Рецептор Авторадиография Протокол о локализованного визуализации ангиотензина II Рецепторы

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Этот протокол описывает связывание рецептора шаблоны для ангиотензина II (Ang II) в головном мозге крысы с использованием радиолиганда, специфичного для рецепторов Ang II для выполнения рецептора авторадиографического отображение.

Тканевые образцы собирают и хранят при -80 ° С. Криостат используется для коронковой секции ткани (мозг) и оттепели монтажа секций на заряженных горками. Срезы ткани слайд монтажа инкубируют в ¹²⁵ I-SI-Ang II к радиоактивной рецепторов Ang II. Прилегающие слайды разделены на две группы: 'неспецифического связывания' (NSP) в присутствии насыщающей концентрации рецепторов не-меченного Ang II, или АТ ₁ рецепторов подтипа Ang II (AT ₁ R) селективный антагонист рецептора АТ II и 'не общего связывания' без AT ₁ антагониста R. Концентрация насыщающего АТ ₂ подтипа рецептора Ang II (АТ ₂ R) антагонист (PD123319, 10 мкМ) также присутствует в incubatiна буфер для ограничения ¹²⁵ I-SI-Ang II связывание с AT ₁ R подтипа. В течение 30 мин предварительной инкубации при ~ 22 ° C, NSP горок подвергаются 10 мкМ PD123319 и лозартана, в то время как 'общего связывания' горок подвергаются 10 мкМ PD123319. Слайды затем инкубируют с ¹²⁵ I-SI-Ang II в присутствии PD123319 для общего уровня связывания », и PD123319 и лозартан для NSP в буфере для анализа, а затем несколько« стирок »в буфере, и воду , чтобы удалить соль и не- специфически связанного радиолиганда. Слайды сушат с использованием выдувного сушилки, затем подвергали авторадиографии пленки с использованием специализированной пленки и кассеты. Фильм разработан и изображения сканируются в компьютер для визуального и количественного денситометрии с использованием собственной системы обработки изображений и электронных таблиц. Дополнительный набор слайдов тионин окрашенных гистологических сравнений.

Преимущество использования авторадиографии рецептора является возможность визуализироватьАнг рецепторов II в месте, в пределах участка тканевого образца, а также анатомически определить область ткани, сравнивая его с соседней гистологического справочном разделе.

Сердечно - сосудистые заболевания по- прежнему является ведущей причиной смерти и инвалидности в Соединенных Штатах, в результате чего более 30% смертельных случаев в США в 2011 году ^1. Самые последние статистические данные из Американской ассоциации сердца показывают , что более чем один человек в трех имеет один или более тип сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые исследования продолжают добиваться успехов в отношении понимания этой болезни, но, как поколения начинают стареть крайне важно продолжать эти усилия. Система ренин-ангиотензин (RAS) , играет центральную роль в регуляции сердечно - сосудистой системы , в первую очередь путем продвижения атеросклероза, воспаления, системную вазоконстрикцию и активацию симпатической нервной системы (рис 1) ^2-8.

РАН является гормональная система, которая активируется, когда юкстагломерулярной клетки почки выделяют ренин в кровоток в ответ на снижение артериального давления, увеличение sympathetic стимуляция или снижение потока натрия с помощью макулы Densa. Ренин усваивает ангиотензиноген (синтезированного в печени) с образованием ангиотензина I (Ang I). Анг я затем метаболизируется ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), в ectoenzyme на просвете стороне клеток эндотелия сосудов, в первую очередь в легких и почках, с образованием ангиотензина II (анг II), главный эффекторный пептид РАН. Анг II способен активировать два подтипа рецепторов; рецептор типа 1 (AT ₁ R) и рецептор типа 2 (AT ₂ R), и которые регулируют сердечно - сосудистой системы, поддержания жидкости и электролитов гомеостаз и в настоящее время считаются влияют на когнитивные функции и нейродегенеративные заболевания процессов ^8,9. Местный, специфичная для головного мозга РАН сообщается самостоятельно синтезировать Ang II. В головном мозге, белок - предшественник ангиотензин синтезируется в астроглию ¹⁰ обращенных к Ang I с помощью ренин-подобный фермент ^3, возможно , проренина , связанный с рецептором проренина^11, а затем превращают в Ang II ангиотензин-превращающего фермента , который в большом количестве экспрессируется на внеклеточной поверхности нейронов в головном мозге ^12. Это intrabrain генерируется Ang II является агонистом для мозга АТ ₁ и АТ ₂ рецепторов, которые изолированы от передающейся через кровь Ang II.

