono essere eseguite anche per questi valori.

La panoramica della via metabolica del sistema renina-angiotensina è mostrata in Figura 1 e la messa a fuoco diretto sui sottotipi recettoriali dell'angiotensina II (AT ₁ R e AT ₂ R) è descritto in Figura 2. Figura 3 visualizza il trasferimento di cervello coronale sezioni su vetrini da microscopio, che vengono poi attraverso una procedura di autoradiografia del recettore con una predeterminata concentrazione di ¹²⁵ i-siang II come visto in Figura 4. la Figura 5 illustra la fase di essiccazione per le diapositive del autoradiografia del recettore che vengono poi fissata su cartone come visto nella figura 6, e successivamente sviluppato Tabella. 2 elenca i reagenti utilizzati per la procedura di colorazione thionin per le sezioni di tessuto scorrevole montato descritte in figura 7. unità standard di calibrazione per la quantificazione sono determinati based alla data del test come si vede nella tabella 3. Figura 8 mostra la creazione di una curva standard relativa ¹²⁵ I concentrazione (fmol / g di tessuto) per filmare l'esposizione (densità relativa optometrico). Figura 11 illustra la distinzione tra 'NSP' e 'totale' gruppi, nonché le etichette di tessuto, mentre la Figura 10 descrive l'impostazione della soglia ad un valore vicino allo zero per ottenere un valore medio preciso per l'intera area di scansione (Scan Area-pixel). la Tabella 4 mostra la quantificazione processo di ottenimento di legame specifico basato sulla sottraendo il 'non specifico' dai valori "totale". 'Non specifici' vincolante, che contiene losartan e / o PD123319 è creato dalla quantità di radioligand legata alla non-AT _1, o ₂ recettori. Tutto il radioligand legato a AT ₁ recettori in presenza di PD123319 produce il 'totale' vincolante. F IGURA 11 mostra le aree misurate finali del PVN in totale vs. non specifico adiacente vincolanti per una sezione macchiato thionin per la conferma anatomica del PVN.