В то время как AT ₁ R играет важную физиологическую роль, она лучше известна своими патофизиологические эффекты по всему телу, в первую очередь влияет на сердечно - сосудистую систему и почки (рисунок 2). Когда Ang II связывается с AT ₁ R, он вызывает вазоконстрикцию; повышение устойчивости к кровотока и повышение кровяного давления. Он также стимулирует синтез и секрецию альдостерона и вазопрессина, что приводит к увеличению задержки натрия и воды. Эти эффекты могут также вызвать ишемического повреждения головного мозга и когнитивных нарушений и связана с болезнью Паркинсона, болезнь Альцгеймера, и diabeTES, а также будучи недавно идентифицированы влиять на обучение и память ^13-15. Существует петля обратной связи в РАН в том , что AT ₁ R на юкстагломерулярных клеток в почках ингибирует секрецию ренина. Интересно отметить , что AT ₂ R , как правило против регулирует действие AT ₁ R, вызывая вазодилатацию, невритов, регенерацию аксонов, анти-пролиферацию и cerebroprotection среди многих других ^16-20. AT ₂ R также была определена в качестве мишени для анти-гипертензии и в последнее время , противораковых препаратов ^21. Определение локализации и плотности рецепторов Ang II в пределах различных тканей и как они подвергаются воздействию различных методов лечения и болезненных состояний с использованием количественного денситометрическую авторадиографии рецептора поможет раскрыть роль РАН играет в конкретных заболеваний.

Рецептор радиоавтография был использован на протяжении более 30 лет в качестве эффективного метода для индикации присутствия ангиотензина II рецепторы и другие компоненты РАН в головном мозге и других тканях крысы, мыши, морской свинки, собаки и человека при различных экспериментальных условиях ^22-34. Важность определения местоположения рецепторов Ang II в мозге является то , что можно применить функциональную нейроанатомии к действиям Ang II в головном мозге, например, присутствие AT ₁ R в паравентрикулярной ядре гипоталамуса (PVN) предлагает функцию Ang II в головном мозге, чтобы стимулировать вазопрессин, окситоцин или рилизинг гормон (CRH) релиз, или активацию симпатической нервной системы. Таким образом, препараты , которые блокируют AT ₁ R может уменьшить некоторые из этих PVN-опосредованных эффектов , связанных с за деятельностью мозга РАН. Работа в прогрессе предполагает , что применение антагонистов AT ₁ R может уменьшить посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) -индуцированное высвобождение КРГ и смягчить симптомы ПТСР (Hurt и др., Который был представлен для публикации). PVN, subfornicalорган (SFO), и миндалина известны для регуляции гомеостаза, аппетит / жажда, сон, память, эмоциональные реакции, и являются целевыми направлениями этого демонстрационного исследования. Эти регионы были исследованы путем сбора Коронарные срезы головного мозга на предметные стекла микроскопа, и обрабатывать участки с специфическими ингибиторами наряду со специфическим радиолиганда для рецепторов Ang II. В этом исследовании все материалы и реагенты и способы их поставщиков перечислены, Йод-125 был использован для радиоактивной антагонист Ang II рецептора, саркозина ^1, изолейцин ⁸ Ang II (SI Ang II), который затем очищали , как моно ¹²⁵ I -SI АТ II с использованием методов ВЭЖХ , как описано ранее ^35. Использование этой высокой удельной активности радиоактивного лиганда позволяет визуализировать зоны с низкой, средней и высокой плотности рецепторов после воздействия на радиоактивно меченных участков с рентгеновской пленкой. Путем калибровки пленку со стандартами мозга пасты, содержащей известное количество йода-125, конкретные суммыангиотензина II связывания рецепторов в области может быть определена количественно. В экспериментальных исследованиях, рецептор Ang II связывание в мозге испытуемых можно сравнить с, что в мозге контрольных субъектов. Это может указать, является ли изменены действия Ang II в ответ на генетическое состояние, фенотипические аномалии, болезненного состояния или медикаментозного лечения. Это знание может быть применен к разработке методов лечения для лечения заболеваний, связанных с нарушением регуляции РАН. Альтернативные методы , которые идентифицируют рецептор сайты связывания, но с уменьшенной анатомической разрешением, являются обязательными для анализов , которые используют мембранные препараты тканей , полученных из гомогенатов тканей, которые инкубируемых с меченым лигандом в диапазоне концентраций с целью оценки связывания радиолиганда сродством как константа диссоциации (K _D ) и максимальная связывающая способность (в _макс) интересующей ткани.

Протокол, описанный здесь, может быть разбита на 5 основных сотрудничестваmponents: Готовимся Tissue Разделы для рецептора авторадиографии; Рецептор Авторадиография; Фильм экспозиции и развития; гистологии; и Денситометрический анализ изображений.

Все процедуры на животных , проведенные для данного исследования были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Нова Юго - Восточного университета по в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, 8 - ^е издание (Национальная академии Press, Вашингтон, округ Колумбия, 2011 ).