Figura 1:. Via metabolica del sistema renina angiotensina (RAS) nel corpo Il fegato rilascia il angiotensinogen zimogeno, che viene scisso dalla renina-rene secreto, formando angiotensina I. L'angiotensina conversione dell'angiotensina (ACE) converte l'Ang I in angiotensina II ( Ang II), il precursore principale di malattie cardiovascolari. Ang II provoca vasocostrizione, e aumenta la pressione sanguigna, la gittata cardiaca, l'appetito di sale, la sete e la ritenzione idrica. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cryosectioning del cervello su vetrini a 20 micron di spessore. A seconda della temperatura del criostato, le sezioni saranno talvolta visualizzare pieghe, crepe, curling, o diventare compattato sulla lama microtomo o portalama. In tali casi sezione viene scartato e una nota è fatto per indicare che un extra di 20 micron separerà questa sezione della sezione precedente. Le sezioni devono essere raccolti su vetrini in direzione verticale al fine di massimizzare la superficie totale necessaria a riempire una diapositiva e quindi raccogliere il maggior numero di sezioni su ogni diapositiva. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:. Campione di disegno sperimentale e protocollo per autoradiografia del recettore Differentizione del 'totale' (-2) e 'non specifico' (-1) è direttamente correlata alla presenza e assenza di antagonista del recettore sottotipo. Protocollo può variare in base al numero di diapositive, e aumenterà con incrementi di 2 per ogni coppia di slitte totali e non specifici. concentrazione radioligand, precedentemente determinato è ottenuto dalla diluizione del titolo in AM5. Questa soluzione viene quindi uniformemente distribuita ai contenitori da incubazione. Conteggi diretti sono prese prima e dopo l'incubazione per stabilire l'esatta concentrazione della radioligand. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5:. Configurazione per stazione di asciugatura in autoradiografia del recettore I tempi di essiccazione varia in base all'efficienza del colpoasciugatrici, nonché la possibilità di cancellare via l'acqua in eccesso dopo gli ultimi risciacqui. I vetrini verrà asciugato una volta la sezione passa dal chiaro al bianco. Se i vetrini non sono completamente asciugati poi il radioligand può diffondere lontano dal recettore produrre un'immagine sfocata che non è specifico per il recettore siti di legame. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6:.. L'esposizione diapositive trattati alla pellicola di raggi X utilizzando una cassetta specializzato è consigliabile scorrere set-up per seguire un modello in cui viene facilitato il confronto di entrambi i gruppi Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Set-up per thionin colorazione. I vetrini vengono caricati in un portavetrini e immersi in soluzioni sequenziali. Timing consente efficace colorazione della sostanza Nissl (reticolo endoplasmatico rugoso) dei neuroni. Un mezzo di montaggio applicazione per le diapositive seguenti disidratazione permette per il fissaggio del vetrino alla diapositiva, conservando le sezioni per l'analisi comparativa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8:. Impostazione standard di calibrazione Ogni film contiene suoi singoli standard di calibrazione, basati sulla pasta cervello e l'ora in cui è stato fatto l'esperimento . Una linea di regressione che descrive i migliori valori di misura viene generata da un programma di sistema di imaging proprietario per le norme pasta cerebrale misurati. Questo converte il valore di densità relativa optometrico (ROD) dagli standard di calibrazione (MST cal, ovale rosso) per unità di radioligand vincolanti, in questo esempio le unità (fmol / g, cerchiata in rosso) sono radioligand fmole vincolati per grammo di bagnato peso del tessuto (fmol / g). La misurazione degli standard pasta cervello è fatto con lo strumento circolare e posizionato al centro del campione mostrato a destra nella pseudocolore utilizzando l'icona di visualizzazione dell'immagine (cerchiato in rosso). Il cerchio di misurare standard di calibrazione non deve coprire l'intero campione, ma piuttosto misurare una anche un'area dello standard. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 9:. Identificare i gruppi per numero di campione, non specifica / totale, e le regioni per le letture del campione Poiché più cervelli, regioni del cervello, e più gruppi sperimentali sono quantificati insieme, è fondamentale distinguere tra tutti i fattori. Il soggetto indica il campione cervello e può anche indicare gruppo; sezione indica se è non-specifica (NSP) o totale, mentre la regione permette l'identificazione di molteplici regioni cerebrali che vengono campionate. La barra degli strumenti del campione (rettangolo rosso) descrive diversi strumenti di campionamento, per esempio, cerchio, quadrato, modello, a mano libera, gomma; che può essere utilizzato per delineare un'area da misurare. I valori ottenuti ROD all'interno dell'area dello strumento di campionamento sono registrate sul foglio di calcolo come unità convertiti di rilegatura, fmol / g (cerchiato in rosso). Inoltre, l'area di scansione totale all'interno dello strumento di campionamento viene registrato nella colonna "Scan zona-pixel" mentre il totale tzona Arget (il numero di pixel che superano il valore di soglia (descritto nella figura 10 leggenda) viene registrato nella colonna "Total Tgt Area-pixel". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Determinazione della soglia per campioni da misurare sulla base degli standard L'area di scansione è unico per ogni film, e dipende standard stabiliti.. Utilizzando lo strumento soglia (cerchiato in rosso) per impostare i valori di soglia per la gamma di densità per l'area di scansione in fmol / g permetterà per le aree misurate (delimitata dalle frecce diagonali) a cadere tra una gamma di 0, fino a un punto in cui la curva di calibrazione inizia a asintoto indica che il film si sta avvicinando un'esposizione massimo, oltre il quale ulteriore ^{125 farò alcun ulteriore aumento della densità della pellicola. Solo i pixel con densità della pellicola maggiore del valore di soglia inferiore sono registrati nella colonna "Total Tgt Area-pixel. Pixel con valori inferiori al valore di soglia viene assegnato un valore il più vicino possibile allo zero per la determinazione dei valori medi dell'intero area di scansione "Scan Area-pixel". clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.}

Figura 11: Immagini rappresentative della autoradiografia del recettore di legame alle sezioni coronali di una femmina di ratto spontaneamente iperteso (SHR) a ~ 1,8 millimetri caudale per Bregma, che espongono il nucleo paraventricolare dell'ipotalamo (PVN) e il nucleo letto del tratto olfattivo accessorio (BAOT ). (A </ strong>) Totale legame di AT ₁ R vincolante (Red- PVN, Giallo-BAOT). (B) vincolante con losartan (AT1R antagonista) e PD123319 (AT2R antagonista) non-specifici. Binding (C) Totale di AT ₁ R vincolante impostando una soglia arbitraria tale da delineare la forma del PVN (riempimento nero) superiore al valore di soglia all'interno dell'area di scansione che è registrato come Total Tgt Area). (D) thionin tinto sezione per la conferma anatomica delle strutture che mostrano alta totale vincolante, e per il confronto con le altre regioni del cervello o di altri gruppi sperimentali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Assay Medium (AM5) componenti chimici del buffer utilizzato nella preparazione dei tessuti..

Tabella 2:. Thionin Macchia Reagenti La macchia thionin è costituito da acqua distillata, 1,0 M di sodio acetato e 1,0 M soluzione acido acetico glaciale, titolata ad un pH di 4,3 prima di aggiungere un 0,5% thionin soluzione.

Tabella 3:. Calcoli quotidiano Decay Rate per gli standard di calibrazione Un foglio di calcolo giornaliera tasso di decadimento per gli standard di calibrazione dovrà essere creato in base alle date in cui è stato eseguito l'esperimento. Questo foglio di calcolo si basa sulla prima tasso ordine costante con un tempo di dimezzamento (t _½) di 60 giorni. N = N ₀ * e ^kt, dove N = concentrazione ¹²⁵ I, al tempo t rispetto alla concentrazione al tempo 0 (N _0), ek = ln2 / t _1/2.

Tabella 4: Analisi quantitativa di paraventricolare nucleo dell'ipotalamo e letto nucleo dell'accessorio olfattiva tratto esporta i dati software di imaging come un foglio di calcolo in fmol / g, area di scansione e area di destinazione totale in pixel.. Il legame 'non specifico' è sottratto da 'totale' vincolante al fine di ottenere la specifica AT ₁ quantitativa vincolante.

Il protocollo descritto identifica la visualizzazione del 'totale' e 'non specifico' legame del radioligando in sezioni adiacenti di sezioni coronali di cervello di roditori precedentemente raccolti e conservati a -80 ° C, e può essere facilmente applicabile a virtualmente ogni tessuto che è anatomicamente risolto sottostrutture che presentano importi differenziali di recettori o siti di legame radioligando. Le procedure descritte all'interno del protocollo sono semplici e l'analisi è fondamentale per interpretare correttamente i risultati. Lo spessore di 20 micron è stato determinato per essere ottimale; se la sezione è troppo spesso il legame non specifico aumenterà, rendendo difficile risolvere il legame del radioligando alla sua destinazione. Se la sezione viene tagliato sottile, diventa difficile da tagliare con successo e salvare sezioni sequenziali senza distorsione. La temperatura di taglio ottimale varia leggermente a causa della natura del tessuto e lo spessore delle sezioni e iDi solito è determinato empiricamente. Una volta che il contatto avviene tra la lama e il tessuto, l'orientamento del campione può essere rivisto e riallineato spostando il campione di tessuto indietro via dalla lama, e riorientare la palla di montaggio. Quando si taglia un cervello dei roditori è fondamentale per garantire il lato destro e sinistro del cervello sono nelle stesse coordinate antero-postero, e che l'asse dorso-ventrale è atlanti cerebrali perpendicolare usati comunemente. set di diapositive sono pre-etichettati al fine di condurre studi su sezioni adiacenti di tessuti. I primi gruppi di 5 scivoli sono etichettati 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5. La prima sezione di taglio va in slitta 1-1 nell'angolo in alto a sinistra (questo è il alto a destra della diapositiva quando è ghiacciato lato verso il basso); la seconda sezione di taglio continua diapositiva 1-2, ecc La quinta sezione di taglio continua diapositiva 1-5. La sezione di taglio sesta continua diapositiva 1-1 a fianco della prima sezione. Dopo la prima serie di diapositive è piena, avviare un'altra serie di 5 scivolatoES, etichettato 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, e 2-5. Questo ciclo è continuato fin nel cervello come necessario. Il "-4" e "-5" diapositive sono conservati come backup o per radiomarcato un recettore diverso.