1. Подготовка ткани Секции Receptor Авторадиография

1. После жертвоприношения, урожай свежей ткани мозга, и завернуть в алюминиевую фольгу и поместить в -20 ° C морозильнике как можно скорее. Для поддержания правильной формы, поместить мозги в пресс-форме мозга, которая имитирует внутреннюю часть черепа, завернуть в алюминиевую фольгу и поместите его в - 20 ° C морозильнике. Через 30 минут, место ткани в герметичную сумку для хранения с морозильной камерой и перейти к -80 ° C морозильнике для длительного хранения.
   1. Получить свежие образца замороженной ткани, представляющие интерес от -80 ° C с морозильной камерой, и трансфер в криостат установлен в размере не менее -10 ° С и не более -18 ° С, чтобы избежать размораживания.
   2. Поместите образец на ткань крепление с гликолем и смолы на основе вложения среды, только вложение малую часть образца в среду. Для мозга, мозг установлен вертикально, чтобы позволить секционирования в корональной плоскости.
2. Поместите ткань крепление на микротомом внутри криостата и прочно затянуть на месте. Убедитесь, что левая и правая сторона мозга в тех же координатах передне-задне, и что спинно-вентральной оси, перпендикулярной к наиболее часто используемым атласы мозга.
3. Начинают резки на желаемой толщины (20 мкм рекомендуется) и оттаивают крепление секций на предметные стекла микроскопа в вертикальном направлении, чтобы иметь большую площадь поверхности пространства в слайде. Собирают разделы на слайдах в последовательных наборах из пяти, т.е. первый набор слайдов помечены 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 и 1-5 (рисунок 3).
4. После заполнения набор слайдов с секциями, позволяют слайды высохнуть на воздухе на срок до 1 часа, затем поместите SLIдез в пластиковой коробке слайд в самоуплотняющейся морозильника мешок для хранения, и хранить при температуре -20 ° C.

2. Рецептор Авторадиография

ВНИМАНИЕ: Радиоактивность. Используйте защитную одежду, чтобы справиться с радиоактивностью. Утилизация это зависит от учреждения, и должны следовать правилам, чтобы должным образом распадаться (период полураспада 60 дней) или быть подобран в сертифицированной компании.

1. Удалите "-1" и "-2" слайды , представляющие интерес от -20 ° C морозильника и крепление в захваты слайд (рисунок 5). Установите на "-1" слайды вместе для «неспецифического» лечения, и "-2" слайды для "полного" лечения. «Неспецифические» банки будут содержать 10 мкМ конечные концентрации PD123319 АТ ₂ антагониста R и лозартана АТ ₁ антагонист R, в буфере для анализа среды (АМ5) (таблица 1), "полное" связывающие банки будут содержать только 10 мкМ PD123319 в AM5.
2. Обратить слайдручки, чтобы поместить слайды в Коплин баночек Прединкубационная заполненными 35-40 мл AM5 и соответствующих ингибиторов в течение 30 мин при комнатной температуре. Начало последующие наборы в их предварительной инкубации ванны с интервалом 4 мин.
3. Немедленно передать слайды из предварительной инкубации раствора к инкубационной слайд почтовые программы, содержащей 10 мл AM5, плюс заданную концентрацию ¹²⁵ I-SI-Ang II (рассчитанный на рисунке 4) с соответствующими ингибиторами, в течение 60-90 мин при комнатной температура. Если имеется достаточно радиолиганда, 10 слайдов могут быть размещены (спина к спине) в модифицированных захватами слайдов и инкубировали с ¹²⁵ I-SI-Ang II в Коплин банки.
4. Место скользит назад в слайд захватами (при необходимости), блот, и полоскание осторожно закрученной в течение 1-2 сек в 400 мл дистиллированной воды в двух отдельных контейнерах.
5. Передача слайдов последовательно в четырех банках Коплин , содержащих 35-40 мл AM5 ровно 1 мин каждый (как показано на рисунке 4 </ Сильный>).
6. После последней 1 мин полоскание, нежно вихревой секции на 1-2 сек в четырех изменениях льда холодной дистиллированной воды.
7. Укладкой слайды с прохладным воздухом (Внимание: горячий воздух volatizes радиоактивное соединение) с помощью четырех фен установить с разными углами в течение 4 мин (рисунок 5), пока все секции не высохнут, а затем поместить на бумажное полотенце.
8. Гора сползает с тканями лицевой стороной вверх на картон для прикладывания к рентгеновской пленке с помощью двухсторонней ленты.
9. Крепление по крайней мере , один, ¹²⁵ калибровки Йод стандартный слайд на каждый картон (рисунок 6).
   Примечание: Калибровочные стандарты состоят из пасты мозга тщательно смешивают с ¹²⁵ Йод связан с соединением , содержащим фенольного кольца, уплотнен путем центрифугирования в 1 мл туберкулиновые шприцы, которые являются криостат разрезали на той же толщины, что и срезах мозга и оттаивать монтажа на микроскоп слайды. В качестве альтернативы, ¹²⁵ калибровочных стандартов I впластик смолы срезы толщиной 20 мкм, могут быть получены на коммерческой основе. Пластиковая смола в этих стандартах частично экранирует пленку от излучения таким образом, что ткань эквивалентность ~ 40% следует учитывать при калибровке.

3. Фильм экспозиции и развития

1. Перейдите к фотолаборатории с накладным задней рентгеновской кассеты и авторадиографии пленки. Откройте кассету и поместите картон с горками внутри (рисунок 6).
   1. Включите огни и включите безопасного освещения. Осторожно откройте коробку рентгеновскую пленку, удалить одну пленку и поместите пленку блестящей стороной вверх (с зубчатым краем на нижнем правом углу) поверх слайдов в кассете. Осторожно закройте кассету, и поверните фиксирующие стержни , чтобы запечатать свет (рисунок 6). Expose слайды в течение нескольких дней до нескольких недель при температуре -20 ° C.
2. В фотолаборатории, откройте кассету и приступить к разработке фильма ргосESS.
   1. Поместите слайды в лотки последовательно; Разработчик в течение 2 мин, воду, содержащую 5% лед ной уксусной кислоты в течение 30 сек, и закрепитель в течение 5 мин. Пленки помещенная в лоток с проточной водой в течение 20 мин, затем помещают в Photoflo не более чем на 10 секунд и подвесили.
      Примечание: Время экспозиции определяется опытным путем и может включать в себя несколько пленок с разными экспозициями: достаточно долго, чтобы получить измеримые сигналы из областей с низким связыванием, но не так долго, чтобы насытить фильм местах с высоким уровнем связывания. После того, как приемлемые риски получаются, а затем перейти к следующему шагу.

4. Гистология

1. Подготовьте тионин пятна и окрашивания реагентов (таблица 2, рисунок 7).
   1. Поместите "-3" слайдов в стойку слайдов, и передача в последовательном порядке, начиная с деионизированной водой в течение 1 мин, а затем тионин пятно раствор в течение 10 мин с последующими тремя погружена в Deionнализованных воды, и одна стирка 30 сек в деионизированной воде.
   2. После воды, поместите слайд стойку в промывок этанол следующим образом; 50%, 70%, и 90% в течение 30 сек, с последующими двумя промывками этанола при 100% в течение 1 мин каждый раз. И, наконец, поместите слайд стойки на ксилола в течение 3 мин, а затем перенести через к второму раствору ксилоле в течение 5 мин.
2. Удалить один слайд за один раз из последней ванны ксилол, и покрывают верхний край ползуна с основанием смолы в монтажном среде органического растворителя, и помещают 24 мм х 60 мм покровное на слайд. Разрешить слайды в достаточной степени высохнуть в течение ~ 48 часов, а затем сканировать в компьютер на 2400 точек на дюйм в оттенках серого.

5. Денситометрический анализ изображений

1. Поместите пленки блестящей стороной вниз, с зубчатым краем на левом нижнем углу экрана и сканирования с использованием фирменной сканер, способный передавать информацию о плотности пленки без каких-либо искажений в системе формирования изображения компьютера.
2. Откройте фирменные SYS визуализацииTEM и использовать калибровочные стержни для установления калибровочных стандартов для будущего денситометрическом анализа изображений на пленке ( на рисунках 9 - 12).
3. Мера областей интереса либо создания шаблона или эмпирически с изложением областей, представляющих интерес. Данные собранные и разделены на основе пленки, либо контроль или дикого типа (раздел), и область. Убедитесь в том , чтобы включить плотность (фмоль / г), область сканирования, а также общую целевую область при измерениях (рисунок 9).
   1. Настройка сканирования полосы площадь, гарантируя , что область интереса находится между параметрами подсветки (рисунок 10).
   2. Экспорт данных в электронную таблицу (таблица 4). Умножьте Времена плотности общей целевой области, а затем разделить на площадь сканирования, чтобы получить значение для связывания этой конкретной области. После того, как это делается для всех значений, измеренных, субстратная установленный неспецифический от общего с получением специфического связывания рнегодуют. Сред также может выполняться для этих значений.

Обзор метаболического пути ренин-ангиотензин системы показана на рисунке 1 и прямой акцент на подтипы рецепторов ангиотензина II (AT ₁ R и AT ₂ R) описывается на рисунке 2. Рисунок 3 показывает передачу корональной мозга разделы на предметные стекла микроскопа, которые затем проходят через процедуру рецептора авторадиографии с использованием заданной концентрации ¹²⁵ I-Siang II , как показано на рисунке 4. Рисунок 5 иллюстрирует стадию сушки для слайдов в авторадиографии рецепторов , которые затем наносимой на картоне как показано на рисунке 6, а впоследствии развиты. в таблице 2 перечислены реагенты , используемые для тионин процедуры окрашивания для срезов тканей слайд - монтажа , описанных на рисунке 7. Калибровка стандартные единицы измерения для количественной оценки определяются баСЭД на дату анализа , как показано в таблице 3. На рисунке 8 показано создание стандартной кривой , относящейся ¹²⁵ I концентрации (фмоль / г ткани) заснять экспозиции (относительная оптометрическое плотности). Рисунок 11 иллюстрирует различие между "NSP" и «всего» группы, а также этикетки ткани, а на рисунке 10 описывает установку порога до почти нулевого значения , чтобы получить точное среднее значение для всей области сканирования (Scan Area пикселей). Таблица 4 показывает количественное процесс получения специфически связывающийся на основе вычитания 'неспецифический' из '' общего значения. "Неспецифический" связывания , который содержит лозартан и / или PD123319 создается количеством радиолиганда , связанного с не-AT _1, или AT ₂ рецепторов. Все радиолиганда , связанного с АТ ₁ рецепторов в присутствии PD123319 дает общее '' связывания. F igure 11 отображает конечные измеренных площадей ПВЯ в общей сложности против неспецифического связывания , смежному с тионин окрашенном секции для анатомического подтверждения ПВН.