Il protocollo autoradiografia del recettore dipende radiolegante usato e le caratteristiche dei recettori essere esaminato per determinare le concentrazioni di tamponi, sali e inibitori. Per la misurazione del sottotipo AT1 dei recettori Ang II in questa procedura, una alta affinità Iodio-125 legante marcato, ¹²⁵ I-Sar ¹ Ile ⁸ -Ang II ⁽¹²⁵ I-SI-Ang II); radioattivo da Robert C. Speth, Ph.D. (Peptide Radioiodination Shared Resource, Georgetown University), che è anche disponibile in commercio) viene disciolto in tampone AM5 (Tabella 1); tampone fosfato di sodio con cloruro di sodio, EDTA e bacitracina. AM5 fornisce una buona protezione del radioligand da metallopeptidasi e peptida bacitracina sensibilises fornendo un pH fisiologico e concentrazione di NaCl per ottimizzare caratteristiche di legame. Pre-incubazione in AM5 espone le sezioni di tessuto per peptidasi inibitori per ridurre al minimo la degradazione radiolegante, e anche dissocia endogena Ang II dai recettori Ang II. Losartan e PD123319, AT1R e AT2R antagonisti, rispettivamente, che saturano i loro recettori di destinazione vengono aggiunti a concentrazioni (10 micron) per evitare che il radioligand di legarsi a questi recettori per valutare legame non specifico e limitare legame al recettore AT1 specifica, rispettivamente. La concentrazione desiderata di ¹²⁵ I-SI-Ang II per il saggio è determinato e la diluizione necessaria della soluzione di riserva è determinata da un foglio di calcolo del tasso di decadimento radioisotopi (vedi protocollo Tabella 3). In modo ottimale una concentrazione di radiolegante approssimare la K _D è usato che occupano il 50% dei recettori presenti. Tuttavia, poiché radioleganti possono essere costose inferiore concentrazioni e.g. 10-20% della concentrazione K _D può essere utilizzato. Questo ha un potenziale vantaggio di aumentare il rapporto segnale-rumore riducendo legame non specifico più di legame specifico. Tuttavia, i tempi di esposizione più lunghi sono necessari per sviluppare un'immagine del legame. Come notato sopra (punto 3.4), se l'esposizione ottenuta è sopra o sotto esposte, i vetrini possono essere ri-esposti ad un nuovo film per una più breve e / o più tempo per raggiungere l'esposizione desiderata.

analisi densitometrica immagine può essere fatto da un sistema di imaging proprietario che fornisce una vasta compendio delle applicazioni per autoradiografia e altre applicazioni. standard di calibrazione sono in fmol / g di peso tessuto bagnato (supponendo un peso specifico di uno per il tessuto). Ciascun set standard, insieme a uno sfondo genererà una curva standard. Ci sono diversi algoritmi di curva-montaggio con e senza ponderazione disponibile per generare una curva standard dal relativo d optometricvalori (ROD) ensità per i diversi standard di calibrazione. Selezione della curva che meglio rappresenta i dati avviene empiricamente come subroutine per montaggio di curva non fornisce valori di errore relativi alle diverse curve standard. Al aste fino a ~ 0.6, la curva standard è pseudolineare. Tuttavia, il film comincia a saturare oltre questo punto formando una curva che Asintoti circa 0,8 a 0,9 unità ROD. Se le norme che sono bracketing i campioni sono sopra unità 0,9 ROD, si raccomanda di ri-esporre la pellicola per un periodo di tempo più breve per ottenere valori più affidabili di fmol / g vincolante dei campioni vicini alla gamma pseudolineare dello standard curva. I valori ottenuti in questo estremo della curva standard si tradurrà in piccole differenze in tondino per differenze significativamente più grandi in radioligand vincolanti. Quindi la capacità di rilevare variazioni diminuisce vincolanti come il film si avvicina al suo punto di saturazione.