Рисунок 1:. Метаболический путь системы ренин - ангиотензин (RAS) в организме Печень выпускает Зимоген ангиотензиноген, который расщепляется овально-секретируется ренина, образуя ангиотензин I. ангиотензин - превращающего фермента (АПФ) преобразует Ang I в ангиотензин II ( анг II), главным предшественником сердечно-сосудистых заболеваний. Анг II вызывает вазоконстрикцию и повышает кровяное давление, сердечный выброс, солевой аппетит, жажда, и задержку воды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Cryosectioning головного мозга на предметные стекла микроскопа при толщине 20 мкм. В зависимости от температуры криостата, секции будут иногда показывать сгибы, трещины, скручивание, или становятся более плотными на микротома лезвия или держателя ножа. В таких случаях секция отбрасывается и делается отметка, чтобы указать, что дополнительные 20 мкм отделит этот раздел из предыдущего раздела. Секции должны быть собраны на слайдах в вертикальном направлении, чтобы максимизировать общую площадь , необходимую для заполнения слайда и , следовательно , собрать наибольшее количество разделов на каждом слайде. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 4: Пример экспериментального проектирования и протокола для рецепторного Авторадиография Differentiданию 'Всего' (-2) и "неспецифический" (-1) непосредственно связано с наличием и отсутствием антагонистов рецепторов подтипа. Протокол может меняться в зависимости от количества слайдов, и будет увеличиваться с шагом 2 для каждой пары полных и неспецифических слайдов. концентрация радиолиганда, предварительно определяется получают путем разбавления запаса в AM5. Затем этот раствор равномерно распределяется по инкубационных контейнеров. Прямые отсчеты до и после инкубации , чтобы установить точную концентрацию радиолиганда. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 5: Конфигурация для сушки станции в авторадиографии рецептора Время высыхания будет варьироваться в зависимости от эффективности ударасушилки, а также возможность промокните лишнюю воду после последнего полоскания. Слайды будут сушиться после того, как раздел получается от прозрачного до белого. Если слайды не полностью высушенный то радиолиганда может диффундировать от рецептора , производящей нечеткое изображение, которое не является специфическим для рецептора сайтов связывания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6:.. Разоблачение обработанные слайды рентгеновской пленки с использованием специализированной кассеты слайдов настройки рекомендуется следовать шаблону , где облегчила сравнение обеих групп Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Настройка для тионин окрашиванию. Слайды загружаются в держатель слайдов и погружена в последовательные решения. Выбор времени позволяет эффективно окрашивания вещества Нисслю (шероховатой эндоплазматической сети) нейронов. Установочный среда приложения к слайдам следующих обезвоживания позволяет для крепления покровного к слайду, сохраняя при этом секции для сравнительного анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 8: Установка стандарта калибровки Каждый фильм содержит свои индивидуальные калибровочные стандарты, основанные на пасте мозга и время , в которое было сделано эксперимент , Линии регрессии, описывающая лучшие значения подходят порождается собственной программой системы визуализации для измеренных стандартов мозга пасты. Это преобразует относительную оптометрическое плотность (пруток) значение из калибровочных стандартов (кал БППП, в красном овале) в единицах связывания радиолиганда, в этом примере единицы (фмоль / г, обведены красным) являются fmole Радиолигандом связаны на грамм влажного вес ткани (фмоль / г). Измерение стандартов пасты мозга осуществляется с помощью кругового инструмента и помещен в середине образца, показанный справа в псевдоцвете с помощью значка просмотра изображения (обведено красным). Круг для измерения стандартной калибровки не должны покрывать всю выборку, а измерить даже площадь стандарта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

/53866fig9.jpg "/>
Рис . 9: Определение групп по количеству проб, неспецифическое / общее, так и в регионах для чтения образцов Поскольку несколько мозгов, области мозга, а также несколько экспериментальных групп количественно вместе, крайне важно проводить различие между всеми факторами. Субъект указывает, что образец мозга, а также может указывать на группу; раздел указывает на то, является ли это неспецифическая (NSP) или полное, в то время как область позволяет идентифицировать несколько областей мозга, которые в настоящее время выборки. В баре образец инструмента (красный прямоугольник) описывает различные инструменты выборки, например, круг, квадрат, шаблон, Freehand, ластика; который может быть использован, чтобы очертить область, которую необходимо измерить. Значения ROD, полученные в области инструмента выборки записываются на электронную таблицу, как преобразованные единиц связывания, фмоль / г (обведено красным). Кроме того, общая площадь сканирования в пробоотборник записывается в колонке "Сканировать пикселей" в то время как общая тArget площадь (количество пикселей , которые превышают пороговое значение ( как описано на рисунке 10 легенде) записывается в колонке "Общая площадь Tgt пикселей". Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 10: Определение порога для образцов для измерения на основе стандартов Область сканирования является уникальным для каждого фильма, и зависит от стандартов , установленных.. С помощью инструмента порога (обведено красным), чтобы установить пороговые значения для диапазона плотности для области сканирования в фмоль / г позволит для областей измеренных (очерчены диагональными стрелками) падать между диапазоном от 0, до точки, где кривая калибровки начинает асимптоты, указывающего, что пленка приближается к максимальной экспозиции, за которой дополнительный ^{125 I не вызовет дальнейшее увеличение плотности пленки. Только пикселей с плотностью пленки больше нижнего порогового значения записываются в столбце Total Tgt Area-пиксельного ". Пикселей со значениями меньше порогового значения присваивается значение как можно ближе к нулю, насколько это возможно для определения средних значений целых область сканирования "Scan Area-пиксель". Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.}

Рисунок 11: Типичные изображения авторадиографии связывания с рецептором к корональных участков женского спонтанно гипертензивных крыс (SHR) при ~ 1,8 мм каудально брегмы, отображающие паравентрикулярной ядро гипоталамуса (PVN) и ядра слоем вспомогательного обонятельного тракта (BAOT ). (A </ сильный>) Общее связывание AT ₁ R связывания (красно- PVN, желто- BAOT). (B) неспецифическое связывание с лозартаном (антагонист AT1R) и PD123319 (антагонист AT2R). (С) Общее связывание AT ₁ R связывание с установкой такой произвольный порог, чтобы очертить форму PVN (черной заливкой) , превышающей пороговое значение в пределах зоны сканирования , которая записана в Total TGT Area). (D) тионин витражное секция для анатомического подтверждения структур , показывающих высокий общий уровень связывания, а также для сравнения с другими областями мозга или других экспериментальных групп. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: среды для анализа (AM5) Химические компоненты буфера , используемого в процессе подготовки ткани..

Таблица 2:. Тионин Stain РЕАГЕНТЫ тионин пятно состоит из дистиллированной воды, 1,0 М ацетата натрия и 1,0 М раствора ледяная уксусная кислота, титровали до рН 4,3 , перед добавлением 0,5% -ного раствора тионин.

Таблица 3:. Ежедневная Decay Rate Расчеты для калибровочных стандартов Ежедневная электронная таблица скорость затухания для калибровочных стандартов необходимо будет создан на основе даты , на котором был выполнен эксперимент. Эта таблица основана на скорости первого порядка с постоянным периодом полураспада _(T?) На 60 дней. N = N ₀ * е ^кт, где N = концентрация ¹²⁵ I, в момент времени Т относительно концентрации в момент времени 0 (N _0), а к = ln2 / т _1/2.

Таблица 4: Количественный анализ паравентрикулярной ядра гипоталамуса и слоем ядра аксессуар обонятельный тракт данных экспорта программного обеспечения обработки изображений в виде таблицы в фмоль / г, область сканирования и общей целевой области в пикселях.. "Неспецифический" связывание вычитается из '' общего связывания с целью получения конкретного AT ₁ количественного связывания.

Описанный протокол идентифицирует визуализацию 'Total' и 'неспецифический' связывания радиолиганда в смежных участках корональных секций грызуна мозга ранее заготовленной и хранили при -80 ° С, и может быть легко применимы к практически в каждой ткани, имеет анатомически решен подструктуры, отображающие дифференциальные количества рецепторов или связывания радиолиганда сайтов. Процедуры, описанные в протоколе просты и анализ имеет решающее значение для правильной интерпретации результатов. Толщина 20 мкм была определена оптимальным; если раздел слишком толстый неспецифическое связывание будет возрастать, что делает его трудно разрешить связывание радиолиганда с его мишенью. Если секция режется тоньше, то становится трудно успешно вырезать и сохранить последовательные секции без искажений. Оптимальная температура резания будет немного меняться в зависимости от характера ткани и толщины секций и яS обычно определяется эмпирически. После того, как контакт между лезвием и ткани, ориентация образца может быть пересмотрено, и упорядочена путем перемещения образца ткани назад от лезвия, и переориентировать монтажный мяч. При резке грызуна мозг чрезвычайно важно обеспечить левую и правую сторону мозга, находятся в тех же координатах передне-задне, и что спинно-вентральной оси, перпендикулярной к наиболее часто используемым атласы мозга. Наборы слайде предварительно помечены для того, чтобы провести исследования на соседних участках тканей. Первые наборы 5 слайдов помечены 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 и 1-5. Первое сокращение раздела идет на слайде 1-1 в верхнем левом углу (это верхний правый угол слайда, когда он заморожен стороной вниз); второй разрез секции идет на слайде 1-2 и т.д. Разрез секция пятого идет на слайде 1-5. Разрез раздел шестой идет на слайде 1-1 слева от первой секции. После того, как первый набор слайдов заполнен, начните другой набор 5 скользилиэс, помеченный 2-1, 2-2, 2-3, 2-4 и 2-5. Этот цикл продолжается еще в мозг по мере необходимости. "-4" И "-5" Слайды сохраняются в качестве резервной копии или радиоактивной другой рецептор.