Per le misure di regioni specifiche,misure raccomandate sono 'Density' in fmol / g, 'area di scansione' in pixel, e 'Total Target Area' in pixel (figura 9). È importante impostare un valore di soglia più vicino possibile allo zero (Figura 10) per variazioni di densità film o l'aspetto arbitraria della curva standard derivato dagli standard di calibrazione possono talvolta dare valori inferiori a zero. Se tali valori sono mediati per tutti i pixel dell'area di scansione deriverebbe un valore artificialmente basso. I criteri utilizzati per identificare le aree con legame può essere molto personale, quindi è preferibile accoppiare strettamente il controllo e cervello sperimentali per quanto possibile per ridurre l'incidenza degli errori soggettivi. Un'altra sfida è quella di decidere quante sezioni per la media per ottenere una lettura finale. Una buona indicazione di sezioni da analizzare può essere determinata seguendo un'Ammessa atlas cervello di ratto, insieme con i vetrini istologici colorati. La dimensione della zona di campionamento può anche essere unproblema. Per compensare, un modello può essere stabilita per correggere eventuali discrepanze di dimensioni. Il trattamento delle sezioni potrebbe anche influenzare una zona della struttura che ha elevato vincolanti e devono essere considerati durante l'analisi. Ciò richiede un uso alternativo dello strumento 'soglia' nel sistema di imaging proprietaria per impostare un intervallo di densità superiore a un valore arbitrario in modo da rappresentare le caratteristiche anatomiche del cervello regione campionata come il nucleo paraventricolare dell'ipotalamo all'interno di uno strumento di campionamento che comprende la regione di interesse (Figura 11, pannello C). È anche possibile includere la misurazione della superficie nella determinazione della quantità di legante. Questo può essere fatto moltiplicando il valore per tempi specifici leganti il ​​numero di pixel che sono stati misurati. I pixel possono essere convertiti in unità metriche per l'imaging di un righello in due piani, o un rettangolo di dimensioni note. Il numero di pixel che corrispondono allala lunghezza o l'area del rettangolo possono essere espressi in unità metriche. Alla risoluzione di 2.400 dpi, ~ 9.000 pixel = 1 mm ² nel nostro sistema.

Sebbene l'uso di ligandi radioattivi non è più una tecnica largamente usata; è uno dei pochi modi per visualizzare la distribuzione fisica dei recettori all'interno del tessuto campioni stessi come funzionale (in grado di legare il suo ligando innata). Inoltre, è possibile quantificare il numero di recettori per consentire la valutazione delle variazioni di espressione del recettore funzionale tra i gruppi di trattamento, tra le diverse regioni del cervello o altre strutture, tra i diversi ceppi di animali, o di animali di età diverse, ecc sono disponibili metodi alternativi per caratterizzare aspetti neuroanatomiche di AT ₁ espressione del recettore, tuttavia, hanno valore limitato. Ibridazione in situ di mRNA per AT ₁ recettori non sempre corrisponde con AT ₁ recettore espressione o la distribuzione nelcervello. Mentre le tecniche immunologiche possono approssimare differenze di espressione del recettore base all'intensità della colorazione di sezioni di tessuto, non è possibile generare una curva standard per la colorazione per consentire una determinazione numerica di espressione del recettore. Receptor autoradiografia fornisce anche un livello di specificità per i recettori (o altri obiettivi che si legano specificamente radioleganti) che non può essere garantita mediante tecniche immunologiche. Nel 2009, una serie di articoli sono stati pubblicati ^37-43 che metteva in discussione la validità di 49 anticorpi che venivano utilizzati per valutare 18 differenti recettori accoppiati a proteine ​​G e un canale transitoria potenziale del recettore (TRP). In sostanza, gli anticorpi etichettati bande identiche su macchine occidentali da wild-type e topi knockout per i recettori in questione. In seguito, diversi gruppi hanno fatto osservazioni simili utilizzando disponibili in commercio AT ₁ e AT ₂ anticorpi anti-recettore ^44-49. L'uso di un bacterial cromosoma artificiale che genera una molecola reporter esempio, proteina fluorescente verde, guidata dal AT ₁ promotore è un mezzo indiretto per determinare la presenza o l'assenza di AT _{1 le} cellule che esprimono i recettori nel topo (ma non ratto) cervelli base alla loro vista un funzionale al ₁ recettore promotore ^50. È possibile contare "cellule positive" nelle regioni del cervello microscopicamente identificate ma non per quantificare variazioni nell'intensità di espressione del recettore ₁ in queste regioni. Quindi in questo momento le tecniche solo convalidati disponibili per misurare direttamente l'espressione del recettore Ang II sono radioligand metodi vincolanti. E, se è necessaria la risoluzione anatomica funzionale AT ₁ proteina recettore a livello microscopico, autoradiografia del recettore è l'unica tecnica disponibile per tale misura diretta.