Протокол рецептора авторадиография зависит от используемого радиолиганда и характеристики рецепторов обследуемого для определения концентраций буферов, солей и ингибиторов. Для измерения AT1 подтип рецепторов Ang II в этой процедуре, с высоким сродством Йод-125 меченый лиганд, ¹²⁵ I-Сар ¹ Иле ⁸ -Ang II ⁽¹²⁵ I-SI-Ang II); метили Robert C. Спета, Ph.D. (Пептид радиоиодирования совместно используемый ресурс, Джорджтаунский университет), который также доступен в продаже) растворяют в буфере AM5 (таблица 1); натрий-фосфатный буферный раствор с хлоридом натрия, ЭДТА и бацитрацин. AM5 обеспечивает хорошую защиту от радиоактивного лиганда metallopeptidases и бацитрацина чувствительных peptidaSES обеспечение физиологического рН и концентрации NaCl с целью оптимизации характеристик связывания. Прединкубационная в AM5 выставляет срезы ткани к действию пептидазы ингибиторов, чтобы минимизировать деградацию радиолиганда, а также диссоциирует эндогенный Ang II от рецепторов Ang II. антагонисты Лозартан и PD123319, AT1R и AT2R, соответственно, которые насыщают их целевые рецепторы добавляют при концентрациях (10 мкМ), чтобы предотвратить радиоактивный лиганд от связывания с этими рецепторами для оценки неспецифического связывания и ограничивают специфическое связывание с рецептором АТ1, соответственно. Требуемая концентрация ¹²⁵ I-SI-Ang II для анализа определяется , и требуемое разбавление исходного раствора определяется из таблицы скорости затухания радиоизотопов (см протокола таблицу 3). Оптимально концентрация радиолиганда приближая K _D используется , который будет занимать 50% рецепторов , присутствующих. Однако, поскольку радиолиганда может быть дорогостоящим ниже концентрации е.g. 10-20% от концентрации K _D может быть использован. Это имеет потенциальное преимущество увеличения отношения сигнала к шуму за счет снижения неспецифического связывания более специфического связывания. Тем не менее, более длительное время воздействия должны разработать образ связывания. Как уже отмечалось выше (раздел 3.4), если экспозиция получается больше или меньше подвержены, слайды могут быть повторно подвергается воздействию нового фильма в течение более короткого и / или более длительное время для достижения желаемого воздействия.

Денситометрический анализ изображения может быть сделано с помощью собственной системы формирования изображения, которая обеспечивает обширный компендиум приложений для авторадиографии, а также других приложений. калибровочные стандарты в фмоль / г веса влажной ткани (предполагается, что удельный вес одного для ткани). Каждый стандартный набор, вместе с фоном будет генерировать стандартную кривую. Есть несколько алгоритмов построения кривой с и без взвешивания доступны для получения стандартной кривой от относительной оптометрической гensity значения (пруток) для различных стандартов калибровки. Выбор кривой, которая наилучшим образом представляет данные делается эмпирически в качестве подпрограммы для построения кривой не обеспечивает относительные значения ошибки для различных стандартных кривых. На стержнях до ~ 0,6, стандартная кривая псевдолинейного. Тем не менее, фильм начинает насыщаться за пределы этой точки, образующей кривой, которая асимптоты около 0,8 до 0,9 единиц стержню. Если стандарты, которые Брекетинг образцы выше 0,9 ROD единиц, рекомендуется повторно выставить пленку в течение более короткого периода времени, чтобы получить более точные значения фмоль / г связывания образцов, расположенных ближе к диапазону псевдолинейного стандарта кривая. Значения, полученные в этой крайности стандартной кривой приведет к небольшим различиям в удилище для значительно больших различий в связывания радиолиганда. Следовательно, способность обнаруживать изменения в связывании уменьшается, как фильм приближается к точке насыщения.

Для измерений конкретных регионов,Рекомендуемые меры "Плотность" в фмоль / г, 'Сканировать' в пикселях, и 'Total Target Area' в пикселях (рисунок 9). Важно , чтобы установить пороговое значение , как можно ближе к нулю , как возможный (рисунок 10) , так как изменения плотности пленки или произвольным аспектом стандартной кривой , полученной из калибровочных стандартов может иногда дают значения меньше нуля. Если такие значения усредняются для всех пикселей в области сканирования было бы вывести искусственно низкое значение. Критерии, используемые для определения областей с привязкой может быть очень субъективным, так что лучше всего работать в тесном паре контрольных и экспериментальных мозги как можно больше, чтобы уменьшить частоту возникновения субъективных ошибок. Еще одна задача состоит в том, чтобы решить, сколько секций в среднем, чтобы получить окончательное чтение. Хорошим показателем сечений для анализа можно определить, следуя общепринятым атласом головного мозга крысы, наряду с окрашенными гистологии горками. Размер зоны отбора проб также может бытьпроблема. Для компенсации, шаблон может быть установлен для исправления несоответствия размера. Обработка секций может также влиять на область структуры, которая имеет высокую связывающую и должны быть рассмотрены в ходе анализа. Для этого требуется альтернативное использование инструмента 'пороговых' в собственной системе формирования изображения для установки диапазона плотностью, превышающей произвольное значение, с тем, чтобы представлять анатомические характеристики области мозга в выборку, таких как паравентрикулярной ядро ​​гипоталамуса в качестве инструмента для отбора проб которая охватывает область интереса (рисунок 11, панель C). Кроме того, можно включить измерения площади в определении количества связующего. Это может быть сделано путем умножения значения для специфического связывания раза количество пикселей, которые были измерены. Пиксели могут быть преобразованы в метрические единицы с помощью получения изображения линейкой в ​​двух плоскостях, или прямоугольник известных размеров. Количество пикселей, которые соответствуютдлина или площадь прямоугольника, а затем могут быть выражены в метрических единицах. В 2400 точек на дюйм, ~ 9000 пикселей = 1 мм ² в нашей системе.