Autoradiografia del recettore non è senza limitazioni. Il principale Concern è quello di soddisfare i requisiti di utilizzare materiali radioattivi in ​​un ambiente di ricerca. E 'necessario avere un programma di sicurezza di radiazione con rigorose linee guida in atto per garantire la sicurezza di ricercatori che lavorano con materiali radioattivi e la disposizione di sicurezza dei materiali radioattivi. Questo intensifica il costo delle ricerche che utilizzano materiali radioattivi ad un punto che preclude il loro uso in molti ambiti di ricerca. Inoltre, il costo di radioligandi può essere notevole. Così un esperimento autoradiografia del recettore in cui un gran numero di sezioni di tessuto di diapositive montate vengono incubati in contenitori di radioligand può utilizzare centinaia se non migliaia di dollari di radioligand. Un'altra limitazione è che i tessuti devono essere congelati prima del sezionamento su un criostato, conservati per un periodo di tempo, e rapidamente risciacquati e asciugati dopo incubazione con radioligando, ognuno dei quali può compromettere la capacità dei recettori o proteine ​​di interesse per impegnare la radioligand . Per ligandi che hanno una rapida asinoociation cinetiche / dissociazione, potrebbe non essere possibile mantenere il legame del radioligando al recettore durante il tempo necessario per lavare via radioligand non specificatamente legato. Inoltre, con basse quantità di legame lunghi periodi di esposizione della pellicola radioligand - un mese o più - può essere richiesto prima che un immagine misurabile può formare sul film. Un'altra sfida è che l'aggiunta di iodio-125 a un ligando può compromettere la capacità del ligando di legarsi al suo recettore o proteina bersaglio a causa dell'impedimento sterico. L'uso di una molecola più piccola, ad esempio, trizio ⁽³ H) elimina il problema di ingombro sterico, ma trizio ha così bassa energia e bassa attività specifica (relativa allo iodio-125) che è estremamente difficile generare un'immagine un film per più popolazioni recettore. Alla luce di questi problemi, ci sono molte situazioni in cui l'autoradiografia del recettore è in grado di identificare i recettori o altre strutture molecolari di interesse.

Nonostante la sua Limitations, autoradiografia del recettore in grado di identificare strutture specifiche all'interno di un tessuto, ad esempio, le regioni cerebrali alterate in risposta alle variabili sperimentali rispetto ad un normale cervello di controllo. Questa conoscenza può aiutare a determinare il ruolo della AT ₁ R per Ang II o altro recettore o enzimi nella patologia della malattia. Questa conoscenza ha valore implicazioni farmacologiche, in quanto indica le aree di obiettivo per potenziali terapie.

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

This work was supported by NIH Grant HL-113905