Хотя использование радиоактивных лигандов больше не является широко используемой технологией; он является одним из немногих способов визуализировать физическое распределение рецепторов в ткани образцов сами в качестве функциональных (способных связывать его врожденную лиганд). Кроме того, он может количественно оценить число рецепторов, позволяющих оценить изменения в функциональной экспрессии рецепторов между группами лечения, между различными областями мозга или другими структурами, между различными штаммами животных или животных разного возраста и т.д. Альтернативные методы доступны для характеристики нейроанатомические аспекты экспрессии рецепторов АТ _1, тем не менее, они имеют ограниченную ценность. В месте гибридизации мРНК для АТ ₁ рецепторов не всегда соответствует AT ₁ рецептора экспрессии или распределения вголовной мозг. В то время как иммунологические методы могут аппроксимировать различия в экспрессии рецепторов, основанной на интенсивности окрашивания срезов тканей, не представляется возможным, чтобы создать стандартную кривую для окрашивания, чтобы учесть численного определения экспрессии рецептора. Рецептор авторадиография также обеспечивает уровень специфичности в отношении рецепторов (или другие объекты, которые специфически связывают радиолигандов), который не может быть гарантировано с помощью иммунологических методов. В 2009 году в серии статей были опубликованы ^37-43 , которые поставили под сомнение 49 антител, которые использовались для оценки 18 различных G-белком рецепторы и канал переходных рецепторный потенциал (ГТО). По существу, антител, меченных одинаковые полосы на Вестерн-блоттинга от мышей дикого типа и нокаутных мышей для рецепторов о которых идет речь. Впоследствии несколько групп сделали аналогичные замечания с использованием коммерчески доступного AT ₁ и AT ₂ рецептора антитела ^44-49. Использование bacteriал искусственную хромосому , которая генерирует молекулу - репортер, например, зеленый флуоресцентный белок, движимый AT ₁ промотором является косвенным способом определения наличия или отсутствия АТ ₁ рецепторных клеток , экспрессирующих у мышей (но не крыса) мозги на основании наличия у них функциональный промотор AT ₁ рецептора ^50. Можно рассчитывать "позитивные клетки" в микроскопически определенных областях мозга, но не для количественной оценки изменений в интенсивности экспрессии рецептора AT ₁ в этих регионах. Таким образом, в это время только проверенные методы, которые доступны для непосредственного измерения экспрессии рецептора Ang II являются связывания радиолиганда методы. И, если анатомическое разрешение функционален ₁ белка рецептора необходим на микроскопическом уровне, авторадиография рецептор является единственной методикой для такого прямого измерения.

Рецептор радиоавтография не без ограничений. Главный concerп является то, что они отвечают требованиям для использования радиоактивных материалов в условиях исследования. Необходимо иметь программу радиационной безопасности со строгими руководящими принципами в месте, чтобы обеспечить безопасность исследователей, работающих с радиоактивными материалами и безопасной утилизации радиоактивных материалов. Это перерастает стоимость исследований с использованием радиоактивных материалов в точку, что исключает их использование во многих исследовательских установках. Кроме того, стоимость радиолиганда может быть существенным. Таким образом, рецептор авторадиография эксперимент, в котором большое количество срезов ткани выдвижных смонтированный инкубируют в контейнерах радиолиганда могут использовать сотни, если не тысячи долларов радиолиганда. Другим ограничением является то, что ткани должны быть заморожены до секционирования на криостат, сохраняется в течение определенного периода времени, и быстро промывают и высушивают, после инкубации с меченым лигандом, все из которых могут ухудшать способность рецепторов или белок, представляющий интерес для связывания радиолиганда , Для получения лигандов, которые имеют быструю задницуociation кинетика / диссоциации, оно не может быть возможным, чтобы сохранить связывание радиолиганда с рецептором в течение времени, необходимого смыть неспецифически св занного радиолиганда. Кроме того, с низким содержанием радиолиганда связывания длительные периоды экспозиции фильма - один месяц или больше - может потребоваться до того, как измеримое изображение может образоваться на пленке. Еще одна задача состоит в том, что добавление йода-125 с лигандом, может ухудшать способность лиганда связываться с его рецептором или целевого белка из-за стерических затруднений. Использование меньшего молекулы, например, тритий ^(3H) устраняет проблему стерических затруднений, но тритий имеет такую ​​низкую энергию и с низкой удельной активностью ( по отношению к йоду-125) , что чрезвычайно трудно сформировать пленочное изображение для наиболее популяции рецепторов. В свете этих проблем, существует множество ситуаций, в которых авторадиография рецептор не в состоянии идентифицировать рецепторы или другие молекулярные структуры, представляющие интерес.

Несмотря на Limitations, радиоавтография рецептора может идентифицировать специфические структуры в ткани, например, мозговые области изменены в ответ на экспериментальных переменных по сравнению с нормальной контрольной мозга. Это знание может помочь определить роль AT ₁ R для Ang II или другого рецептора или ферментов при патологии болезни. Это знание имеет ценные фармакологические последствия, поскольку это указывает на области для целевого показателя для потенциальных методов лечения.

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

This work was supported by NIH Grant HL-113905